李海龍 王勇 翟宇 程小麗

摘要：目的 觀察加味當(dāng)歸貝母苦參丸對MFC胃癌荷瘤小鼠瘤組織Toll樣受體（TLR2、TLR4、TLR6）、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）和髓分化因子88（MyD88）表達(dá)的影響，探討其相關(guān)的作用機(jī)制。方法 建立MFC胃癌荷瘤小鼠模型進(jìn)行體內(nèi)抗腫瘤試驗。將篩選合格的48只MFC胃癌荷瘤小鼠隨機(jī)分為模型組，陽性對照組（順鉑組），加味當(dāng)歸貝母苦參丸高劑量組（當(dāng)高組）、低劑量組（當(dāng)?shù)徒M）和順鉑聯(lián)合加味當(dāng)歸貝母苦參丸高劑量組（順高組）、低劑量組（順低組），各給藥組給予相應(yīng)藥物灌胃，連續(xù)14 d，觀察腫瘤生長情況及小鼠一般情況、腫瘤大體標(biāo)本及HE染色后組織形態(tài)；RT-qPCR和免疫組化分別檢測腫瘤組織TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6和MyD88的表達(dá)。結(jié)果 模型組腫瘤細(xì)胞豐富，細(xì)胞大小不一、體積大、核大深染、異型明顯，可見小灶性壞死，間質(zhì)血管豐富；各給藥組腫瘤細(xì)胞數(shù)量減少、排列疏松、細(xì)胞體積明顯縮小、核固縮，細(xì)胞壞死明顯增加，間質(zhì)血管數(shù)量減少，膠原纖維增多，其中以順低組、順高組較為明顯。與模型組比較，各給藥組TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6和MyD88 mRNA和蛋白表達(dá)均降低，順低組、順高組TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6和MyD88蛋白著色變淺，呈弱陽性表達(dá)，較順鉑組、當(dāng)高組、當(dāng)?shù)徒M蛋白改變更加明顯。結(jié)論 加味當(dāng)歸貝母苦參丸可能通過下調(diào)荷瘤小鼠腫瘤組織TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6和MyD88 mRNA和蛋白的表達(dá)，發(fā)揮抗腫瘤作用。

關(guān)鍵詞：加味當(dāng)歸貝母苦參丸；胃癌；Toll樣受體通路；小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.08.013

中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）08-0054-06

Effects of Modified Danggui Beimu Kushen Pills on Toll-like Receptor Pathway Markers on MFC Gastric Cancer Mice LI Hai-long1，2， WANG Yong1，2， ZHAI Yu1，2， CHENG Xiao-li3， AN Xia4， LI Hong-liang2， KANG Wan-rong2， WU Hong-yan2 （1. School of Clinical Medicine， Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China； 2. Key Laboratory of Traditional Chinese Herbs and Prescription Innovation and Transformation of Gansu Province， Key Laboratory of TCM Pharmacology and Toxicology in Gansu Province， Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China； 3. Teaching and Research Center， Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China； 4. Affiliated Hospital of Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730020， China）

Abstract： Objective To study the effects of modified Danggui Beimu Kushen Pills on the expressions of TLR2， TLR4， TLR6， TRAF6 and MyD88 in tumor tissues on MFC gastric cancer bearing mice； To discuss relevant mechanism of action. Methods MFC gastric cancer bearing mice were employed to perform anti-tumor experiment in vivo in this study. A total of eligible 48 mice were randomly divided into model group， DDP positive control group， modified Danggui Beimu Kushen Pills high-dose and low-dose groups， modified Danggui Beimu Kushen Pills high-dose and low-dose combined with DDP groups. The treatment was conducted once a day， and lasted for 14 continuous days. After the last administration of gavage orally treatment， all mice were anaesthetized and killed by

基金項目：甘肅省科技廳自然科學(xué)基金B(yǎng)類計劃項目（1310RJZA099）；甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點實驗室開放基金項目（ZDSYS-KJ-2015-010）

通訊作者：吳紅彥，E-mail：wu.hy@126.com

cervical dislocation method to obtain tumor tissue completely for further HE staining measure and detection of TLR2， TLR4， TLR6， TRAF6 and MyD88 in tumor tissue with the method of RT-qPCR and immunohistochemistry. Meanwhile， the tumor growth was observed and the general conditions of mice were recorded. Results The model group was rich in tumor cells； the sizes of cells were different； the volume was large； the nucleus was deeply stained and the heterotypic shape was obvious， and the small focal necrosis was seen. The number of tumor cells in each administration group was reduced； the arrangement was loose； the cell volume was significantly reduced， and the nuclear pyknosis was reduced. Cell necrosis significantly increased； the number of interstitial blood vessels decreased； collagen fibers increased， especially in modified Danggui Beimu Kushen Pills high-dose and low-dose combined with DDP groups. Compared with the model group， the expressions of TLR2， TLR4， TLR6， TRAF6 and MyD88 mRNA and protein decreased in each administration group. TLR2， TLR4， TLR6， TRAF6 and MyD88 were lighter and weakly positive expressed in modified Danggui Beimu Kushen Pillshigh-dose and low-dose combined with DDP groups， the protein changes were more obvious Compared with DDP positive control group， modified Danggui Beimu Kushen Pills high-dose and low-dose groups. Conclusion Modified Danggui Beimu Kushen Pills can down-regulate TLR2， TLR4， TLR6， TRAF6 and MyD88 expression of tumor tissue in MFC gastric cancer bearing mice at both mRNA and protein levels to play anti-tumor pharmacology action.

Key words： modified Danggui Beimu Kushen Pills； gastric cancer； Toll-like receptor pathway； mice

胃癌是全球高發(fā)的惡性腫瘤之一，據(jù)國家癌癥中心2015年統(tǒng)計，胃癌在我國惡性腫瘤死亡排名第3位[1]。體內(nèi)外實驗顯示，當(dāng)歸貝母苦參丸干預(yù)胃癌和肝癌的藥效明確[2-3]。當(dāng)歸貝母苦參丸出自《金匱要略》，原用于治療妊娠小便困難。本實驗以當(dāng)歸貝母苦參丸為基礎(chǔ)方，增加黃芪、山慈菇、全蝎組成當(dāng)歸貝母苦參丸加味方。該方具有活血化瘀、化痰散結(jié)、解毒攻癌，兼顧調(diào)節(jié)機(jī)體補(bǔ)虛扶正、化生氣血的功效。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Toll樣受體（TLRs）與炎癥相關(guān)腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4]。TLRs是機(jī)體天然免疫系統(tǒng)中模式識別受體，可識別不同病原體相關(guān)分子模式（PAMPs），從而啟動相關(guān)下游TLR4胞內(nèi)信號通路，包括髓分化因子（MyD88）依賴和非依賴途徑[5]。TLR4激活MyD88后，活化的MyD88聚集并結(jié)合IRAK1和IRAK2，然后作用于腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6），進(jìn)一步激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和核因子-κB（NF-κB）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[6]。本研究采用RT-qPCR和免疫組化檢測，探討加味當(dāng)歸貝母苦參丸的抑瘤作用及對荷瘤鼠MFC胃癌組織TLR2、TLR4、TLR6和MyD88表達(dá)的影響，為其臨床防治胃癌提供有效的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級BALB/c-nu小鼠60只，雌、雄各半，體質(zhì)量（20±2）g，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。動物許可證號SCXK（京）2012-0001。飼養(yǎng)于室溫20～25 ℃、濕度45%～55%環(huán)境，分籠飼養(yǎng)，自由攝食飲水。

1.2 細(xì)胞、藥物及制備

MFC前胃癌細(xì)胞，中科院上海細(xì)胞庫。加味當(dāng)歸貝母苦參丸（黃芪、當(dāng)歸、浙貝母、苦參、山慈菇、全蝎），飲片購自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，加10倍量水浸泡1 h，加熱煮沸40 min，濾出煎液，藥渣再加6倍量水加熱煮沸40 min，合并2次煎液，70 ℃水浴蒸發(fā)濃縮至含1.0 g原藥材/mL；順鉑注射液，江蘇毫森藥業(yè)股份有限公司，20 mg/支，批號20160522，將30 mg順鉑粉針加生理鹽水，稀釋為0.25 mg/mL，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑和儀器

胎牛血清（杭州四季青公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒DR036A（上海寶生物工程有限公司），擴(kuò)增試劑盒（PREMEGO公司），二抗（中杉金橋公司），TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6和MyD88一抗（IMMONOWAY公司）。生物安全柜、DMEM培養(yǎng)基（健順生物公司），CO2培養(yǎng)箱（力康公司），倒置顯微鏡（日本OLYMPUS），ABI7500熒光PCR儀（美國ABI公司）。

2 實驗方法

2.1 造模

將凍存細(xì)胞株取出，快速置于37 ℃水浴解凍，并轉(zhuǎn)移細(xì)胞液于離心管中，加入適量培養(yǎng)液（高糖DMEM+10%胎牛血清），1000 r/min離心3 min，棄上清液，加入適量培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液接種入培養(yǎng)瓶，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞完全貼壁后，PBS清洗細(xì)胞3遍，更換培養(yǎng)液。1～2 d換液1次。每日倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞生長狀態(tài)良好鋪滿瓶底時，25%胰酶常規(guī)方法消化、傳代，待細(xì)胞長至對數(shù)生長期時傳代，棄去培養(yǎng)基，將細(xì)胞制成懸液，濃度調(diào)整為15×106/mL，小鼠腋下接種胃癌MFC細(xì)胞，每只0.2 mL。

2.2 分組和給藥

造模后觀察腫瘤體積直徑達(dá)0.5 cm時，剔除體積過大或過小小鼠，48只篩選合格小鼠隨機(jī)分為模型組、陽性對照組（順鉑組）、加味當(dāng)歸貝母苦參丸高劑量（當(dāng)高組）、加味當(dāng)歸貝母苦參丸低劑量組（當(dāng)?shù)徒M）和順鉑聯(lián)合加味當(dāng)歸貝母苦參丸高劑量組（順高組）、順鉑聯(lián)合加味當(dāng)歸貝母苦參丸低劑量組（順低組）。第2日開始，模型組小鼠予蒸餾水0.2 mL灌胃及腹腔注射生理鹽水0.1 mL；當(dāng)高組、當(dāng)?shù)徒M予中藥0.2 mL灌胃，每日1次；順鉑組予蒸餾水0.2 mL灌胃及腹腔注射順鉑（25 mg/kg）0.1 mL，隔5 d給藥1次，共3次；順高組、順低組予等量中藥灌胃及腹腔注射順鉑（25 mg/kg）0.1 mL，共14 d。第15日18：00時禁食，不禁水。第16日處死小鼠取材備檢。

2.3 腫瘤大體標(biāo)本及組織形態(tài)觀察

對荷瘤小鼠腫瘤組織進(jìn)行剝離并進(jìn)行肉眼觀察，對腫瘤體積、顏色和質(zhì)地進(jìn)行記錄，與此同時，需觀察確定腫瘤組織假膜完整程度，是否存在出血狀況等。隨后4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，染色。對腫瘤組織和細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行鏡檢，實體瘤療效以抑瘤率表示。抑瘤率（%）=（模型組平均瘤重-實驗組平均瘤重）÷模型組平均瘤重×100%。

2.4 熒光定量PCR檢測TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6和MyD88 mRNA表達(dá)

稱取30 mg腫瘤組織置于無RNA酶的EP管中勻漿，再加1 mL提取液靜置5 min，常規(guī)低溫抽提總RNA后溶解并檢測其濃度，用Takara 036A反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用ABI7500熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95 ℃、5 min預(yù)變性，95 ℃、10 s，60 ℃、20 s，40個循環(huán)，并分析融解曲線，確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，相對表達(dá)量采用2-ΔΔCT法計算，實驗重復(fù)3次，基因引物序列見表1。

2.5 免疫組化檢測TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6和MyD88蛋白表達(dá)

采用ABC法。切片常規(guī)脫蠟水化，3%去離子水滅活內(nèi)源性酶10 min，微波修復(fù)抗原5 min，間隔重復(fù)1次；然后依次滴加TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6和MyD88一抗及生物素化山羊抗兔二抗；滴加SABC，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度脫水透明后封片，顯微鏡下觀察。以胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)記錄各自TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6和MyD88積分光密度和平均灰度，作為蛋白表達(dá)的量化指標(biāo)，每組各取材5個樣本。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料以—x±s表示，組間比較用方差分析，方差齊用LSD法，方差不齊用Dunnett'T3法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 加味當(dāng)歸貝母苦參丸對MFC胃癌荷瘤小鼠瘤組織抑制率的影響

順鉑組小鼠體質(zhì)量逐漸下降，精神差，進(jìn)食減少，反應(yīng)遲鈍，當(dāng)高組、順高組狀態(tài)較好，瘤質(zhì)量較模型組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見表2。

4.2 腫瘤大體標(biāo)本及組織形態(tài)觀察結(jié)果

模型組腫瘤細(xì)胞豐富，細(xì)胞大小不一、體積大、核大深染、異型明顯，可見小灶性壞死，間質(zhì)血管豐富；當(dāng)?shù)徒M腫瘤細(xì)胞豐富，細(xì)胞大小不一、體積相對縮小、核大深染，部分細(xì)胞核固縮，可見小灶性壞死、間質(zhì)血管豐富，腫瘤細(xì)胞周圍膠原纖維增多；當(dāng)?shù)徒M、當(dāng)高組、順鉑組、順低組、順高組腫瘤細(xì)胞數(shù)減少、排列疏松，細(xì)胞體積縮小、核固縮，細(xì)胞壞死增加，間質(zhì)血管數(shù)量減少，膠原纖維增多。結(jié)果見圖1。

4.3 加味當(dāng)歸貝母苦參丸對荷瘤小鼠MFC胃癌瘤組織TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6和MyD88 mRNA表達(dá)的影響

與模型組比較，各給藥組TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6和MyD88 mRNA表達(dá)均有不同程度變化，當(dāng)高組、順低組和順高組變化較為明顯。結(jié)果見表3。

4.4 加味當(dāng)歸貝母苦參丸對荷瘤小鼠MFC胃癌瘤組織TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6和MyD88蛋白表達(dá)的影響

胞漿或胞膜出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性著色。與模型組比較，各給藥組TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6和MyD88蛋白著色較深，表明為強(qiáng)陽性或陽性表達(dá)，而模型組則呈現(xiàn)弱陽性或陰性表達(dá)。結(jié)果見表4、表5和圖2～圖6。

5 討論

炎癥可通過TLRs誘導(dǎo)內(nèi)源性介質(zhì)，促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展。TLRs高表達(dá)與腫瘤的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，如陳戰(zhàn)等[7]研究顯示，胃癌組織中TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)高于癌旁組織，其表達(dá)與胃癌分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性，孫運良等[8]研究顯示，TLR4可能參與了胃癌的發(fā)生和發(fā)展，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者TLR4陽性率顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，TNM分期為Ⅲ+Ⅳ期者TLR4蛋白表達(dá)率明顯高于Ⅰ+Ⅱ期者，Spearman等級相關(guān)分析表明，TLR4蛋白表達(dá)與MVD呈顯著正相關(guān)。Pimentel-Nunes P等[9]研究表明，TLR2與幽門螺桿菌感染及胃癌發(fā)生均相關(guān)。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，TLR2、TLR4、TLR6 mRNA在不同分化程度胃癌細(xì)胞中的表達(dá)相對于正常胃黏膜上皮GES-1細(xì)胞明顯上調(diào)；不同濃度脂多糖干預(yù)胃癌SGC7901、BGC-823、MGC-803細(xì)胞后，TLR2、TLR4、TLR6表達(dá)也明顯上調(diào)[10]。

劉鵬軍等[11]研究顯示，胃癌組織TRAF6陽性表達(dá)高于癌旁正常組織，其陽性表達(dá)與胃癌組織分化程度、TNM分期有關(guān)，可能參與胃癌的浸潤及轉(zhuǎn)移。Han F等[12]研究認(rèn)為，TRAF6是預(yù)后不良的胃癌患者的預(yù)測。張金明等[13]研究顯示，MyD88在食管癌組織中的陽性表達(dá)率為92.0%，明顯高于癌旁組織中17.3%的陽性表達(dá)率；MyD88的陽性表達(dá)與臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。唐樂輝等[14]研究顯示，與癌旁正常組織相比，MyD88在乳腺癌組織中表達(dá)明顯增高；MyD88的陽性表達(dá)與腫瘤的TNM分期、腫瘤大小、淋巴侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。厲鷗等[15]研究發(fā)現(xiàn)，MyD88蛋白在肝癌組織中的陽性表達(dá)高于癌旁組織，MyD88和STAT3表達(dá)與性別、分化程度、有無HBV感染和肝硬化有關(guān)。秦艷等[16]研究發(fā)現(xiàn)，MyD88蛋白表達(dá)與結(jié)直腸腺瘤及結(jié)直腸癌中腺瘤異型性相關(guān)。

Maeda Y等[17]研究表明，在炎癥相關(guān)胃癌小鼠模型中，阻斷MyD88的表達(dá)可以降低巨噬細(xì)胞中TLR2與COX-2/PGE2的表達(dá)，MyD88與COX-2/PGE2共同參與了腫瘤炎癥微環(huán)境的產(chǎn)生，并通過誘導(dǎo)TLR2的表達(dá)促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Obonyo M等[18]研究表明，幽門螺桿菌可以激活巨噬細(xì)胞中TLR2和TLR4的表達(dá)，TLR2激活MyD88通路對幽門螺桿菌誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-6和IL-1β起到至關(guān)重要的作用。Kennedy C L等[19]報道，在gp130基因消減（F/F）小鼠胃癌模型中，TLR2可以促進(jìn)腫瘤的增殖，而沉默MyD88基因可以抑制腫瘤的發(fā)生，其作用與促進(jìn)胃癌上皮細(xì)胞凋亡和抑制其增殖有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，加味當(dāng)歸貝母苦參丸方可使腫瘤組織瘤體縮小，抑瘤作用明顯，并且與化療藥物聯(lián)用后抗腫瘤作用更加明顯。免疫組化研究顯示，當(dāng)歸貝母苦參丸加味方可抑制腫瘤組織TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6和MyD88 mRNA和蛋白的表達(dá)，并且與化療藥物聯(lián)用后TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6和MyD88 mRNA和蛋白下調(diào)表達(dá)更明顯。另外，TLR2、TLR4、TLR6/MyD88通路及下游TRAF6炎證相關(guān)通路參與了胃癌發(fā)病機(jī)制，加味當(dāng)歸貝母苦參丸可調(diào)控該通路發(fā)揮抗腫瘤作用。值得注意的是，中藥治療引起的靶標(biāo)分子轉(zhuǎn)錄層次的改變與蛋白層次的改變并不同步，蛋白層次的表達(dá)改變更加顯著一些，這說明中藥治療效應(yīng)除經(jīng)過基因轉(zhuǎn)錄外，表觀遺傳改變也可能起作用，這有待進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，當(dāng)歸貝母苦參丸加味方對荷瘤小鼠MFC胃癌的抗瘤作用與下調(diào)TLRs通路分子TLR2、TLR4、TLR6、RAF6和MyD88 mRNA和蛋白的表達(dá)有關(guān)。

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（收稿日期：2016-11-06）

（修回日期：2016-12-25；編輯：華強(qiáng)）