李澎 王建農(nóng) 許勇剛 付建華 劉建勛

摘要：目的 觀察山楂葉原花青素對腫瘤壞死因子-α（TNF-α）誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）和E-選擇素過表達(dá)的影響，探討其抗炎作用的機制。方法 體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。MTT法檢測細(xì)胞活力，流式細(xì)胞術(shù)檢測ICAM-1和E-選擇素的表達(dá)。結(jié)果 山楂葉原花青素濃度≤200 mg/L時，對細(xì)胞活力無明顯影響；模型組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1和E-選擇素表達(dá)較正常組顯著升高，10、20、30、40、50 mg/L山楂葉原花青素濃度依賴地抑制ICAM-1和E-選擇素的表達(dá)升高，其中40、50 mg/L組較模型組差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論 山楂葉原花青素能夠抑制TNF-α誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1和E-選擇素的過表達(dá)，這可能與其抗炎作用相關(guān)。

關(guān)鍵詞：山楂葉；原花青素；血管內(nèi)皮細(xì)胞；腫瘤壞死因子-α；細(xì)胞間黏附分子-1；E-選擇素

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.08.012

中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）08-0050-04

Effects of Hawthorn Leaf Procyanidins on Over Expressions of ICAM-1 and E-selectin in Human Umbilical Vein Endothelial Cells Induced by TNF-α LI Peng， WANG Jian-nong， XU Yong-gang， FU Jian-hua， LIU Jian-xun （Xiyuan Hospital， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100091， China）

Abstract： Objective To observe the effects of hawthorn leaf procyanidins （HLP） on over expressions of ICAM-1 and E-selectin in human umbilical vein endothelial cells （HUVEC） induced by TNF-α，and clarify the mechanism of HLPs anti-inflammation effect. Methods HUVEC were cultured in vitro. MTT assay was used to detect cell viabilities. The expressions of ICAM-1 and E-selectin in HUVEC were detected by flowcytometry. Results Up to 200 mg/L， HLP showed no significant decrease in cell viabilities； the expression levels of ICAM-1 and E-selectin in the model group significantly increased， compared with that in the normal group； 10， 20， 30， 40， 50 mg/L HLP inhibited the expression elevations of ICAM-1 and E-selectin in concentration-dependent manner； and there were statistical significances in 40， 50 mg/L HLP groups， compared with the model group. Conclusion HLP can inhibit the over expressions of ICAM-1 and E-selectin of vascular endothelial cells induced by TNF-α， which possibly underlies HLPs anti-inflammation effect.

Key words： hawthorn leaf； procyanidins； vascular endothelial cell； TNF-α； ICAM-1； E-selectin

過度的炎癥反應(yīng)是動脈粥樣硬化、缺血性心臟病、中風(fēng)、感染性休克等疾病發(fā)展、惡化乃至造成死亡的關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)。因此，抑制炎癥發(fā)生、阻斷炎癥反應(yīng)過程，對于這些重大難治疾病的治療具有重要意義。山楂葉具有活血化瘀、降脂消濁的功效。原花青素是山楂葉的重要活性成分，約占山楂葉黃酮類物質(zhì)

基金項目：國家自然科學(xué)基金（81274196）；北京市自然科學(xué)基金（7092089）

通訊作者：付建華，E-mail：jianhuaffcn@263.net

總量的20%。有研究顯示，原花青素可抑制炎癥細(xì)胞的激活、降低炎癥因子的釋放，還可以直接對抗氧自由基、氮過氧化物等炎癥毒素對細(xì)胞的殺傷[1-2]。我們前期研究顯示，富含原花青素的山楂葉提取物能抑制缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，降低白細(xì)胞黏附分子的表達(dá)[3]。但是，山楂葉原花青素對炎性反應(yīng)中血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子表達(dá)的影響尚缺乏研究。本實驗以腫瘤壞死因子-α（TNF-α）刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，觀察山楂葉原花青素對內(nèi)皮細(xì)胞2種經(jīng)典黏附分子，即細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）和E-選擇素過表達(dá)的影響，探討其抗炎作用的機制。

1 實驗材料

1.1 臍帶

剖腹產(chǎn)健康嬰兒無菌臍帶，購自北京市海淀區(qū)婦幼保健院。

1.2 藥物及制備

山楂葉原花青素，本院實驗中心參照文獻(xiàn)[4]方法制備。6倍體積60%乙醇加熱山楂葉1 h，過濾，取濾液，回收至無醇味。經(jīng)AB8樹脂吸附，水洗至清。70%乙醇洗脫樹脂至無色，收集洗出液，回收至無醇味。加氯仿萃取2次，去除葉綠素，聚酰胺吸附，烘干。

1.3 試劑

原花青素標(biāo)準(zhǔn)品（純度>95%，沃瑪特公司，4852-22-6），Ⅰ型膠原酶（Gibco公司，17100-017），胰酶（Amesco公司，0458），內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基（M200-500）及其添加物（S003-10），Cascade公司。重組人TNF-α（CytoLab公司，300-01A），藻紅蛋白（PE）標(biāo)記小鼠單克隆抗人ICAM-1熒光抗體（BD公司，347977），異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記小鼠單克隆抗人E-選擇素?zé)晒饪贵w（R&D;公司，BBA21），PE標(biāo)記小鼠IgG2a（BD公司，349053），F(xiàn)ITC標(biāo)記小鼠IgG1（R&D;公司，IC002F）。

1.4 儀器

Synergy 4多功能酶標(biāo)儀，Biotek公司；Navios流式細(xì)胞檢測儀，Beckman Coulter公司。

2 實驗方法

2.1 山楂葉原花青素純度測定

采用香草醛法，參照文獻(xiàn)[5]方法進(jìn)行。

2.2 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定

將內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)添加物按1∶50的比例加入內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基，并加入青霉素和鏈霉素（終濃度分別為100 U/L和100 μg/L），配制成完全內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基。取嬰兒臍帶，長約20 cm。PBS洗凈血跡，從臍靜脈上端插入剪去針尖的12號針頭，以止血鉗固定。通過針頭向臍靜脈內(nèi)注入PBS，沖洗3遍，洗凈殘血。以另一止血鉗夾閉臍靜脈下端，向臍靜脈內(nèi)注入以DMEM培養(yǎng)基配制的0.1%Ⅰ型膠原酶，取出針頭，夾閉臍靜脈上端。37 ℃消化15 min。收集臍靜脈內(nèi)的消化液，PBS沖洗2～3遍，將流出液體與消化液合并，1500 r/min離心10 min，取沉淀。加入完全內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基，每條臍帶所得細(xì)胞約加5 mL。將細(xì)胞吹打均勻，加入培養(yǎng)瓶內(nèi)，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長至80%融合時，進(jìn)行傳代。PBS沖洗3遍，0.25%胰酶37 ℃消化5 min，收集細(xì)胞，1∶3傳代。實驗使用第3代細(xì)胞。免疫熒光檢測血小板Ⅷ因子表達(dá)。

2.3 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活力檢測

細(xì)胞完全融合生長后，棄去培養(yǎng)基，PBS洗3遍。加入含有藥物的完全內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。藥物以DMSO溶解，按1∶1000比例加入培養(yǎng)基內(nèi)。正常組給予含0.1 mL/L DMSO的培養(yǎng)基。24 h后棄去培養(yǎng)基，PBS洗3遍，培養(yǎng)板內(nèi)加入1 g/L PBS配制的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；棄去MTT液，培養(yǎng)板內(nèi)加入DMSO，室溫放置15 min，于波長490 nm處測定吸光度（OD）。

2.4 造模和給藥

待細(xì)胞長滿培養(yǎng)皿后，棄去培養(yǎng)基，PBS沖洗3遍。加入含有藥物的完全內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)1 h。藥物以DMSO溶解，按1∶1000比例加入培養(yǎng)基內(nèi)。正常組和模型組給予含1 mL/L DMSO的培養(yǎng)基。之后，模型組和給藥組按1∶1000比例向培養(yǎng)基內(nèi)加入PBS配制的重組人TNF-α（終濃度10 μg/L），正常組給予等量PBS。繼續(xù)培養(yǎng)4 h。

2.5 細(xì)胞間黏附分子-1和E-選擇素檢測

棄去培養(yǎng)基，PBS洗3遍，0.01%胰酶-0.02%EDTA消化10 min。胎牛血清終止消化，收集細(xì)胞，PBS洗3次。4 ℃、1500 r/min離心10 min，棄去上清液，加入10 μL PBS，吹打均勻，平均分作2份。一份加入5 μL抗ICAM-1抗體和5 μL抗E-選擇素抗體，另一份加入5 μL PE標(biāo)記小鼠IgG2a和10 μL FITC標(biāo)記小鼠IgG1，作為同型對照。4 ℃、避光孵育30 min。4 ℃、1500 r/min離心10 min，棄去上清液，PBS洗1次。收集細(xì)胞，每份細(xì)胞加入25 μL多聚甲醛固定15 min，加入250 μL PBS，4 ℃避光保存，24 h內(nèi)測定。流式細(xì)胞術(shù)測定PE和FITC熒光強度，以同型對照調(diào)定檢測范圍。各樣本熒光強度=測定管熒光強度-同型對照管熒光強度。每次實驗每組只作1個樣本，以對模型的表達(dá)抑制率（1-給藥組樣本熒光強度÷同次實驗?zāi)Ｐ蜆颖緹晒鈴姸龋┖饬克幮А?/p>

3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示，組間比較用方差分析或Kolmogorov-Smirnov Test檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 山楂葉原花青素的純度測定

0.006 25～0.1 g/L濃度范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度與OD值呈良好的線性相關(guān)?；貧w方程為原花青素濃度（g/L）=3.306 3×OD值-0.140 6，r2=0.998 3；山楂葉原花青素樣品的測定點分布在標(biāo)準(zhǔn)品曲線的附近，表明其純度與標(biāo)準(zhǔn)品相近或稍高。見圖1。

注：黑色點為原花青素標(biāo)準(zhǔn)品，紅色點為山楂葉原花青素

圖1 山楂葉原花青素與原花青素標(biāo)準(zhǔn)品純度比較

4.2 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定結(jié)果

培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞成梭形、卵圓形或多角形，融合生長時呈青石子鋪路狀，見圖2。抗血小板Ⅷ因子免疫熒光染色均為陽性，陽性表達(dá)部位在胞漿，呈綠色；細(xì)胞核以DAPI染色呈藍(lán)色，見圖3。

4.3 山楂葉原花青素對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響

與正常組比較，山楂葉原花青素25、50、100、200 mg/L組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活力無明顯差異，見表1。

4.4 山楂葉原花青素對腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞間黏附分子-1和E-選擇素過表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組ICAM-1、E-選擇素?zé)晒鈴姸让黠@升高（P<0.01）；與模型組比較，山楂葉原花青素各濃度均可抑制ICAM-1、E-選擇素的表達(dá)升高，其中40、50 mg/L原花青素差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.01），見圖4、表2。

5 討論

炎癥是一種極其重要的病理過程。它是有血管生物體對損傷因素做出的一種非特異性的反應(yīng)，其主要表現(xiàn)為實質(zhì)器官細(xì)胞的變性和死亡、血液成分和血細(xì)胞的滲出及炎性、組織間質(zhì)細(xì)胞的增生。一方面，炎癥反應(yīng)有助于清除感染病原體以及損傷、死亡的細(xì)胞，對機體具有有利的影響；但是，過于強烈的炎癥反應(yīng)會波及那些原本正常的組織，使其出現(xiàn)嚴(yán)重的水腫、缺血缺氧和代謝障礙，并大量殺傷那些原本未出現(xiàn)損傷的細(xì)胞，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的附加傷害[6]。

白細(xì)胞等炎癥細(xì)胞黏附于血管內(nèi)皮是炎癥反應(yīng)中最為關(guān)鍵的一環(huán)，它是炎癥誘發(fā)一系列嚴(yán)重?fù)p傷的必要前提。白細(xì)胞黏附會阻塞微血管，阻礙乃至終斷血流供應(yīng)，還會影響血液回流，造成組織水腫；黏附的白細(xì)胞滲入組織深處，釋放氧自由基、毒性細(xì)胞因子、水解酶等，直接導(dǎo)致細(xì)胞的變性與死亡及組織基質(zhì)的崩解。白細(xì)胞黏附于血管內(nèi)皮細(xì)胞依賴于它們各自表面的黏附分子，這些黏附分子通過受體配基樣作用相互結(jié)合，介導(dǎo)白細(xì)胞的黏附。

ICAM-1和E-選擇素是血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)2個最重要的黏附分子。前者屬于免疫球蛋白超家族，通過與白細(xì)胞上整合素分子（包括CD11、CD18等）相作用，使白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生牢固的結(jié)合。而后者屬于選擇素家族，與白細(xì)胞的E-選擇素配基相作用，介導(dǎo)黏附的早期過程，如白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的接觸及白細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞上的滾動等。它們的表達(dá)主要受到炎性細(xì)胞因子的調(diào)控，TNF-α、白細(xì)胞介素-1等均具有很強的誘生作用。

山楂葉的主要活性成分是黃酮和原花青素。黃酮含量較高，約占提取物總量的80%，余下部分為原花青素。WS?1442為德國開發(fā)的一種山楂葉制劑，在當(dāng)今臨床上得到廣泛的應(yīng)用。對其抗心肌缺血作用的研究表明，山楂葉提取物的藥理作用主要依賴于原花青素而非含量更高的黃酮，增加提取物中原花青素的含量可以顯著改進(jìn)療效[7]。

本研究結(jié)果顯示，在10～50 mg/L濃度范圍內(nèi)，山楂葉原花青素能劑量依賴地抑制TNF-α誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1和E-選擇素的過表達(dá)，且抑制作用對藥物濃度有一定的依賴性，并在40、50 mg/L達(dá)到高峰。這一藥物有效濃度范圍與量效關(guān)系，與我們對山楂葉原花青素抗心肌細(xì)胞缺氧損傷的研究結(jié)果是一致的，這也提示40～50 mg/L可能就是山楂葉原花青素干預(yù)不同疾病的共同最佳范圍[8]。結(jié)合山楂葉原花青素對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的毒性實驗結(jié)果，濃度高至200 mg/L的山楂葉原花青素也未顯示出明顯的細(xì)胞毒性，其有效作用的濃度范圍是安全的。

至于山楂葉原花青素是如何抑制炎癥介質(zhì)誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1過表達(dá)的，我們推測可能與其抗氧化的性質(zhì)有關(guān)。有研究表明，包括上調(diào)ICAM-1在內(nèi)的絕大多數(shù)TNF-α的生物學(xué)效應(yīng)，均是氧自由基依賴的[9]。其具體機制還需進(jìn)一步實驗驗證。

綜上所述，本研究結(jié)果提示，山楂葉原花青素能抑制炎癥反應(yīng)中血管內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1的表達(dá)上調(diào)，這可能是其抗炎機制之一。

參考文獻(xiàn)：

[1] TERRA X， PALOZZA P， FERNANDEZLARREA J， et al. Procyanidin dimer B1 and trimer C1 impair inflammatory response signaling in human monocytes[J]. Free Radical Res，2011，45（5）：611-619.

[2] ALDINI G， CARINI M， PICCLI A， et al. Procyanidins from grape seeds protect endothelial cells from peroxynitrite damage and enhance endothelium-dependent relaxation in human artery：new evidences for cardio-protection[J]. Life Sci，2003，73：2883-2898.

[3] 李澎，付建華，李欣志，等.山楂葉提取物及其制劑對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷中性粒細(xì)胞黏附的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志， 2008，28（8）：716-720.

[4] SVEDSTR?M U， VUORELA H， KOSTIAINEN R， et al. Fractionation of polyphenols in hawthorn into polymeric procyanidins， phenolic acids and flavonoids prior to high-performance liquid chromatographic analysis[J]. J Chromatogr A，2006，1112（1/2）：103- 111.

[5] 董瑞霞，李立祥，王茜，等.植物中原花青素含量測定[J].茶業(yè)通報， 2008，30（2）：67-69.

[6] 董郡.病理學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1996：117-119.

[7] VEVERIS M， KOCH E， CHATTERJEE S S. Crataegus special extract WS? 1442 improves cardiac function and reduces infarct size in a rat model of prolonged coronary ischemia and reperfusion[J]. Life Sci，2004，74：1945-1955.

[8] 李澎，王建農(nóng)，盧樹杰，等.山楂葉原花青素對乳鼠心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[J].中國中藥雜志，2009，34（1）：96-99.

[9] SHEN H M，PERVAIZ S. TNF receptor superfamily-induced cell death：redox dependent execution[J]. FASEB J，2006，20（10）：1589- 1598.

（收稿日期：2016-11-29）

（修回日期：2016-12-13；編輯：華強）