解林紅，陸紹霞，李 祥，徐 鈺，楊思遠(yuǎn)， 柴洪亮*

(1.國家林業(yè)局野生動(dòng)物疫源疫病監(jiān)測(cè)總站，遼寧沈陽 110034；2.東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物資源學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040；3.黑龍江民族職業(yè)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150066)

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岳陽地區(qū)赤麻鴨禽流感和新城疫的監(jiān)測(cè)

解林紅1，陸紹霞2，李 祥2，徐 鈺1，楊思遠(yuǎn)3*， 柴洪亮2*

(1.國家林業(yè)局野生動(dòng)物疫源疫病監(jiān)測(cè)總站，遼寧沈陽 110034；2.東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物資源學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040；3.黑龍江民族職業(yè)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150066)

為了解湖南岳陽地區(qū)圈養(yǎng)赤麻鴨攜帶禽流感病毒(AIV)和新城疫病毒(NDV)的情況，于2014年9月在湖南岳陽地區(qū)某養(yǎng)殖場采集赤麻鴨咽、肛拭子各100份，采用SPF雞胚分離病毒，通過血凝試驗(yàn)篩選疑似陽性樣品后再用RT-PCR進(jìn)行鑒定。在100份被檢樣品中，除4份樣品外，其余樣品的血凝效結(jié)果均為陰性。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，所有樣品均為陰性。該研究結(jié)果為了解湖南岳陽地區(qū)圈養(yǎng)赤麻鴨AIV和NDV帶毒情況及候鳥遷徙路線上禽流感和新城疫的監(jiān)測(cè)提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

赤麻鴨；禽流感；新城疫；監(jiān)測(cè)

新城疫( Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的一種急性、熱性、敗血性及高度接觸性傳染病，具有很高的發(fā)病率和病死率[1-2]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為必須報(bào)告的動(dòng)物傳染病。1999年我國農(nóng)業(yè)部發(fā)布的動(dòng)物疫病病種目錄中將其列為一類疫病。新城疫是極易傳染的毀滅性疾病，流行病學(xué)和生態(tài)學(xué)研究表明，家養(yǎng)水禽是新城疫病毒的天然貯存庫，雞、鴨、鵝、鴿子及鵪鶉等多種家禽及野禽均易感，人類也可以感染[3-4]，該病的流行給世界養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的損失。因此，對(duì)該病監(jiān)測(cè)有利于養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展。

禽流感是由正黏病毒科A型流感病毒(Avian influenza virus，AIV)屬中的不同亞型引起的禽類一種從呼吸系統(tǒng)病變到嚴(yán)重全身性敗血癥的急性高度接觸性傳染病[5-6]。OIE將高致病性禽流感定為必須報(bào)告的動(dòng)物傳染病，我國將其列為一類動(dòng)物疫病[7]。歷史上，禽流感曾出現(xiàn)4次大流行，不僅給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，還嚴(yán)重威脅著人類的健康。2005年湖南省發(fā)現(xiàn)中國大陸第1例人感染高致病性H5N1禽流感病毒的病例，其后相繼發(fā)現(xiàn)與禽類接觸或食用禽類制品感染H5N1 AIV的病例[8-9]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2013年湖南省人感染A型H1N1禽流感的高達(dá)832例，其中3人死亡。2014年湖南省22人感染H7N9禽流感，其中9人死亡。2014年1月26日、2月5日汨羅市相繼出現(xiàn)2例人感染H7N9禽流感。

水禽是AIV和NDV的巨大儲(chǔ)存庫，本研究選取散放的人工繁殖赤麻鴨(雁形目鴨科)作為哨兵動(dòng)物，對(duì)湖南岳陽地區(qū)水禽攜帶AIV和NDV狀況進(jìn)行監(jiān)測(cè)，為湖南岳陽地區(qū)水禽感染禽流感和新城疫情況的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 SPF雞胚與SPF雞血 來源于哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.1.2 主要試劑 Trizol，Invitrogen公司產(chǎn)品；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，PROMEGA公司產(chǎn)品；Taq酶、dNTP，GenStar公司產(chǎn)品；RRI，TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 在湖南岳陽地區(qū)采集100只圈養(yǎng)赤麻鴨，每只均采集咽拭子和肛拭子，編號(hào)分別為Y1-Y100和G1-G100。將肛、咽拭子置于盛有PBS保存液的采樣管中存放于裝有生物冰袋的運(yùn)輸箱中，低溫運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室。

1.2.2 樣品處理 將采樣的拭子在保存液中充分振蕩混勻，3 000 r/min離心10 min，取同一編號(hào)的肛、咽拭子樣品上清液各200 μL混合，編號(hào)為H1-H100，作為接種材料，備用。

1.2.3 病毒分離 采用雞胚尿囊腔接種法進(jìn)行病毒分離。將處理好的樣品，由尿囊腔接種于9日齡～11日齡SPF雞胚，每個(gè)樣品接種2枚SPF雞胚，每只雞胚接種0.2 mL樣品，37℃全自動(dòng)孵化器內(nèi)孵化72 h，每隔24 h照胚1次。棄去24 h內(nèi)死亡的雞胚，盲傳3代，無菌條件下收獲24 h～72 h內(nèi)的死胚及活胚尿囊液，對(duì)其進(jìn)行血凝試驗(yàn)并測(cè)定血凝效價(jià)，對(duì)血凝試驗(yàn)結(jié)果陽性的樣品進(jìn)行AIV和NDV的的核酸鑒定。

1.2.4 RT-PCR檢測(cè) 對(duì)血凝試驗(yàn)結(jié)果為陽性的尿囊液進(jìn)行病毒RNA提取，以實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)保存的AIV和NDV特異性引物進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系如下：在PCR管中依次加入去18 μL去離子水、2 μL dNTP、2.5 μL 10×buffer、1 μL引物(上游引物、下游引物各0.5 μL)、1.5 μLcDNA模板、0.5 μLTaqDNA聚合酶。PCR反應(yīng)程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s、退火溫度下30 s、72℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；最后，72℃ 10 min。其中擴(kuò)增AIV核酸片段的退火溫度為50℃，擴(kuò)增NDV核酸片段的退火溫度為53.1℃。通過10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物。

2 結(jié)果

2.1 血凝試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)每代收集的尿囊液采用血凝試驗(yàn)檢測(cè)。在100份被檢樣品中有4份樣品顯示出血凝活性(表1)，其余樣品血凝效價(jià)均為0。

表1 血凝試驗(yàn)結(jié)果

2.2 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

對(duì)血凝試驗(yàn)結(jié)果陽性的尿囊液提取病毒RNA，使用設(shè)計(jì)的AIV核酸鑒定引物和NDV核酸鑒定引物分別進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。AIV陽性對(duì)照樣品的目的片段大小為960 bp(圖1)，NDV陽性對(duì)照樣品的目的片段大小為375 bp(圖2)。經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析，陽性對(duì)照樣品均出現(xiàn)了相應(yīng)大小的目的條帶，而血凝試驗(yàn)結(jié)果陽性的待檢樣品均未出現(xiàn)相應(yīng)的目的條帶，說明血凝試驗(yàn)結(jié)果陽性的待檢樣品AIV核酸和NDV核酸檢測(cè)均為陰性。

3 討論

近年來，世界各地相繼暴發(fā)禽流感和新城疫，對(duì)家禽養(yǎng)殖業(yè)和野生動(dòng)物種群構(gòu)成嚴(yán)重的威脅。位于湖南省的雪峰山和羅霄山山脈為全球8大候鳥遷徙路線的東亞線，每年10月，候鳥遷徙的必須經(jīng)停地洞庭湖區(qū)，部分位于湖南岳陽地區(qū)境內(nèi)。湖南岳陽地區(qū)水網(wǎng)密布，其獨(dú)特的將家養(yǎng)水禽放養(yǎng)或散養(yǎng)于江河、農(nóng)田、池湖的飼養(yǎng)模式，導(dǎo)致家養(yǎng)水禽與野生水禽共用同一水系，大大增加了混合感染的風(fēng)險(xiǎn)。岳陽地區(qū)作為候鳥遷徙過程的必經(jīng)之地，在候鳥到來之前，對(duì)其進(jìn)行禽流感和新城疫的監(jiān)測(cè)有利于此候鳥遷徙路線上疫情的監(jiān)測(cè)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.陰性對(duì)照；2～5.H4、H25、H32、H70；6.陽性對(duì)照

M.DNA Marker DL 2 000；1.Negative control；2-5.H4，H25，H32，H70；6.Positive control

圖1 AIV的PCR檢測(cè)結(jié)果

Fig.1 PCR detection results of AIV

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.陽性對(duì)照；2～5.H4、H25、H32、H70；6.陰性對(duì)照

M.DNA Marker DL 2 000；1.Positive control；2-5.H4，H25，H32，H70；6.Negative control

圖2 NDV的PCR檢測(cè)結(jié)果

Fig.2 PCR detection results of NDV

本研究僅對(duì)禽流感和新城疫病毒進(jìn)行檢測(cè)，除禽流感和新城疫病毒外，其他病毒，如腺病毒，病毒囊膜上有糖蛋白血凝素，能與動(dòng)物的紅細(xì)胞表面的糖蛋白受體結(jié)合，也能引起紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。此外，從采集的樣品中未檢測(cè)到禽流感和新城疫病毒，可能是因?yàn)榇舜窝芯坎杉臉悠窋?shù)量和樣品種類偏少。通過該試驗(yàn)雖不能充分了解湖南岳陽地區(qū)家禽攜帶禽流感病毒和新城疫病毒的情況，但可為湖南岳陽地區(qū)禽流感和新城疫的監(jiān)測(cè)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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Monitoring of Avian Influenza and Newcastle Disease in Ruddy Shelduck of Yueyang Reigon Hunan Province

XIE Lin-hong1，LU Shao-xia2，LI Xiang2，XU Yu1， YANG Si-yuan3，CHAI Hong-liang2

(1.GeneralMonitoringStationforWildlife-borneInfectiousDiseases，SFA，Shenyang,Liaoning,110034，China；2.CollegeofWildlifeResources，NortheastForestryUniversity，Harbin，Heilongjiang，150040，China； 3.HeilongjiangVocationalCollegeForNationalities，Harbin，Heilongjiang，150066，China)

To investigate the epidemiological characteristics of avian influenza virus(AIV) and Newcastle disease virus(NDV) in Yueyang reigon of hunan province,the samples were collected from domestic ruddy shelducks in a farm of Yueyang reigon of Hunan province, including 100 oropharyngeal and 100 cloacal swabs in September of 2014.The viruses were isolated by using SPF chicken embryos and then identified by hemagglutination and RT-PCR test.Among 100 samples,only 4 samples were positive screened by hemagglutination test.The results of RT-PCR showed all the 4 samples were negative of avian influenza virus and Newcastle disease virus.This research could provide basic data for the surveillance of avian influenza and Newcastle disease in the migratory routes and understanding the infection situations of AIV and NDV of domestic ruddy shelducks in Yueyang region of Hunan province.

ruddy shelduck; Avian influenza; Newcastle disease; monitoring

2016-07-15

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2016YFC1201600)；國家林業(yè)局保護(hù)司2017年重要野生動(dòng)物疫病主動(dòng)預(yù)警專項(xiàng)

解林紅(1983-)，女，河南洛陽人，工程師，碩士，主要從事陸生野生動(dòng)物疫源疫病監(jiān)測(cè)防控管理工作。*通訊作者

S852.659.5;S858.32

B

1007-5038(2017)07-0134-03