謝秀蘭，黎 帥，馬小明，康曉冬，高?；?，李穎康*

(1.寧夏農(nóng)林科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，寧夏銀川 750002；2.寧夏大學(xué)新華學(xué)院，寧夏銀川 750021)

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羊奇異變形桿菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

謝秀蘭1，黎 帥2，馬小明1，康曉冬1，高?；?，李穎康1*

(1.寧夏農(nóng)林科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，寧夏銀川 750002；2.寧夏大學(xué)新華學(xué)院，寧夏銀川 750021)

為查明寧夏地區(qū)某羊場(chǎng)羔羊腹瀉的發(fā)病原因并選擇敏感藥物用于治療，從患病羔羊糞便中分離出4 株細(xì)菌，進(jìn)行形態(tài)特征、培養(yǎng)特性、16 S rRNA測(cè)序、VITEK微生物鑒定系統(tǒng)鑒定、致病性試驗(yàn)及藥敏試驗(yàn)。結(jié)果顯示，分離菌為奇異變形桿菌。動(dòng)物試驗(yàn)表明，4 株奇異變形桿菌對(duì)小鼠具有很強(qiáng)的致病性。藥敏試驗(yàn)表明，4 株奇異變形桿菌對(duì)氨基糖甙類(lèi)抗生素(阿米卡星、卡那霉素、鏈霉素)、氟苯尼考及頭孢菌素類(lèi)抗生素敏感，而對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)(紅霉素和克林霉素)、復(fù)方新諾明、恩諾沙星全部耐藥。對(duì)青霉素類(lèi)(哌拉西林、氨芐西林、阿莫西林)、喹諾酮類(lèi)(環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星)、四環(huán)素、萬(wàn)古霉素、慶大霉素呈現(xiàn)不同程度的耐藥。結(jié)果表明，該4 株奇異變形桿菌具有較強(qiáng)的致病力和多重耐藥性，可能是此次羔羊腹瀉的致病菌，治療首選氨基糖甙類(lèi)、氟苯尼考及頭孢菌素類(lèi)抗生素。

羔羊腹瀉；奇異變形桿菌；分離鑒定；藥敏試驗(yàn)

奇異變形桿菌(Proteusmirabilis，PM)是營(yíng)腐生的人畜共患病原菌，也是一種引起多種動(dòng)物患病的條件致病菌，廣泛存在于自然環(huán)境及人和動(dòng)物的腸道中，在人類(lèi)可引起食物中毒、腹瀉、菌血癥、尿道炎及呼吸道感染等[1-5]。在動(dòng)物上，近年來(lái)不斷有奇異變形桿菌感染畜禽和水生動(dòng)物，引起消化道、呼吸道、泌尿生殖道及體表潰爛等并致死的報(bào)道，給畜禽養(yǎng)殖帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失[5-13]。奇異變形桿菌作為人畜共患傳染病病原,在肉羊養(yǎng)殖過(guò)程中引起的疫情頻頻發(fā)生[14-20],在給養(yǎng)殖場(chǎng)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失的同時(shí)也存在感染人的風(fēng)險(xiǎn),應(yīng)引起足夠的重視。2015年初，寧夏鹽池、平羅兩家規(guī)?；B(yǎng)羊場(chǎng)的羔羊發(fā)生腹瀉為主要癥狀的疾病，經(jīng)對(duì)糞便中的細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)、微生物鑒定、致病性及藥敏性試驗(yàn)，以指導(dǎo)臨床生產(chǎn)，具體報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本 發(fā)生腹瀉的4只羔羊的糞便肛拭子，采自寧夏鹽池、平羅兩地羊場(chǎng)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)ISR小鼠14只，體重18 g～22 g，購(gòu)自寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.3 試劑與儀器 藥敏紙片，杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品；2×TaqPCR MasterMix、DNA Marker DL 2 000、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；營(yíng)養(yǎng)瓊脂、SS培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)、LB肉湯培養(yǎng)基等培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；VITEK 2革蘭陰性細(xì)菌鑒定卡、梅里埃VITEK 2 Compact 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定、藥敏分析系統(tǒng)，法國(guó)梅里埃公司產(chǎn)品；電子比濁儀(DensiCHEK Plus)，美國(guó)BioMerieux公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病原分離 無(wú)菌操作，將肛拭子分別分區(qū)劃線(xiàn)接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂、SS瓊脂、伊紅美藍(lán)瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)18 h～24 h，觀(guān)察菌落形態(tài)特征，挑取典型菌菌，接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂、SS瓊脂、伊紅美藍(lán)瓊脂平板，純化培養(yǎng)，并進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)菌鑒定。取純培養(yǎng)物涂片，革蘭染色，觀(guān)察細(xì)菌形態(tài)。

1.2.2 VITEK2 Compact的細(xì)菌鑒定 在滅菌的4.5 g/L 生理鹽水中，加入菌液，電子比濁儀調(diào)整其濃度為0.5麥?zhǔn)蠁挝唬迦敫锾m陰性細(xì)菌鑒定卡，應(yīng)用VITEK2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)菌鑒定。

1.2.3 細(xì)菌16 S rRNA鑒定 16 S rRNA基因擴(kuò)增采用細(xì)菌通用引物，序列為：27F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG；1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

提取純化培養(yǎng)物DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為25 μL，2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL，模板1.0 μL，ddH2O補(bǔ)足25 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 4 min；94℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 30 s，35 個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，將序列進(jìn)行BLAST 比對(duì)分析，并與GenBank中PM 16S rRNA基因核苷酸序列進(jìn)行同源性分析。

1.2.4 致病性試驗(yàn) 取健康小鼠14只，試驗(yàn)組每株3只，對(duì)照2只。取分離菌12 h肉湯培養(yǎng)物腹腔接種試驗(yàn)給小鼠，0.5 mL/只(約1.0×109CFU/mL)，對(duì)照組腹腔注射0.5 mL生理鹽水，隔離飼養(yǎng)，觀(guān)察小鼠發(fā)病情況，并分離細(xì)菌。

1.2.5 藥敏試驗(yàn) 用KB紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，吸取30 μL菌液，置于普通瓊脂培養(yǎng)基中央，用涂布棒將菌液均勻涂于培養(yǎng)基表面，至菌液被完全吸收后，將不同的藥敏片貼在培養(yǎng)基的適當(dāng)位置。置于37℃培養(yǎng)箱中18 h～24 h，觀(guān)察抑菌情況，判定依照NCCLS標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 病原分離

2015年12年～2016月1月，寧夏鹽池、平羅兩地羊場(chǎng)發(fā)生羔羊腹瀉病，發(fā)病率低，約為5%，未發(fā)生死亡。病羊均為20日齡以?xún)?nèi)的羔羊，肛門(mén)周?chē)慈敬罅考S便，糞便呈黑色，質(zhì)稀，無(wú)氣泡，無(wú)出血，病羊精神較好。從患病羊糞便中分離出4株疑似奇異變形桿菌，分別命名為Q1、Q2、Q3及Q4。該4株菌在普通瓊脂上長(zhǎng)成圓形，中等大小，具明顯的“遷徙生長(zhǎng)”現(xiàn)象(圖1A)。SS平板上為圓形，中等大小、無(wú)色半透明，菌落中央呈黑色(圖1B)。革蘭染色后檢測(cè)可見(jiàn)革蘭陰性，短小桿狀細(xì)菌(圖1C)。

2.2 VITEK2 Compact的細(xì)菌鑒定

經(jīng)VITEK2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀鑒定，該4株細(xì)菌鑒定為奇異變形桿菌，置信度均為99%。

2.3 PCR擴(kuò)增結(jié)果

以提取的分離菌基因?yàn)槟０?，用合成的通用引物擴(kuò)增分離菌16 S rRNA基因，結(jié)果擴(kuò)增出大小約為1 504 bp目的片段，與預(yù)期大小相符(圖2)。同源性最高的序列均為PM各株系的16 S rRNA，其同源性均高達(dá)100%，證明P1～P4均為奇異變形桿菌。

2.4 動(dòng)物試驗(yàn)

試驗(yàn)組小鼠在接種后1.5 h出現(xiàn)精神沉郁，食欲不振，接種后7 h，Q1、Q2及Q3均全部死亡，Q4有2只死亡，1只精神不振。對(duì)照組小鼠未見(jiàn)異常。剖檢可見(jiàn)各臟器充血、出血、腫大，肝臟表面有彌漫性出血點(diǎn)，腸腔有氣泡，腸腔內(nèi)充盈黃色液體(圖3)。從死亡小鼠的肝臟回收細(xì)菌經(jīng)染色鏡檢并進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)和生化試驗(yàn),結(jié)果與接種菌一致。

2.5 藥敏試驗(yàn)

對(duì)22種常見(jiàn)抗生素藥物中，4株奇異變形桿菌均對(duì)阿米卡星、氟苯尼考、卡那霉素、鏈霉素和頭孢曲松、頭孢拉定、頭孢唑林、頭孢噻肟、頭孢氨芐抗生素敏感，而對(duì)紅霉素和克林霉素、復(fù)方新諾明、恩諾沙星全部耐藥。哌拉西林(2/4)、慶大霉素(3/4)、氨芐西林(3/4)、阿莫西林(3/4)、環(huán)丙沙星(3/4)、氧氟沙星(3/4)、諾氟沙星(3/4)、四環(huán)素(1/4)、萬(wàn)古霉素(1/4)為敏感，結(jié)果見(jiàn)表1。從表中可以看出，奇異變形桿菌具有多重耐藥性，其中Q3對(duì)22種抗生素中的13種耐藥，耐藥性最為嚴(yán)重。

A.普通瓊脂上生長(zhǎng)現(xiàn)象；B.SS平板上生長(zhǎng)現(xiàn)象；C.革蘭染色后鏡檢(100×)A.Culturing on ordinary agar medium; B.Culturing on SS medium; C.Gram staining microscopy(100×)

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1～4.分離菌的16 S rRNA PCR產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 2 000；1-4.16 S rRNA PCR products of isolates

圖2 16 S rRNA PCR擴(kuò)增結(jié)果

Fig.2 PCR amplification results of 16 S rRNA

A.腎臟出血，腫大；B.消化系統(tǒng)產(chǎn)氣A.Hemorrhage and swelling of kidney; B.Aerogenesis of digestive system

圖3 小鼠臟器病變

Fig.3 Pathological lesions of mouse organs

3 討論

羊奇異變形桿菌病的報(bào)道較少，自黃炳坤等[14]1992年首次報(bào)道了該病以來(lái)，陸續(xù)有羊患奇異變形桿菌病的報(bào)道。該病目前發(fā)現(xiàn)可造成綿羊或山羊各年齡段(尤其是羔羊)的消化道、呼吸道疾病，既可單獨(dú)感染發(fā)病[15-17]，也可混合感染[14,18-20]。本項(xiàng)目從發(fā)生腹瀉的羔羊糞便中分離到了奇異變形桿菌，經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)證實(shí)，PM是引起此次羔羊腹瀉的病因。

奇形變異桿菌對(duì)臨床常用的抗菌素極易產(chǎn)生耐藥性[21-23]，且耐藥機(jī)制復(fù)雜，其中產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶是其耐藥主要機(jī)制，其至少可以產(chǎn)生3種不同的β內(nèi)酰胺酶，分別為超廣譜β內(nèi)酰胺酶、AmpC酶和金屬β內(nèi)酰胺酶，并且其耐藥性存在一定的地域差異。黃炳坤等[14]從發(fā)病羊臟器中分離到21株P(guān)M，藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，所分離菌株對(duì)多數(shù)藥物的敏感性極低，16種藥物中高度或中度敏感藥物僅3種，12種藥物為不敏感。湯繼順等[15]對(duì)腹瀉羔羊糞便中分離的PM進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PM對(duì)青霉素、鏈霉素、克拉霉素及強(qiáng)力霉素等基本無(wú)效。王豪舉等[17]從發(fā)病山羊分離的PM藥敏試驗(yàn)結(jié)果，PM對(duì)11種抗生素不敏感。在本試驗(yàn)中，4株P(guān)M對(duì)青霉素類(lèi)(哌拉西林、氨芐西林、阿莫西林)、喹諾酮類(lèi)(環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星)、四環(huán)素、萬(wàn)古霉素及慶大霉素不同程度的耐藥。4株奇異變形桿菌對(duì)磺胺等多種藥物產(chǎn)生抗藥性，顯示出多重耐藥性。其中Q3對(duì)22種抗生素中的13種表現(xiàn)耐藥，表明耐藥性已經(jīng)很?chē)?yán)重。在本試驗(yàn)中，4 株P(guān)M對(duì)阿米卡星、卡那霉素和氟苯尼考、頭孢菌素類(lèi)抗生素敏感，根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，給發(fā)病羊用阿米卡星治療，病羊很快痊愈。因此，在寧夏地區(qū)的生產(chǎn)實(shí)踐中，我們推薦羊在發(fā)生變形桿菌性腹瀉時(shí)，應(yīng)優(yōu)先使用大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、氟苯尼考及頭孢菌素類(lèi)抗生素治療。

表1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

注：R為耐藥；I為中介；S為敏感。

Note:R.Resistant；I.Intermediate；S.Sensitive.

[1] 汪永祿,陶 勇,石志峰，等.安徽省馬鞍山市腹瀉患者變形桿菌感染狀況的初步探討[J].疾病監(jiān)測(cè)，2009，24(5)：337-339.

[2] 吳曉茹，周 華，楊 青，等.奇異變形桿菌耐藥性及亞胺培南不敏感株感染的臨床特點(diǎn)研究[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2014，26(9)：1035-1039.

[3] 林 靚，胡麗慶.尿液中奇異變形桿菌耐藥性變遷及監(jiān)測(cè)分析[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2013，25(10)：1192-1194.

[4] Trapman M,Van Ingen J,Keijman J,et al.Urinary tract infection caused by a capnophilicProteusmirabilisstrain[J].J Clin Microbiol,2015,53(6):1959-1960.

[5] Cabral A B,Maciel M A,Barros J F,et al.Detection of bla KPC-2 inProteusmirabilisin Brazil[J].Rev Soc Bras Med Trop,2015,48(1):94-95.

[6] 趙成堅(jiān)，黃 勇，谷穎樂(lè)，等.銀環(huán)蛇奇異變形桿菌的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，34(12)：213-217.

[7] 王旭榮，常瑞祥，王國(guó)慶，等.一株與奶牛關(guān)節(jié)膿腫相關(guān)的致病性奇異變形桿菌的分離與鑒定[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，34(9)：118-121.

[8] 陳 武，陳足金，王建榮．奇異變形桿菌引發(fā)獼猴腹瀉暴發(fā)流行的調(diào)查研究[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2004，25(2)：115-116.

[9] 仝品芬，年朝琴，彭 超，等．致樹(shù)鼩腹瀉的奇異變形桿菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，2014，31(1)：41-44.

[10] 楊炳杰，蘇偉桐，蘇惠龍.斷奶仔豬奇異變形桿菌病的診治[J].中國(guó)獸藥雜志，2008，42(7)：57-58.

[11] 肖定漢，楊通廣，李蘭華，等.犢牛變形桿菌病[J].中國(guó)奶牛，2009(1)：31-32.

[12] 段二珍,夏平安,張鳳華,等.狐貍奇異變形桿菌的分離與鑒定[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2008,38(12):1050-1054

[13] 周 芳，冉丹丹，劉 飛，等.雞源奇異變形桿菌的分離鑒定與系統(tǒng)進(jìn)化分析[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2015，36(7)：29-32.

[14] 黃炳坤，謝德生，歐陽(yáng)洪璧，等.綿羊變形桿菌病的研究[J].中國(guó)畜禽傳染病，1992(5)：15-18.

[15] 湯繼順，蘇世廣，朱德建，等.奇異變形桿菌性羊腹瀉病原學(xué)分析及耐藥性探討[A]//2013中國(guó)羊業(yè)進(jìn)展[C].2013：305-309.

[16] 崔國(guó)林，鐘世勛，楊世發(fā)，等.山羊奇異變形桿菌分離鑒定及其16S-23S rRNA ISR序列RFLP分析[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，44(6)：919-924.

[17] 王豪舉，倪 莉，楊紅軍，等.山羊奇異變形桿菌的分離鑒定及16S rDNA和ZapA基因的PCR-RFLP分析[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2011，31(11)：1594-1598.

[18] 劉國(guó)華，韓梅英，楊永信，等.小尾寒羊鏈球菌和變形桿菌混合感染的診治[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2004，40(9)：34-35.

[19] 陶 立，藍(lán)顯利，閉炳芬，等.羔羊奇異變形桿菌與支原體混合感染的診斷[J].中國(guó)畜禽種業(yè)，2014(12)：104-106.

[20] 陳 曦，王遠(yuǎn)微，王 永，等.山羊腹瀉糞便中奇異變形桿菌的分離鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2014，41(8)：215-218.

[21] Yu W,He Z,Huang F,Multidrug-resistantProteusmirabilisisolated from newly weaned infant rhesus monkeys and ferrets[J].Jundishapur J Microbiol,2015,8(6):e16822. doi: 10.5812/jjm.

[22] Chen L,Laham N,Chavda K D,et al.First report of an OXA-48-producing multidrug-resistantProteusmirabilisstrain from Gaza,Palestine[J].Antimicrob agent Chemother,2015,59(7):4305-4307.

[23] Ryou S H,Bae J W,Baek H J,et al.Pulmonary pneumatocele in a pneumonia patient infected with extended-spectrum β-lactamase producingProteusmirabilis[J].Tuberc Respir Dis,2015,78(4):371-374.

Isolation,Identification and Drug Sensitivity Test ofProteusmirabilisfrom Lambs

XIE Xiu-lan1，LI Shuai2，MA Xiao-ming1，KANG Xiao-dong1，GAO Hai-hui1，LI Ying-kang1

(1.InstituteofAnimalScience，NingxiaAcademyofAgricultureandForestrySciences,Yinchuan,Ningxia,750002,China； 2.XinhuaCollege,NingxiaUniversity,Yinchuan,Ningxia,750021,China)

In order to identify the cause of diarrhea of lambs occurred in Ningxia area and choose sensitive drugs for treatment.4 strains of bacteria isolated from anal swabs,and then morphological characteristics,cultivation characteristics were observed,16S rRNA were sequenced,VITEK microbe identification and drug susceptibility were tested.The tests showed that 4 isolates wereP.mirabilis;Animal test indicated that 4P.mirabilishad high virulent;Drug susceptibility test showed that 4 isolates ofP.mirabiliswere sensitive to aminoglycosides antibiotics (amikacin,kanamycin,streptomycin),florfenicol and cephalosporin antibiotics；resistant to macrolide antibiotics (erythromycin and clindamycin),and CO-trimoxazole,enrofloxacin.Different degree of drug resistances presented in penicillins (piperacillin,ampicillin,amoxicillin),quinolones(ciprofloxacin,ofloxacin,norfloxacin),tetracycline,vancomycin and gentamicin.The results showed thatP.mirabiliswas the cause of lamb diarrhea and had high virulent and multiple drug resistance.Treatment preferred aminoglycosides antibiotics,florfenicol and cephalosporin antibiotics.

lamb diarrhea;Proteusmirabilis; isolation and identification; drug sensitivity test

2016-03-25

寧夏農(nóng)林科學(xué)院先導(dǎo)基金項(xiàng)目(NKYJ-14-10)

謝秀蘭(1980-)，女，回族，寧夏平羅人，副研究員，碩士，主要從事動(dòng)物病原分子生物學(xué)研究。*通訊作者

R378.99;S858.26

B

1007-5038(2017)07-0115-05