孫秋艷，沈美艷，朱明恩，李 舫

(山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院，山東濰坊 261061)

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滸苔多糖體外抗犬冠狀病毒臨床分離株的作用研究

孫秋艷，沈美艷，朱明恩，李 舫*

(山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院，山東濰坊 261061)

利用A72細(xì)胞(犬纖維肉瘤細(xì)胞系)從山東某寵物醫(yī)院臨床上表現(xiàn)為急性胃腸炎癥狀的幼犬腹瀉糞便中分離到1株病毒，通過(guò)間接免疫熒光(IFA)和RT-PCR進(jìn)行鑒定,確定為犬冠狀病毒，命名為CCoV-SW1。為探討滸苔多糖(EPS)體外抗CCoV-SW1毒株的作用效果，以A72細(xì)胞為細(xì)胞模型，通過(guò)直接殺滅、抑制復(fù)制及阻斷吸附3個(gè)方面進(jìn)行研究。結(jié)果表明，EPS對(duì)A72細(xì)胞最大安全濃度為62.5 mg/L；EPS對(duì)CCoV感染A72細(xì)胞抑制率與EPS質(zhì)量濃度有一定量效關(guān)系；EPS對(duì)CCoV具有直接殺滅和阻斷吸附的作用，并且與EPS濃度具有量效關(guān)系；EPS抑制CCoV復(fù)制效果不明顯，但仍有一定效果，當(dāng)EPS濃度為62.5 mg/L時(shí)，細(xì)胞存活率為37.2%。EPS在體外對(duì)CCoV具有直接殺滅和阻斷吸附的作用，為CCoV的預(yù)防和治療提供依據(jù)。

滸苔多糖；犬冠狀病毒山東分離株；分離鑒定；抗病毒作用

犬冠狀病毒 (Canine coronavirus，CCoV)是引起犬冠狀病毒病的主要病原，自1985年徐漢坤等[1]首次報(bào)道CCoV在我國(guó)的流行以來(lái)，不斷出現(xiàn)有關(guān)CCoV感染的報(bào)道[2-4]。CCoV主要引起犬的急性胃腸炎癥狀，發(fā)病率和病死率較高，是當(dāng)前對(duì)我國(guó)養(yǎng)犬業(yè)危害較大的病原。CCoV具有高度傳染性，其病原的分離鑒定和早期診斷對(duì)該病的預(yù)防控制具有重要的意義。滸苔(Enteromorpha)是綠藻植物石莼科中的水生藻類(lèi)植物。滸苔多糖(Enteromorphapolysaccharide，EPS)是滸苔的關(guān)鍵活性成分，EPS具有抗腫瘤、降血脂、降血糖、抗氧化、抗病毒及免疫調(diào)節(jié)等功能[5-9]，目前尚未見(jiàn)有關(guān)EPS抗CCoV研究的報(bào)道。本試驗(yàn)首先從上海某寵物醫(yī)院臨床上表現(xiàn)為急性胃腸炎癥狀的3月齡幼犬腹瀉糞便中，通過(guò)細(xì)胞分離培養(yǎng)，成功分離到1株病毒，通過(guò)間接免疫熒光和RT-PCR進(jìn)行鑒定，確診分離病毒株為CCoV；通過(guò)EPS對(duì)CCoV體外作用的研究，旨在發(fā)現(xiàn)預(yù)防及治療CCoV藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞及毒株 參考毒株CCoV 1-71株，A72(犬纖維肉瘤細(xì)胞系，Canine fibrosarcoma cell)細(xì)胞由山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院動(dòng)物檢測(cè)中心保存；細(xì)胞生長(zhǎng)液含100 mL/L胎牛血清的DMEM，病毒增殖的維持液含50 mL/L胎牛血清的DMEM。

1.1.2 主要試劑 羊抗鼠IgG-TRITC，Jackson ImmunoResearch公司產(chǎn)品；PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；病毒RNA提取試劑盒，天根生化有限公司產(chǎn)品；AMV第1鏈cDNA合成試劑盒，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品；MTT、DMSO，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。

1.1.3 滸苔多糖 滸苔分離純化后滸苔多糖含量為69.2%，多糖組成成分和含量見(jiàn)表1，為山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院檢測(cè)中心研發(fā)，使用時(shí)按試驗(yàn)要求進(jìn)行稀釋。

表1 EPS組成成分及含量

1.1.4 病料 來(lái)自于山東某寵物醫(yī)院3月齡幼犬腹瀉糞便，臨床癥狀為精神不振，呈嗜睡狀，食欲減少或廢絕，無(wú)體溫變化；口渴，鼻鏡干燥，嘔吐，持續(xù)6 d出現(xiàn)腹瀉；糞便呈粥樣，暗褐色，惡臭，混有黏液或少量血液。

1.2 方法

1.2.1 病毒的分離培養(yǎng) 將采集的糞便樣品用含150 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液1∶5稀釋?zhuān)? 000 r/min離心30 min，取上清液，用0.22 μm的微孔濾膜濾器過(guò)濾，收集濾液接種于長(zhǎng)滿(mǎn)單層的A72細(xì)胞，連續(xù)觀察7 d，不出現(xiàn)細(xì)胞病變(cytopathic effect,CPE)的連續(xù)傳7代，如仍不出現(xiàn)CPE則視為陰性；有CPE繼續(xù)傳代，直到CPE穩(wěn)定，然后鑒定。

1.2.2 間接免疫熒光鑒定

1.2.2.1 鼠抗CCoV高免血清的制備 將參考毒株CCoV 1-71和CCoV 分離株大量培養(yǎng)，制備病毒抗原置-80℃凍存。將制備的抗原用弗氏完全佐劑乳化，分別免疫6周齡Balb/c小鼠；第2周用弗氏不完全佐劑乳化；再隔3 d加強(qiáng)免疫用弗氏不完全佐劑乳化。每周采血，測(cè)定血清中和抗體瓊擴(kuò)效價(jià)達(dá)1∶8以上時(shí)，心臟采血，分離血清，測(cè)定中和抗體效價(jià)，該血清用作下列試驗(yàn)的一抗，置-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 間接免疫熒光鑒定試驗(yàn)方法 按常規(guī)方法進(jìn)行[10]。

1.2.3 RT-PCR的鑒定

1.2.3.1 引物合成 參照GenBank編號(hào)為AY796289.1的CCoV S基因的核苷酸序列，設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，Primer(Forward)：5′-GCAACTAGTTCTGATTTTGTTC-3′；Primer(Reverse)：5′-GCGTTAATTAACCTGCAGGGGCTGTGA-3′，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.3.2 RNA的提取 處理糞便上清液、第7代細(xì)胞培養(yǎng)物、第9代細(xì)胞培養(yǎng)物、第12代細(xì)胞培養(yǎng)物及將參考株CCoV 1-71，按照病毒RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，提取RNA，參考株CCoV 1-71作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.3.3 cDNA的生成 按照AMV第1鏈cDNA合成試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，合成cDNA。

1.2.3.4 PCR反應(yīng) 反應(yīng)體系條件參考文獻(xiàn)[10]進(jìn)行。

1.2.4 CCoV TCID50的測(cè)定 按Reed-Muench法測(cè)定病毒的TCID50。

1.2.5 EPS對(duì)A72細(xì)胞安全濃度測(cè)定 稱(chēng)取高壓滅菌EPS用細(xì)胞維持液稀釋成1 000、500、250、125、62.5、31.3、15.7、7.9 mg/L的濃度，加到長(zhǎng)成單層A72的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，0.1 mL/孔，每個(gè)濃度重復(fù)4孔，另設(shè)細(xì)胞對(duì)照，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔12 h觀察CPE情況，72 h 后，棄上清，每孔加5 mg/L的MTT溶液20 μL，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，輕輕將上清液棄去，每孔加DMSO溶液120 μL，充分振蕩混勻10 min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處光密度值，進(jìn)行細(xì)胞存活率(CSR)的計(jì)算。CSR=(試驗(yàn)組平均光密度值-對(duì)照組平均光密度值)/對(duì)照組平均光密度值×100%。

1.2.6 EPS對(duì)CCoV感染A72細(xì)胞抑制作用的試驗(yàn) 在EPS對(duì)A72細(xì)胞最大安全濃度范圍內(nèi)，2倍倍比稀釋EPS，選取8個(gè)稀釋度的稀釋液分別與等體積100 TCID50CCoV混合,加到長(zhǎng)成單層ST的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，0.1 mL/孔，每個(gè)稀釋度重復(fù)4孔，另設(shè)細(xì)胞對(duì)照和病毒對(duì)照，37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2溫箱中培養(yǎng)，同1.2.5操作測(cè)定CSR，計(jì)算EPS對(duì)CCoV感染A72細(xì)胞抑制率，抑制率=(試驗(yàn)組平均光密度值-病毒組平均光密度值)/(細(xì)胞對(duì)照組平均光密度值-病毒組平均光密度值)×100%。

1.2.7 EPS體外抗CCoV感染A72細(xì)胞試驗(yàn) 試驗(yàn)設(shè)EPS組、細(xì)胞對(duì)照組及病毒對(duì)照組，以A72細(xì)胞安全濃度最高質(zhì)量濃度，用細(xì)胞維持液對(duì)EPS作2倍連續(xù)倍比稀釋?zhuān)x取8個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度做4個(gè)重復(fù)，分別進(jìn)行以下試驗(yàn)。

1.2.7.1 對(duì)CCoV直接殺滅作用 EPS每個(gè)稀釋度的稀釋液分別與等體積1 000 TCID50病毒液混合,37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中作用2 h，加到長(zhǎng)成單層A72的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，0.1 mL/孔，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，棄去上清液，加入細(xì)胞維持液，0.1 mL/孔，37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，測(cè)定CSR。

1.2.7.2 抑制CCoV復(fù)制作用 先將1 000 TCID50病毒液接種至長(zhǎng)成單層A72的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，0.1 mL/孔，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)吸附2 h，棄去病毒液，PBS洗單層細(xì)胞2次，加入EPS稀釋液，0.1 mL/孔，37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，測(cè)定CSR。

1.2.7.3 阻斷CCoV吸附作用 EPS每個(gè)稀釋度的稀釋液加到長(zhǎng)成單層A72的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，0.1 mL/孔，37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中作用48 h，棄去EPS稀釋液,PBS洗單層細(xì)胞2次，每孔加入1 000 TCID50病毒液0.1 mL，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中作用2 h，棄去病毒液，PBS洗單層細(xì)胞2次，加入維持液，0.1 mL/孔，37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，測(cè)定CSR。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 利用SPSS Statistics 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理25，多重比較用LSD法進(jìn)行，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值+標(biāo)準(zhǔn)差表示，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 CCoV的分離培養(yǎng)

將處理好的病毒液接種A72細(xì)胞，在第6代盲傳時(shí)，A72細(xì)胞于24 h出現(xiàn)輕微病變,表現(xiàn)為個(gè)別細(xì)胞變圓、融合；盲傳至第7代18 h后可觀察到明顯的CPE，表現(xiàn)為細(xì)胞圓縮,聚集成團(tuán)，少數(shù)細(xì)胞脫落；在48 h后,95%單層細(xì)胞脫落，對(duì)照細(xì)胞正常。傳至第9代細(xì)胞病變穩(wěn)定，產(chǎn)生病變時(shí)間為18 h。

2.2 IFA鑒定

2.2.1 鼠抗CCoV高免血清的制備 采免疫鼠血液，制備血清，中和試驗(yàn)測(cè)定血清效價(jià)，鼠抗CCoV 1-71株中和抗體效價(jià)為1∶2 048，鼠抗CCoV-SW1中和效價(jià)為1∶512。

2.2.2 IFA試驗(yàn) 用TRITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體，采用IFA加DAPI方法對(duì)分離毒株進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，接毒細(xì)胞18 h可觀察到特異性細(xì)胞漿內(nèi)熒光(圖1)。

1.共聚焦顯微鏡下TRITC發(fā)出的橙紅色熒光；2.共聚焦顯微鏡下DAPI染色后的細(xì)胞核；3.共聚焦顯微鏡下A與B圖合并后特異性細(xì)胞漿內(nèi)熒光

1.TRITC orange red fluorescence under confocal microscope；2.API stained cell nuclei under confocal microscope；3.A and B combined specific cytoplasmic fluorescence under confocal microscope

圖1 CCoV-SW1株免疫熒光抗體鑒定結(jié)果

Fig.1 The identification results of CCoV-SW1 by immunofluorescence antibody

2.3 RT-PCR的鑒定

CCoV-SW1毒株糞便上清液、第7代細(xì)胞培養(yǎng)物、第9代細(xì)胞培養(yǎng)物及第12代細(xì)胞培養(yǎng)物均能擴(kuò)增出與參考株CCoV 1-71相同的553 bp目的片段(圖2)，從而確定該株病毒為CCoV。對(duì)照組犬腸道病料擴(kuò)增結(jié)果為陰性。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn) DL 4 500；1.參考株CCoV 1-71；2.糞便上清液；3. 7代細(xì)胞培養(yǎng)物；4. 9代細(xì)胞培養(yǎng)物；5. 12代細(xì)胞培養(yǎng)物

M.DNA Marker DL 4 500；1.Reference CCoV 1-71；2.CCoV sample；3.The 7thCCoV sample；4.The 9thCCoV sample；5.The 12thCCoV sample

圖2 RT-PCR鑒定結(jié)果

Fig.2 Identification results of CCoV-SW1 by PT-PCR

2.4 病毒TCID50的測(cè)定

CCoV-SW1第12代培養(yǎng)物TCID50為10-5.57/0.1 mL。

2.5 EPS對(duì)A72細(xì)胞安全濃度測(cè)定結(jié)果

EPS質(zhì)量濃度>62.5 mg/L時(shí)，細(xì)胞存活率顯著低于正常細(xì)胞對(duì)照組(P<0.05)，EPS質(zhì)量濃度小于或等于62.5 mg/L時(shí)，細(xì)胞存活率與細(xì)胞對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。因此,EPS對(duì)A72細(xì)胞安全濃度62.5 mg/L(圖3)。

與對(duì)照組相比，**表示P<0.01,*表示P<0.05Compared with control group,**P<0.01,*P<0.05

2.6 EPS對(duì)CCoV感染A72細(xì)胞抑制作用

由圖4可以看出，EPS對(duì)CCoV感染A72細(xì)胞抑制率與EPS質(zhì)量濃度有一定量效關(guān)系，當(dāng)EPS質(zhì)量濃度達(dá)到15.7 mg/L，對(duì)CCoV感染A72細(xì)胞抑制率達(dá)到50.6%，濃度越高抑制作用越明顯。

圖4 EPS對(duì)CCoV感染A72細(xì)胞抑制作用

2.7 EPS體外抗CCoV感染A72細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果

從圖5可以看出，EPS對(duì)CCoV具有直接殺滅和阻斷吸附的作用，并且與EPS濃度具有量效關(guān)系，濃度越高，細(xì)胞存活率越高。EPS抑制CCoV復(fù)制效果不明顯，但仍有一定效果，當(dāng)EPS濃度為62.5 mg/L時(shí)，細(xì)胞存活率為37.2%，當(dāng)EPS濃度達(dá)到4.0 mg/L時(shí)，細(xì)胞存活率為0。

圖5 EPS體外抗CCoV感染A72細(xì)胞的作用

3 討論

本研究對(duì)山東某寵物醫(yī)院臨床上表現(xiàn)為急性胃腸炎癥狀的疑似感染CCoV的幼犬腹瀉糞便，采用最為敏感的傳代細(xì)胞系A(chǔ)72細(xì)胞進(jìn)行了病毒分離培養(yǎng)，CCoV通過(guò)其表面纖突和易感細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合可侵入易感細(xì)胞，由于CCoV纖突較大，在理化因素的作用下極易脫落，所以本試驗(yàn)采用了含150 mL/L胎牛血清的DMEM進(jìn)行稀釋?zhuān)梢蕴岣叻蛛xCCoV的成功率。細(xì)胞病變現(xiàn)象是病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖及其對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損害的最明顯的表現(xiàn)。由于各種CCoV毒株毒力的差異，當(dāng)細(xì)胞接種病毒的時(shí)候，其出現(xiàn)CPE的時(shí)間也不盡相同，某些毒株即或是盲傳多代也不出現(xiàn)病變。因此本試驗(yàn)盡可能多的盲傳多代，而且等到CPE穩(wěn)定后，才對(duì)病毒進(jìn)行其他鑒定。本試驗(yàn)采用IFA和RT-PCR進(jìn)行鑒定，間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)用TRITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗，DAPI染色，TCS-SP5激光共聚焦顯微鏡觀察，此方法不但可以對(duì)CCoV進(jìn)行特異性鑒定，還可以進(jìn)行病毒定位，靈敏度相當(dāng)高；RT-PCR方法鑒定分離毒株，排除了細(xì)小病毒、輪狀病毒感染的可能，從而保證分離的病毒為CCoV。

滸苔是渤海沿海常見(jiàn)的海藻，滸苔大量繁殖漂會(huì)破壞海洋生態(tài)系統(tǒng)，嚴(yán)重威脅沿海漁業(yè)發(fā)展，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。EPS是滸苔主要活性成分，本試驗(yàn)研究EPS體外抗CCoV的作用，研究結(jié)果表明，滸苔多糖對(duì)CCoV具有直接殺滅作用，而且多糖濃度越高作用時(shí)間越長(zhǎng)，直接殺滅作用越好。滸苔多糖對(duì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)病毒抑制作用不明顯，原因可能是CCoV進(jìn)入細(xì)胞的速度太快而多糖進(jìn)入細(xì)胞的速度太慢。滸苔多糖對(duì)CCoV吸附細(xì)胞具有明顯的阻斷作用，所以滸苔多糖對(duì)CCoV在體外具有一定的抑制作用。本研究說(shuō)明滸苔多糖有抗病毒的能力,為滸苔多糖在臨床上對(duì)病毒病的預(yù)防和治療提供了理論依據(jù)。

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Study on Anti-CCoV Clinical Isolated Strain byEnteromorphaPolysaccharideinVitro

SUN Qiu-yan,SHEN Mei-yan,ZHU Ming-en,LI Fang

(ShanDongVocationalAnimalScienceandVeterinaryCollege,Weifang,Shandong，261061，China)

An CCoV strain was isolated by using A72 cells from the faeces of a pup with acute gastroenteritis in a pet hospital of Shandong.Through the identification by IFA and RT-PCR,the results demonstrated that the iaolated virus is CCoV,named CCoV-SW1.In order to explore the antiviral effects ofEnteromorphapolysaccharide(EPS), the following experiments,including the directly viruscidal assay, virus inhibition replication assay and virus blocking absorbtion assay with A72 cell model were used.The results indicated that the maximum safety concentration of EPS to A72 cells was 62.5 mg/L;the inhibition ratio to CCoV infected A72 cells of EPS had a quatitative relationship with the EPS concentration;the EPS had a strong anti-CCoV abilityinvitroby directly virucidal effect and blocking absorbtion of the virus to cells,it had a quatitative relationship with the EPS concentration;the effects of EPS to inhibit replication of CCoV was not obvious, but still had some effects,when mass concentration of EPS was 62.5 mg/L,the inhibition ratio of cells was 37.2%. This study indicated that the EPS has a strong anti-CCoV abilityinvitroby directly virucidal effect and blocking absorbtion of the virus to cells,it can provide important scientific data for preventing and treating CCoV.

Enteromorphapolysaccharide;Canine coroanvirus Shandong strain; isolation and identification;antiviral activity

2016-11-14

山東省濰坊市科學(xué)技術(shù)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2015GX054)

孫秋艷(1978-)，女，山東單縣人，講師，碩士，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究。*通訊作者

S852.659.6;Q539

A

1007-5038(2017)07-0022-05