郝玉青，劉健鵬，楊增岐

(1.榆林市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，陜西榆林 719000；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

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陜北白絨山羊小反芻獸疫病毒RT-PCR方法的建立

郝玉青1,2，劉健鵬1*，楊增岐2*

(1.榆林市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，陜西榆林 719000；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

為了建立適用于本地區(qū)小反芻獸疫病毒的分子生物學(xué)快速檢測(cè)方法，通過分析NCBI數(shù)據(jù)庫中小反芻獸疫病毒N基因序列，根據(jù)該基因設(shè)計(jì)特異性引物，建立針對(duì)本地區(qū)小反芻獸疫病毒N基因的一步法RT-PCR檢測(cè)方法，利用該方法對(duì)來自疫源地的不同病料樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示該方法對(duì)病料的可選擇性較多，對(duì)檢測(cè)到的陽性條帶通過測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)流行毒株與陜西毒株基因型差異不明顯。該檢測(cè)方法的建立有利于開展小反芻獸疫疫情監(jiān)測(cè)，為有效防控小反芻獸疫提供技術(shù)支撐。

小反芻獸疫病毒；逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)；測(cè)序分析

小反芻獸疫(Peste des petis ruminants,PPR)是由小反芻獸疫病毒(Peste des petis ruminants virus,PPRV)引起的一種山羊、綿羊等小反芻獸類的急性接觸傳染性疾病[1]，其發(fā)病率和病死率均較高。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為法定報(bào)告動(dòng)物傳染病，我國將其列為一類動(dòng)物疫病[2]。

2014年4月3日在榆林市定邊縣鹽場(chǎng)堡鎮(zhèn)賈圈村發(fā)生一起疑似小反芻獸疫疫情，4月5日該疫情得到國家外來動(dòng)物疫病防控制中心確診，啟動(dòng)應(yīng)急預(yù)案并進(jìn)行了無害化處理。該病作為一種重大的跨國動(dòng)物疫病，嚴(yán)重危險(xiǎn)動(dòng)物衛(wèi)生安全，故建立一種快速特異且適合本地區(qū)的診斷技術(shù)就顯得十分重要。PPRV病毒基因組為單股負(fù)鏈RNA，編碼8個(gè)蛋白，依次為3′N-P/C/V-M-F-H-L 5′,N蛋白是組成病毒核衣殼的主要蛋白之一，基于該蛋白發(fā)展的診斷技術(shù)可以有效的區(qū)分小反芻獸疫和牛瘟[3]。針對(duì)PPRV檢測(cè)試劑盒不穩(wěn)定、質(zhì)量層次不齊、價(jià)格昂貴等問題，本研究建立了一種針對(duì)N基因的適合于檢測(cè)陜北白絨山羊PPRV的逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)用于本地區(qū)小反芻獸疫的監(jiān)測(cè)，具有重要的實(shí)際意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料和疫苗PPRV 弱毒疫苗為新疆天康生產(chǎn)(Nigeria75/1)、病料采集為本地區(qū)已公布的小反芻獸疫病料，全市不同縣區(qū)送到的120份棉拭子病源監(jiān)測(cè)樣品，犬瘟熱病毒疫苗為楊凌綠方生物有限公司生產(chǎn)。

1.1.2 試劑與溶液 TIAN amp Virus DNA/RNA Kit病毒基因組RNA提取試劑盒、Master Mix、DNA Marker、Easy Script First-Strand cDNA Synthesis Super Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒,TaKaRa生物科技有限公司產(chǎn)品；RNAiso Plus裂解液、預(yù)冷氯仿(-20℃)、預(yù)冷異丙醇(-20℃)、RNase-free水，TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 微量移液器,德國Eppendorf公司產(chǎn)品；超凈工作臺(tái),北京亞泰科隆實(shí)驗(yàn)科技開發(fā)中心產(chǎn)品；PCR擴(kuò)增儀，日本Bio-Rad公司產(chǎn)品；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、微波爐(LG)、穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，北京六一廠產(chǎn)品；電子天平，美國Adventurer公司產(chǎn)品；核酸電泳儀，北京六一廠產(chǎn)品；紫外凝膠成像系統(tǒng)，英國Syngene公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 參照NCBI公布的小反芻獸疫病毒N基因保守區(qū)域的序列，使用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)的基因引物交由invitrogen公司合成，合成的引物用1 mL/L DEPC處理水稀釋至終濃度10 μmol/L，置于-20℃保存?zhèn)溆?表1)。

1.2.2 病料處理 取疑似患小反芻獸疫的病羊肺、淋巴結(jié)、腎或肝等病料組織加入適量滅菌生理鹽水剪碎研磨，至勻漿狀態(tài)后制成10%懸液，加入雙抗，離心取上清液保存?zhèn)溆?；采集棉拭子離心取上清液備用；采集抗凝血可直接使用。

表1 PPRV引物序列

1.2.3 病毒核酸的提取 根據(jù)TaKaRa試劑盒的說明書進(jìn)行RNA提取和反轉(zhuǎn)錄操作。PCR擴(kuò)增以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所有加樣操作都需在冰盒上進(jìn)行，PCR 擴(kuò)增體系：反應(yīng)體系為25 μL，2×TaqPCR Master Mix 12μL，ddH2O 10 μL，上、下引物各1 μL，cDNA 1 μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序：95℃ min；95℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 30 s，共40個(gè)或35個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min。產(chǎn)物用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，恒壓120 V，40 min～50 min，凝膠成像儀觀察PCR產(chǎn)物。

1.2.4 PPRV特異性試驗(yàn) 選取犬瘟熱病毒(CDV)疫苗(批號(hào)：20150703)、PPR陽性羊全血按照PPRV提取方法進(jìn)行提取檢測(cè)，觀察結(jié)果確定該方法的特異性。

1.2.5 PPRV敏感性試驗(yàn) 設(shè)置6個(gè)檢測(cè)濃度，進(jìn)行該方法的靈敏度檢測(cè)：測(cè)定PPRV疫苗液的TCID50濃度，根據(jù)濃度分別將疫苗倍比稀釋成終濃度為10-5TCID50/mL～100TCID50/mL，按照樣品的方法進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)條帶情況。

1.2.6 PPRV病料檢測(cè) 采集疑似PPRV不同發(fā)病羊的抗凝血、口鼻棉拭子、直腸棉拭子、肺組織、腎組織、淋巴組織及血清，進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.7 PPRV普通RT-PCR的病原學(xué)檢測(cè) 利用本研究建立的PPRV檢測(cè)方法分別對(duì)各縣區(qū)送來的PPRV監(jiān)測(cè)樣品進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 PPRV疫苗毒株提取試驗(yàn)

設(shè)計(jì)好引物后按照PPRV提取方法，提取疫苗弱毒株后得到351 bp的條帶(圖1)，與預(yù)期結(jié)果相符。

2.2 PPRV特異性試驗(yàn)

使用犬瘟熱疫苗毒和PPR陽性羊全血為模板，按照PPRV體系進(jìn)行提取，取反應(yīng)后產(chǎn)物8 μL電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示1號(hào)、2號(hào)為陰性，3號(hào)為陽性，表明PPRV普通PT-PCR檢測(cè)方法對(duì)PPRV的檢測(cè)有良好的特異性(圖2)。

M．DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 500；1.PPRV疫苗株；2.陰性對(duì)照

M.DNA Marker DL 500; 1.Vaccine strain of PPRV;2.Negative control

圖1 PPRV疫苗毒株提取試驗(yàn)

Fig.1 Vaccine strain extraction test of PPRV

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.陰性對(duì)照；2.CDV疫苗株；3.PPR陽性病料

M.DNA Marker DL 2 000; 1.Negative control;2 .Vaccine strain of CDV; 3.Positive material of PPR

圖2 PPRV特異性試驗(yàn)

Fig.2 Specificity test of PPRV

2.3 PPRV敏感性試驗(yàn)

從圖3擴(kuò)增結(jié)果可見，當(dāng)PPRV疫苗毒株稀釋到10-2TCID50/mL時(shí)，PCR擴(kuò)增仍可為陽性，說明本方法具有較高的靈敏度。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 500；1～6.PPRV濃度100TCID50/mL～10-5TCID50/mL

M.DNA Marker DL 500; 1-6.PPRV with concentrations of 100TCID50/mL-10-5TCID50/mL

圖3 PPRV敏感性試驗(yàn)

Fig.3 Sensitivity test of PPRV

2.4 PPRV病料檢測(cè)

用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示(圖4)1、2、4、5、6、7、8、9、10、11、14、15號(hào)為陽性，3、10、12、13、16為陰性。由1號(hào)、2號(hào)、4號(hào)、6號(hào)、14號(hào)可知采集的陜北白絨山羊直腸棉拭子中檢測(cè)出PPRV病毒，說明此階段羊處于排毒期，檢出率高，采樣也比較容易，小反芻獸疫病原學(xué)監(jiān)測(cè)可推薦使用棉拭子樣品；由5號(hào)、7號(hào)可知小反芻獸疫發(fā)病羊血清中含有病毒，用RT-PCR可檢出，血清可作為小反芻獸疫病毒的檢測(cè)病料；由4號(hào)、5號(hào)、8號(hào)、9號(hào)檢測(cè)結(jié)果可知，發(fā)病期送檢病料在不同組織中都可檢出，表明對(duì)發(fā)病羊進(jìn)行病料送檢可選擇性較多。選取3條陽性條帶，切膠后密封保存，送北京博邁德生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

M．DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 500；B、N.同只羊采集樣品；1.棉拭子；2.棉拭子；3.棉拭子；4.B棉拭子；5.B組血清；6.N組棉拭子；7.N組血清；8.B組肺；9.B組腎；10.腎；11.腎；12.肺；13.棉拭子；14.棉拭子；15.PPRV疫苗對(duì)照；16.陰性對(duì)照

M.DNA Marker DL 500;B&N.The same sheep samples;1.Cotton swab;2.Cotton swab;3.Cotton swab;4.Cotton swab of B;5.Serum of group B;6.Cotton swab of groupN;7.Serum of group N；8.Lung of groupB;9.Kidney of group B;10.Kidney;11.Kidney;12.Lung;13.Cotton swab;14.Cotton swab;15.Vaccine strain of PPRV ;16.Negative control

圖4 PPRV病料檢測(cè)

Fig.4 The detection of PPRV samples

2.5 PPRV普通RT-PCR的病原學(xué)檢測(cè)

對(duì)全市不同縣區(qū)送樣的120份病源監(jiān)測(cè)樣品進(jìn)行PPRV普通RT-PCR檢測(cè)，初篩檢測(cè)出7份棉拭子樣品陽性，對(duì)7份陽性樣品再次檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示有5份樣品在351 bp左右處均可見到清晰的條帶(圖5)，2份樣品沒有顯示條帶。

2.6 測(cè)序結(jié)果

測(cè)序結(jié)果經(jīng)Megalin軟件用Clustal W方法對(duì)測(cè)序結(jié)果中的核苷酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，獲得的D1、D2、Y3小反芻獸疫毒株序列分別與NCBI中公布的China/ShaanXi 2014(登錄號(hào):KP319027.1)毒株相應(yīng)N基因序列進(jìn)行核苷酸同源性比對(duì)(圖6)，序列同源性分別為97.8%、97.5%、98.1%；堿基序列比較發(fā)現(xiàn)，堿基主要發(fā)生了部分突變和缺失(圖7)。

3 討論

建立特異、敏感、快速的小反芻獸疫病原診斷方法，是榆林市小反芻獸疫防控的迫切需求，血清學(xué)診斷時(shí)使用青島立見產(chǎn)PPRV阻斷-ELISA試劑盒，只能用作免疫效果的評(píng)價(jià)，不能作為疫病診斷依據(jù)，進(jìn)口競(jìng)爭(zhēng)ELISA(C-ELISA)屬于感染后的晚期診斷，且價(jià)格昂貴[4]。實(shí)時(shí)熒光定量TaqMan RT-PCR方法雖然特異性和靈敏度都有所提高[5]，但是檢測(cè)時(shí)需要產(chǎn)生熒光的引物、探針及昂貴的設(shè)備，現(xiàn)階段市一級(jí)檢測(cè)單位只有普通PCR儀，建立的PPR普通PCR對(duì)儀器要求相對(duì)較低也符合本地區(qū)流行毒株檢測(cè)。RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用該對(duì)引物能夠檢測(cè)到0.01TCID50/mL的病毒，與國內(nèi)外報(bào)道的檢測(cè)方法比較，靈敏度較高[6-7]。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000 bp；1.陰性對(duì)照；2～8.病源學(xué)監(jiān)測(cè)棉拭子樣品；9.PPRV疫苗對(duì)照

M.DNA Marker DL 2 000 bp;1.Negative control;2-8.Cotton swab samples of the pathogenic surveillance;9.Vaccine strain of PPRV

圖5 PPRV病原學(xué)檢測(cè)

Fig.5 Pathogen detection of PPRV

圖6 不同毒株N基因核酸同源性比對(duì)

PPR病原學(xué)采集樣品時(shí)《小反芻獸疫防治技術(shù)規(guī)范》中推介采集病料時(shí)可采用羊口鼻棉拭子、淋巴結(jié)或血沉宗黃層。本試驗(yàn)在關(guān)于PPR不同病料的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)直腸棉試子在羊早期檢測(cè)中可使用，PPRV主動(dòng)監(jiān)測(cè)時(shí)需要到散戶采集樣品，若采樣時(shí)對(duì)羊的損傷過大會(huì)引起采樣障礙，采集眼、鼻、口腔棉拭子病料成功率較低，而采集直腸棉拭子需要的人力少、技術(shù)要求低、對(duì)羊的傷害較小，檢出率也高，因此推薦做主動(dòng)或被動(dòng)監(jiān)測(cè)時(shí)采用直腸棉拭子[8]；當(dāng)發(fā)生疑似PPR時(shí)，采集發(fā)病羊的病料選擇性較多，在不同組織中幾乎都可檢出，血清和全血也可作為PPRV檢測(cè)樣品使用。

利用建立的RT-PCR方法檢測(cè)120份病原學(xué)樣品，結(jié)果有5份陽性棉拭子，由于滅活疫苗的免疫效果不佳，目前國內(nèi)外對(duì)PPR的防制主要采用弱毒疫苗接種[9]，被檢測(cè)樣品中可能含有小反芻獸疫病毒或疫苗毒株[10]，目前關(guān)于小反芻獸疫病毒或疫苗毒株進(jìn)行鑒別檢測(cè)技術(shù)還不成熟[11]，市級(jí)實(shí)驗(yàn)室沒有相關(guān)資質(zhì)，根據(jù)相關(guān)條例需向上級(jí)疫控中心送樣檢測(cè)。小反芻獸疫N基因有部分位點(diǎn)發(fā)生了突變、缺失，但由于密碼子具有簡(jiǎn)并性的特點(diǎn)[12]，致使氨基酸序列未見差異，與China/ShaanXi 2014(登錄號(hào):KP319027.1)毒株基因序列親緣關(guān)系較近。

圖7 PPRV基因核苷酸序列同源性比較

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Development of RT-PCR for Detection of Peste-des-petits Ruminants Virus in Chasmere Goats of Norshwest Shaanxi

HAO Yu-qing1,2,LIU Jian-peng1,YANG Zeng-qi2

(AnimalDiseasePreventionandControlCenterofYulin,Yulin,Shaanxi,719000,China; 2.CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi,712100,China)

In order to establish a rapid molecular biological method for testing peste des petits ruminants virus,the N gene sequence of peste des petits ruminants virus in NCBI database was analyzed,the specific primers were designed based on this gene,a one-step RT-PCR method for the detection of N gene of peste des petits ruminants ruminants virus in this area was established.The pair of primers were used to detect different samples from epidemic focus,the detected positive bands were sequenced,it can be determined that the epidemic strains and state released strains have the same genotype.The establishment of this detection method is propitious to the active monitoring and passive monitoring of the peste des petits ruminants epidemic situation,the technical support will be provided to prevent and control the peste des petits ruminants epidemic situation.

Peste des petits ruminant virus; reverse transcription-polymerase chain reaction,; sequencing analysis

2017-01-17

農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目(NYKJ-2015-023);陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程科技技術(shù)項(xiàng)目(2015KTTSNY04-04)

郝玉青(1988-)，男，陜西靖邊人，獸醫(yī)碩士，主要從事動(dòng)物疫病防控工作。*通訊作者

S852.659.5;S858.27

A

1007-5038(2017)07-0012-05