張廣凍，陳夢茜，李俊玫，劉 歡，張建民，靳亞平，王愛華*

(1.西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院，陜西楊凌 712100；2.陜西省蒲城縣畜牧獸醫(yī)局，陜西蒲城 715500)

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羊布魯菌血清抗體iELISA方法的建立及應用

張廣凍1△，陳夢茜1，2△，李俊玫1，劉 歡1，張建民2，靳亞平1，王愛華1*

(1.西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院，陜西楊凌 712100；2.陜西省蒲城縣畜牧獸醫(yī)局，陜西蒲城 715500)

為建立一種準確、快速、安全的羊布魯菌檢測方法，構建布魯菌bp26基因的原核表達載體，用切膠-電洗脫的方法純化重組GST-Bp26蛋白，并以純化的重組GST-Bp26蛋白為包被抗原，優(yōu)化反應條件，建立了羊布魯菌血清抗體的iELISA方法。結果表明,所建立的iELISA方法具有較好的特異性和敏感性，與虎紅平板凝集試驗結果具有良好的符合性，能夠滿足羊布魯菌病臨床檢測需要，具有較好的臨床應用價值。

布魯菌；Bp26；原核表達；間接酶聯(lián)免疫吸附試驗

布魯菌病(Brucellosis)是由布魯菌(Brucella)引起的一種人獸共患傳染病，是我國法定的二類動物疫病和乙類傳染病，全球每年約有5萬新增病例，是全球性的公共衛(wèi)生問題[1-2]。布魯菌是一種兼性胞內(nèi)病原菌，主要在吞噬細胞內(nèi)定殖，能夠逃避宿主免疫系統(tǒng)的監(jiān)測和殺滅作用，從而建立慢性持續(xù)感染?；疾游镏饕憩F(xiàn)為不孕不育、懷孕母畜流產(chǎn)、骨關節(jié)及生殖系統(tǒng)炎癥等[3-5]。人類因與患病動物直接接觸或食用未經(jīng)消毒或消毒不徹底的動物性食品而感染布魯菌病，患者主要表現(xiàn)出波狀熱、骨關節(jié)炎癥、肝脾腫大等臨床癥狀[4-7]。

及時、準確地確診是布魯菌病防控的關鍵，目前獸醫(yī)基層常用的布魯菌病診斷方法主要是虎紅平板凝集試驗，但該方法存在假陽性率較高、靈敏度不高等不足[8-10]。ELISA方法是目前應用最廣泛的血清學檢測方法，具有特異性強、靈敏度高、操作簡便等優(yōu)點[11]。本研究采用原核表達布魯菌具有較強免疫原性的Bp26蛋白，以純化的Bp26蛋白為包被抗原建立用于羊布魯菌的間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(iELISA)，為羊布魯菌病的診斷提供了一種靈敏度較好、特異性較強的血清學方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒及血清 布魯菌病活疫苗S2株由陜西省獸藥監(jiān)察所惠贈;pGEX-4T-1表達載體由西北農(nóng)林科技大學農(nóng)業(yè)部動物生物技術重點開放性實驗室保存;大腸埃希菌DH5α、BL21(DE3)感受態(tài)細胞，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；羊布魯菌病標準陽性血清、羊布魯菌病標準陰性血清、30份羊布魯菌病臨床陰性血清由陜西省渭南市蒲城縣畜牧獸醫(yī)局惠贈。

1.1.2 主要試劑TaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker,寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；辣根過氧化酶標記的兔抗山羊IgG，北京中杉金橋生物技術有限公司產(chǎn)品；DNA回收純化試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、細菌基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；其他試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 布魯菌bp26基因原核表達載體的構建 根據(jù)GenBank上公布的布魯菌bp26基因序列(GenBank登錄號：CP006961.1)設計1對特異性PCR引物，序列如下(劃線部分分別為EcoRⅠ和SalⅠ酶切位點)：

F：CCGGAATTCATGAACACTCGTGCTAGC；

R：ACGCGTCGACTTACTTGATTTCAAA- AACGAC；

以提取的布魯菌活疫苗S2株的基因組為模板，擴增大小為753 bp的布魯菌bp26基因片段。將擴增到的bp26基因片段與原核表達載體pGEX-4T-1連接，得到重組表達載體，并進行酶切和測序鑒定，鑒定正確的重組載體命名為pGEX-bp26。

1.2.2 重組布魯菌Bp26蛋白的原核表達與純化 用重組表達載體pGEX-bp26轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，次日挑取單克隆進行培養(yǎng)，然后加入終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導表達，并對誘導產(chǎn)物進行SDS-PAGE檢測。對鑒定正確的誘導產(chǎn)物以切膠-電洗脫的方法純化重組布魯菌Bp26蛋白(GST-Bp26)。

1.2.3 iELISA方法的建立

1.2.3.1 抗原最佳包被濃度及血清最佳稀釋倍數(shù)的確定 采用雙方陣試驗確定最佳抗原包被濃度和血清稀釋倍數(shù)：用0.05 mol/L的碳酸鹽緩沖液(pH9.6)將純化的重組蛋白分別稀釋為0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 μg/mL，100 μL/孔包被酶標板，37℃孵育1 h。將包被好的酶標板內(nèi)液體棄去，每孔加入150 μL的50 g/L脫脂奶粉，37℃封閉30 min。棄去包被液，PBST洗滌3次，將羊布魯菌病標準陽性血清和標準陰性血清分別做5、10、20、40、80倍稀釋，每孔分別加入100 μL，與不同濃度的重組蛋白組成方陣，37℃孵育1 h。棄去酶標板內(nèi)液體，PBST洗滌3次，每孔加入100 μL稀釋好的HRP-兔抗山羊IgG(7 000倍稀釋)，37℃孵育1 h。棄去酶標板內(nèi)的二抗，PBST洗滌3次，每孔加入100 μL現(xiàn)配的TMB顯色液，37℃顯色30 min，每孔加50 μL 2 mol/L硫酸終止。在酶標儀上讀取OD 450 nm值，以陽性血清OD 450 nm值接近1.0，陽性血清與陰性血清的比值(P/N值)最大者為最佳抗原包被濃度和血清稀釋倍數(shù)。

1.2.3.2 最佳抗原包被時間的確定 以篩選到的最佳濃度的抗原包被酶標板，于37℃分別包被30 min、1 h、1.5 h、2 h，其余步驟按照常規(guī)iELISA程序操作。反應結束后測定OD 450 nm，以陽性血清OD值接近1.0，P/N值最大者所對應的抗原包被時間為最佳抗原包被時間。

1.2.3.3 最佳封閉液的確定 用PBST配制10 g/L BSA、50 g/L BSA、50 g/L脫脂奶粉、100 g/L脫脂奶粉、10 g/L明膠作為候選封閉液，分別于37℃封閉30 min，其余步驟按照常規(guī)iELISA程序以篩選到的最佳抗原包被濃度、包被時間及血清稀釋倍數(shù)操作，反應結束后測定OD值，以陽性血清OD值接近1.0，P/N值最大者所對應的封閉液為最佳種類封閉液。

1.2.3.4 最佳封閉時間的確定 向最佳包被的酶標板加入150 μL最佳封閉液，于37℃分別封閉15、30、45、60 min，其余步驟按照常規(guī)iELISA程序以篩選到的最佳血清稀釋倍數(shù)操作，反應結束后測定OD值，以陽性血清OD值接近1.0，P/N值最大者所對應的封閉時間為最佳封閉時間。

1.2.3.5 最佳血清作用時間的確定 向最佳包被和封閉的酶標板加入最佳稀釋的血清，于37℃分別作用0.5、1.0、1.5、2.0 h，其余步驟按照常規(guī)iELISA程序操作，反應結束后測定OD值，以陽性血清OD值接近1.0，P/N值最大者所對應的作用時間為最佳血清作用時間。

1.2.3.6 最佳二抗作用時間的確定 向最佳包被、封閉及血清作用的酶標板加入7 000倍稀釋的酶標二抗，于37℃分別作用0.5、1.0、1.5、2.0 h，其余步驟按照常規(guī)iELISA程序操作，反應結束后測定OD值，以陽性血清OD值接近1.0，P/N值最大者所對應的作用時間為最佳二抗作用時間。

1.2.3.7 最佳顯色時間的確定 按照前面篩選好的最佳反應條件進行iELISA操作，在加入TMB顯色液后，分別于37℃孵育10、20、30、45、60 min，反應結束后測定OD值，以陽性血清OD值接近1.0，P/N值最大者所對應的作用時間為最佳顯色時間。

1.2.3.9 特異性試驗 用建立的iELISA方法分別檢測羊快疫、羊腸毒血癥、羊猝疽、羊黑疫、羊口蹄疫及羊小反芻獸疫陽性血清。

1.2.3.10 敏感性試驗 將羊布魯菌陽性血清分別做5、10、20、40、80、160、320倍稀釋，用建立的iELISA方法進行檢測。

1.2.3.11 符合性試驗及臨床應用 利用建立的iELISA檢測方法，對陜西省渭南市某養(yǎng)殖場的90份血清進行檢測，并將檢測結果與相同血清的虎紅平板凝集試驗檢測結果進行對比。

2 結果

2.1 布魯菌bp26基因原核表達載體的構建

將PCR產(chǎn)物進行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，在約753 bp處出現(xiàn)特異性條帶(圖1)；經(jīng)測序驗證，PCR產(chǎn)物序列與GenBank中公布的布魯菌bp26基因序列相符，表明布魯菌bp26基因擴增正確。將構建好的重組載體進行EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定，分別于約753 bp處和4 969 bp處出現(xiàn)特異性條帶，表明重組表達載體構建正確(圖2)。

2.2 重組布魯菌Bp26蛋白的原核表達與純化

將重組表達載體轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞后的誘導表達產(chǎn)物進行SDS-PAGE電泳，在約54 ku出現(xiàn)高表達的蛋白條帶，蛋白分子質(zhì)量與目的蛋白相符，表明重組Bp26蛋白成功表達(圖3)。為了提高目的蛋白的回收率和純度，本試驗以切膠-電洗脫的方法對誘導產(chǎn)物進行了純化(圖4)。

M.DNA標準DL 5 000；1.bp26 基因PCR產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 5 000；1.PCR products of bp26 gene

圖1 布魯菌bp26基因PCR擴增

Fig.1 PCR amplification ofBrucellabp26 gene

M.DNA標準DL 5 000；1.pGEX-bp26的酶切產(chǎn)物M.DNA Marker DL 5 000；1.pGEX-bp26 digested withEcoRⅠ &SalⅠ

圖2 pGEX-bp26的酶切鑒定

Fig.2 Enzyme digestion identification of pGEX-bp26

2.3 iELISA方法的建立

2.3.1 iELISA反應條件的優(yōu)化 由方陣試驗結果(表1)可知，當重組蛋白濃度為3.2 μg/mL、血清稀釋10倍時，陽性血清的OD 450 nm值接近1.0且P/N值較大，因此確定以3.2 μg/mL重組蛋白為最佳抗原包被濃度，血清10倍稀釋為最佳血清稀釋倍數(shù)。最終確定的iELISA最佳反應條件為：3.2 μg/mL的重組蛋白于37℃包被1 h，50 g/L的脫脂奶粉于37℃封閉30 min，血清樣本作10倍稀釋后于37℃孵育1 h，7 000倍稀釋的酶標二抗于37℃孵育1 h，新鮮配制的TMB顯色液于37℃反應30 min。

M.蛋白分子質(zhì)量標準；1.pGEX-4T-1誘導產(chǎn)物；2.pGEX-4T-1未誘導；3.pGEX-bp26誘導產(chǎn)物；4.pGEX-bp26未誘導M.Protein molecular weight Marker；1.Products of pGEX-4T-1 induced with IPTG；2.Products of pGEX-4T-1 uninduced；3.Products of pGEX-bp26 induced with IPTG；4.Products of pGEX-bp26 uninduced

圖3 pGEX-bp26的誘導鑒定

Fig.3 Identification of pGEX-bp26 with induction

M.蛋白分子質(zhì)量標準；1.GST-bp26純化產(chǎn)物

M.Protein molecular weight Marker；1.Products of purified GST-bp26

圖4 GST-Bp26的純化

Fig.4 Purification of GST-Bp26

2.3.3 特異性試驗 用建立的iELISA方法分別檢測羊快疫、羊腸毒血癥、羊猝疽、羊黑疫、羊口蹄疫及羊小反芻獸疫陽性血清，結果均低于臨界值，表明本研究建立的iELISA方法特異性良好。

2.3.4 敏感性試驗 將羊布魯菌陽性血清分別做5、10、20、40、80、160、320倍稀釋，用建立的iELISA方法進行檢測，結果顯示當血清稀釋20倍時結果仍為陽性，能夠滿足羊布魯菌病臨床檢測要求。

2.3.5 iELISA方法的臨床應用與符合性試驗 于陜西省渭南市某養(yǎng)殖場采集90份羊血清，分別用本研究建立的iELISA方法和虎紅平板試驗進行檢測(表3)，結果顯示，iELISA方法分別檢出21份陽性和69份陰性，虎紅平板分別檢出16份陽性和74份陰性，結果符合率達到90%，說明本研究建立的iELISA具有較高的敏感性和符合度。

表1 最佳抗原包被濃度和最佳血清稀釋倍數(shù)的確定

表2 30份陰性血清檢測結果

表3 iELISA與虎紅平板試驗對比結果

3 討論

原核表達系統(tǒng)是目前最常用的蛋白體外表達系統(tǒng)之一，而且現(xiàn)有原核表達載體大都帶有篩選和純化標簽，極大地方便了后續(xù)蛋白的純化工作。然而，從實際應用效果來看，利用原核表達載體的純化標簽進行過柱純化還存在著諸多不足，首先是過柱純化要求表達的蛋白必須為可溶性蛋白，如果是包涵體蛋白則必須提前進行變性處理，操做稍顯繁瑣；其次是純化柱的結合力有限，會導致部分表達產(chǎn)物的浪費，最終造成蛋白回收率較低；還有就是純化柱的特異性不夠強，會導致雜蛋白的非特異性結合，造成回收的蛋白純度不高。而切膠-電洗脫方法純化重組蛋白的回收率和純度則相對較高，傳統(tǒng)切膠方法是通過KCl染色來確定目的條帶位置的，但是KCl染色特異性不高、染色效果不明顯，一定程度上還是限制了切膠-電洗脫純化的目的蛋白的純度和回收率。通過不斷的條件和方法摸索，本研究改進了切膠-電洗脫方法：先取少量誘導后的重組蛋白進行考馬斯亮藍染色鑒定，如果目的蛋白上下沒有多余的雜蛋白，則可在切膠時參考蛋白Marker直接進行切膠；如果目的蛋白上下有雜帶，則先對誘導菌液進行超聲裂解，回收上清或沉淀以去除目的蛋白上下的雜蛋白，然后參照蛋白Marker切取目的蛋白條帶；還可以對誘導菌液進行適當濃縮以提高目的蛋白的濃度，從而增大目的蛋白在SDS-PAGE凝膠上的條帶大小，以此來保證切膠時目的蛋白的純度和回收量；通過以上方法改進極大地提高了蛋白的得率和純度。

對于布魯菌病的診斷，病原的分離培養(yǎng)是最為準確的一種方法，但是此方法操作復雜、耗時長、需要一定的專業(yè)技能、存在感染風險等缺點。因此目前已很少應用。虎紅平板凝集試驗、試管凝集試驗是目前應用最廣泛的布魯菌檢測方法，其主要通過滅活菌體的LPS與血清中的抗體發(fā)生抗原抗體反應來判斷結果。由于革蘭陰性菌的LPS具有較為明顯的交叉反應，因此這兩種方法在臨床應用中容易出現(xiàn)假陽性。另外，虎紅平板凝集試驗和試管凝集試驗也存在工作量大、不利于大規(guī)模應用等缺點[12-13]。ELISA方法操作簡便，適合臨床大規(guī)模應用，尤其以抗原交叉性較弱的蛋白類抗原建立的ELISA方法，具有特異性強、靈敏度高等優(yōu)點[8,14]。

Bp26蛋白是布魯菌的一個外膜蛋白，在所有布魯菌種高度保守，其在布魯菌外膜組成通道樣的結構[15-16]。研究表明，Bp26蛋白是一種保護性抗原，對人、牛、羊等具有較好的免疫保護性[17-18]。由于Bp26蛋白與其他細菌不存在抗原交叉性，因此可以用作亞單位疫苗和檢測抗原的候選分子，且在布魯菌病臨床診斷上取得了較為理想的效果[15,19-21]。鑒于Bp26的多種特性，本研究以表達純化的Bp26蛋白為包被抗原建立了檢測羊布魯菌病的iELISA方法。本研究將布魯菌bp26基因克隆到原核表達載體pGEX-4T-1，經(jīng)IPTG誘導獲得了分子質(zhì)量約為54 ku的重組蛋白GST-Bp26，并經(jīng)切膠-電洗脫法純化得到了純度較高的GST-Bp26。以純化的GST-Bp26為包被抗原，通過對各反應條件的優(yōu)化，初步建立了用于羊布魯菌病檢測的iELISA方法。用建立的iELISA方法分別了羊快疫、羊腸毒血癥、羊猝疽、羊黑疫、羊口蹄疫及羊小反芻獸疫陽性血清，結果均低于臨界值，表明本研究以布魯菌Bp26蛋白為檢測抗原建立的iELISA方法與腐敗梭菌、D型產(chǎn)氣莢膜梭菌、C型產(chǎn)氣莢膜梭菌、B型諾維梭菌、口蹄疫病毒及小反芻獸疫病毒不存在交叉反應。本研究建立的iELISA方法靈敏度表現(xiàn)為當血清稀釋20倍時仍能夠檢出陽性血清，相對偏低，分析原因可能是抗原有待進一步優(yōu)化。在驗證該iELISA方法的符合性時，于臨床隨機采集了90份羊血清，分別用RBT方法和本iELISA方法進行檢測，結果顯示符合性良好，但是也出現(xiàn)了RBT陽性而iELISA陰性、RBT陰性而iELISA陽性的情況，可能是兩種方法所依賴的抗原不同導致的[8,12-14]?？偟膩碚f，本研究建立的iELISA方法具有良好的特異性、敏感性及符合度，能夠滿足羊布魯菌病臨床檢測的需要。

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Establishment and Application of iELISA for Detecting
Serum Antibody of GoatBrucella

ZHANG Guang-dong1，CHEN Meng-xi1，2，LI Jun-mei1，LIU Huan1， ZHANG Jian-min2，JIN Ya-ping1，WANG Ai-hua1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，NorthwestA&FUniversity，Yangling，Shaanxi， 712100，China；2.BureauofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine，Pucheng，Shaanxi，715500，China)

In order to develop an iELISA for detecting goat brucellosis,a prokaryotic expression vector ofBrucellabp26 gene was constructed,and the recombinant protein GST-Bp26 was purified by the method of gel- electricelution.Then the microplates were coated with purified GST-Bp26 protein,and the reaction conditions were optimized respectively,finally,the iELISA for detecting serum antibody of goat brucellosis was developed.The specificity and sensitivity of the iELISA were tested,the results showed that the iELISA can satisfy the clinical detection of goat brucellosis.In addition,compared with the rose bengal plate test (RBPT),the iELISA exhibited a comparable efficiency,suggested that the iELISA has a potential for clinical use.

Brucella; Bp26; prokaryotic expression; iELISA

2017-04-20

國家自然科學基金項目(31672584)；陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計劃項目(2016TZC-N-13-5)

張廣凍(1989-)，男，山東新泰人，碩士研究生，主要從事動物繁殖障礙性疾病防控研究?！魍蓉暙I作者 *通訊作者

S852.614

A

1007-5038(2017)07-0006-06