王曉成，孫亞楠，任發(fā)政，張明，劉作文，仝其根

(1.北京農(nóng)學(xué)院，北京 102206；2.教育部北京市共建功能乳品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；3.北京工商大學(xué)食品學(xué)院，北京 100024；4.河北福成五豐食品股份有限公司，三河 065200）

益生菌對(duì)健康小鼠腸道形態(tài)發(fā)育的影響

王曉成1，孫亞楠2，任發(fā)政2，張明3，劉作文4，仝其根1

(1.北京農(nóng)學(xué)院，北京 102206；2.教育部北京市共建功能乳品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；3.北京工商大學(xué)食品學(xué)院，北京 100024；4.河北福成五豐食品股份有限公司，三河 065200）

為評(píng)價(jià)益生菌對(duì)健康小鼠腸道發(fā)育的影響，選取三周齡BalB/C雄性小鼠48只，隨機(jī)分為6組：陰性對(duì)照生理鹽水組、副干酪乳桿菌L9組、動(dòng)物雙歧桿菌A6組、長(zhǎng)雙歧桿菌BBMN68組、唾液乳桿菌FDB86組、陽性對(duì)照干酪乳桿菌代田菌株LcS組，以108cfu/mL水平每天0.2mL的劑量連續(xù)灌胃21d后處死，用免疫組化法對(duì)空腸的絨毛長(zhǎng)度和隱窩深度，以及腸道上皮細(xì)胞的增殖（Ki67核抗原）、分化（MUC2黏蛋白）進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，與陰性對(duì)照生理鹽水組相比，副干酪乳桿菌L9對(duì)健康小鼠腸道形態(tài)發(fā)育的影響最顯著，與陽性對(duì)照干酪乳桿菌代田菌株LCS組相比較，副干酪乳桿菌L9與陽性對(duì)照組試驗(yàn)結(jié)果相一致。結(jié)果表明，益生菌對(duì)健康小鼠的腸道形態(tài)發(fā)育有著重要作用，試驗(yàn)所用的四種益生菌中，副干酪乳桿菌L9對(duì)小鼠腸道的形態(tài)發(fā)育有著更顯著的影響。

益生菌；小鼠；腸道絨毛；腸道隱窩

益生菌(Probiotics)，又稱DFM.(direct-fed. microbial)，是指一類自然存在的對(duì)宿主的腸道健康有益的活微生物[1]。Tannock等人認(rèn)為可以在腸道內(nèi)存活并能夠通過機(jī)體的胃腸道，從而對(duì)宿主健康有益的活的微生物即是益生菌[2]。因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)全面均衡的乳液是很多益生菌的良好培養(yǎng)基，因此由益生菌和乳發(fā)酵產(chǎn)生的益生菌乳制品具有更好的益生功能和營(yíng)養(yǎng)功能。統(tǒng)計(jì)表明，我國(guó)益生菌乳品以每年25%的速度遞增，但我國(guó)對(duì)功能性乳品的研發(fā)相比國(guó)外還存在一定的差距，因此，對(duì)益生菌菌株的研發(fā)具有重要意義。

益生菌可以通過改善腸道屏障的結(jié)構(gòu)來預(yù)防和治療疾病，從而改善機(jī)體的健康狀況[3]。腸道不僅是機(jī)體的消化吸收器官，更是機(jī)體的免疫組織[4]。人體大約有65%的免疫組織和80%產(chǎn)免疫球蛋白組織分布在腸道，以抵御外界病毒和細(xì)菌的侵襲[5,6]，因而腸道健康與機(jī)體的健康密切相關(guān)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究表明，腸道微生物對(duì)動(dòng)物早期腸道的形態(tài)發(fā)育、上皮細(xì)胞的增殖、免疫系統(tǒng)的分化等有著重要的影響[7]。通過微生物的干預(yù)，尤其是益生菌的干預(yù)，可以有效增強(qiáng)腸道的消化吸收能力，對(duì)腸道健康發(fā)育有著重要意義[8]。腸道的形態(tài)尤其是小腸絨毛的高度和隱窩的深度等都是衡量小腸消化吸收能力的重要指標(biāo)[9]。絨毛邊緣可以分泌多種消化酶，因此，絨毛越長(zhǎng)的動(dòng)物其消化吸收能力越強(qiáng)。隱窩深度決定腸絨毛有絲分裂生成腸上皮細(xì)胞的速度，反映細(xì)胞的生成率。而隱窩變淺，表明細(xì)胞成熟率上升，分泌功能增強(qiáng)[10]。Suo.等人研究證明，植物乳桿菌ZJ316可以顯著提高斷奶仔豬的十二指腸、空腸和回腸絨毛高度，從而影響仔豬的生長(zhǎng)發(fā)育[11]。Che.[12]等人用含有雙歧桿菌的人體內(nèi)微生物菌群處理無菌豬，建立了HFA（Human. flora-associated）豬模型，在菌株定植腸道后，腸道上皮作為機(jī)體發(fā)揮免疫、吸收、屏障功能的基礎(chǔ)結(jié)果，在形態(tài)上相對(duì)于對(duì)照組，空腸上皮絨毛長(zhǎng)度更長(zhǎng)、隱窩更深，證明了腸道益生菌可對(duì)腸道形態(tài)產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響腸道結(jié)構(gòu)的完整性。因此，用絨毛長(zhǎng)度和隱窩深度的比值（v/c）可以綜合反映小鼠腸道的功能狀況。比值下降，黏膜很可能受損，消化吸收能力下降，常會(huì)伴隨著腹瀉、生長(zhǎng)受阻等現(xiàn)象；比值升高，腸道上皮細(xì)胞的數(shù)量增加，加大了腸道的吸收面積，進(jìn)而提高了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用率[10]。腸道絨毛的發(fā)育則是由腸道上皮細(xì)胞增殖、分化來決定的，Ki67（核抗原）是分裂細(xì)胞核的代表物，Muc2（黏蛋白）是杯狀細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白，兩者的陽性染色細(xì)胞分別代表分化中的細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞的分化程度[8]。其表達(dá)量可以在一定程度上反映腸道上皮細(xì)胞的發(fā)育狀況。

副干酪乳桿菌L9（Lactobacillus.paracasei.L9）是一株從長(zhǎng)壽老人糞便中分離得到的益生菌株，前期試驗(yàn)證明該菌株具有較高的安全性及調(diào)節(jié)小鼠腸道免疫功能的生物活性[13,14]。有研究證明L9具有緩解小鼠便秘的功效，對(duì)便秘小鼠連續(xù)15d灌胃副干酪乳桿菌L9后，小鼠便秘現(xiàn)象得到改善[15]，可以推測(cè)出副干酪乳桿菌L9可以通過改善便秘小鼠的腸道菌群及內(nèi)環(huán)境進(jìn)而改善機(jī)體的便秘現(xiàn)象。動(dòng)物雙歧桿菌A6(Bifidobacterium. animalis.subsp.Lactis.A6)分離自廣西巴馬百歲老人腸道，具有許多益生功能，具有實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值[16,.17]。陳龍等人[18]的研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物雙歧桿菌A6還可以減輕小鼠酒精肝的損傷。長(zhǎng)雙歧BBMN68(Bifidobacterium. longum.subsp..Longum.BBMN.68)分離自廣西巴馬長(zhǎng)壽老人腸道，其具有提高腸道黏膜免疫，增加腸道吸收能力的作用[19]。有研究結(jié)果表明，BBMN68可以促進(jìn)小鼠的腸道免疫屏障功能，參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)，對(duì)小鼠牛乳β-乳球蛋白過敏有緩解作用[20]。唾液乳桿菌FDB86(Lactobacillus.salivarius.FDB.86)分離于廣西長(zhǎng)壽老人腸道。研究發(fā)現(xiàn)，唾液乳桿菌FDB86具有脫除化學(xué)誘變劑4-硝基喹啉-N-氧化物基因毒性的功能，能夠預(yù)防口腔癌和結(jié)腸癌的發(fā)生[21,.22]，具有實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值。干酪乳桿菌代田株（Lactobacillus.casei.strain. shirota，LcS）是發(fā)酵乳品生產(chǎn)中被研究最多的益生菌，它是由日本代田稔博士在1930年從各種食物中分離出的，1966年被命名為shirota。LcS具有改善便秘的功能，有人群實(shí)驗(yàn)證明[23]，39名有便秘現(xiàn)象的健康成人在飲用含6.5×109cfu.LcS的發(fā)酵乳飲料4周后，糞便堅(jiān)硬或成塊的志愿者比例從73.7%降到了36.8%，而對(duì)照組的比例從75%增加到了85%。在另一個(gè)研究中發(fā)現(xiàn)，有便秘傾向的健康成年人每天攝入含4×109cfu.LcS的乳飲料兩周后，腸道內(nèi)Bifidobacteria、Lactobacillus、Atopbium的數(shù)量都顯著增加，Candida和C.leptum數(shù)量顯著減少[24]。本文通過對(duì)健康小鼠灌胃5株益生菌，觀察不同菌株對(duì)健康小鼠的腸道形態(tài)發(fā)育的影響，從而篩選出對(duì)腸道發(fā)育影響更顯著的益生菌株，并為后續(xù)研發(fā)功能性乳制品奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF近交系BalB/C小鼠48只：雄性，3周齡，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；普通飼料購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；無菌墊料購(gòu)自中國(guó)軍事科學(xué)醫(yī)學(xué)院；鼠李糖乳桿菌（LGG）由養(yǎng)樂多公司提供作為陽性對(duì)照組。

1.2 主要試劑

4%PBS緩沖液、組織固定液（谷歌）、封閉液（碧云天）、一抗稀釋液(碧云天)、二抗稀釋液（碧云天）、兔抗鼠Ki67單克隆抗體（RM-910-S1）、兔抗鼠Mucin.2單克隆抗體（SC-15334）、ImmPACTTM. DAB.底物（美國(guó).Vector.laboratories,.Inc.）。

1.3 主要儀器與設(shè)備

全自動(dòng)脫水儀器、冷臺(tái)儀、石蠟包埋機(jī)（沈陽龍騰電子設(shè)備有限公司）、石蠟切片機(jī)（Leica）、高級(jí)正置熒光顯微鏡（Leica.DM5500B）。

1.4 方法

1.4.1.菌液的準(zhǔn)備

試驗(yàn)所需各菌株于MRS液體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)12h，4.200r/min離心10min除去上清，菌體沉淀重懸于生理鹽水中，配制108cfu/mL濃度菌懸液。

1.4.2.動(dòng)物分組及處理

實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為6組，分別為陰性對(duì)照組（灌胃生理鹽水）、陽性對(duì)照組（灌胃LCS菌懸液）、試驗(yàn)組（分別灌胃L9/A6/BBMN68/FDB86菌懸液）。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物每日灌胃0.2mL108cfu/mL樣品，連續(xù)21d，分別于試驗(yàn)第0天、7天、14天、21天測(cè)量小鼠體重，并在21d處死后采集小鼠空腸腸段進(jìn)行后續(xù)分析。

1.4.3.小鼠空腸H&E染色[25]

取小鼠空腸上端腸段2～3cm放入固定液中避光固定24h，取出放入包埋籠中進(jìn)行脫水、包埋、切片、烤片、脫蠟水化、染色（蘇木精染細(xì)胞核，室溫染色11min，用自來水返藍(lán)5次，每次2min，95%乙醇30s。伊紅染細(xì)胞質(zhì)，將伊紅滴加并覆蓋組織染色10s，95%乙醇脫水2次，每次3min，100%乙醇脫水2次，每次3min，二甲苯I和二甲苯Ⅱ透明各10min），中性樹膠封片后，晾干鏡檢。

1.4.4.小鼠空腸免疫組化染色[26].

1.4.4.1.切片、烤片、脫蠟水化同H&E染色，將得到的切片同切片架一起放入pH6.0的0.01mol/L的檸檬酸鈉溶液中，先用微波爐高溫加熱至沸騰后調(diào)低火力保持微沸狀態(tài)，拿出后冷卻至室溫。

1.4.4.2.除去內(nèi)源性過氧化物酶：將載玻片上的ddH2O快速擦干，用免疫組化筆將組織圈住并滴入3%的過氧化氫溶液，放入濕盒中室溫避光孵育10min。

1.4.4.3.透膜：用蒸餾水將片子洗滌多次，放入5%. Triton.X-100/PBS(PBST)中室溫透膜20min，然后用PBS清洗2次，每次5min。

1.4.4.4.封閉：擦干載玻片的PBS，在免疫組化筆圈好的組織上加入通用型免疫染色封閉液完全覆蓋組織,放入濕盒室溫孵育1h。

1.4.4.5.加一抗：利用一抗稀釋液按比例稀釋一抗，甩去組織上的封閉液，滴入稀釋的一抗，將片子放入濕盒中4℃孵育過夜。

1.4.4.6.從4℃冰箱中將濕盒取出，恢復(fù)至室溫，甩去一抗并將切片放入切片架中，用0.1%Tween-20PBST溶液清洗5min，PBS清洗2次，每次5min。

1.4.4.7.加入C液，室溫孵育30min，用0.1%Tween-20PBST溶液清洗5min，PBS清洗2次，每次5min。

1.4.4.8.加入DAB溶液進(jìn)行顯色，出現(xiàn)棕色信號(hào)后用蒸餾水終止顯色，用蘇木精染核5min，自來水返藍(lán)5min。

1.4.4.9.脫水后中性樹膠封片，并用光學(xué)顯微鏡觀察拍片。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)計(jì)數(shù)方法

每只小鼠空腸組織切片H&E染色和免疫組化染色后，用高級(jí)正置熒光顯微鏡觀察并多視野拍下照片后，利用Photoshop軟件對(duì)絨毛長(zhǎng)度、隱窩深度進(jìn)行計(jì)量，并對(duì)Ki67對(duì)應(yīng)的陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)。其中對(duì)絨毛長(zhǎng)度和隱窩深度的測(cè)量要求每只小鼠空腸的絨毛隱窩數(shù)量不少于120個(gè)，每組小鼠的絨毛隱窩數(shù)量不少于1.000個(gè)；對(duì)Ki67的計(jì)數(shù)要求是每只小鼠不少于50個(gè)絨毛隱窩數(shù)量，每組總量不少于400個(gè)；對(duì)MUC2的計(jì)數(shù)要求是每只小鼠不少于80個(gè)絨毛隱窩數(shù)量，每組總量不少于650個(gè)。

1.6 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 益生菌對(duì)健康小鼠體重的影響

圖1 0～21d小鼠體重增加量

如圖1所示，對(duì)5組小鼠分別灌胃各組對(duì)應(yīng)的益生菌21d后發(fā)現(xiàn)，灌胃益生菌的小鼠體重增加量與生理鹽水組相比較沒有顯著性差異，但是在圖1中可以看出5組益生菌組的小鼠體重增加量明顯高于生理鹽水組，可以說明益生菌對(duì)健康小鼠體重增加有一定的影響。

2.2 益生菌對(duì)腸道絨毛長(zhǎng)度和隱窩深度的影響

對(duì)小鼠空腸腸段進(jìn)行H&E染色后，對(duì)每組中每只小鼠都利用熒光顯微鏡進(jìn)行多角度多方位的拍照觀察，并測(cè)量計(jì)算出每組小鼠絨毛高度的平均變化值及隱窩深度的平均變化值，部分樣品染色效果及絨毛隱窩平均值的變化如圖2所示。

如圖2所示，灌胃益生菌后，試驗(yàn)組小鼠的絨毛長(zhǎng)度與生理鹽水組相比較均沒有顯著的變化，與陽性對(duì)照LcS組相比較，只有灌胃益生菌L9的小鼠絨毛長(zhǎng)度有顯著增長(zhǎng)。試驗(yàn)組小鼠的隱窩深度與生理鹽水組相比較，除了FDB86組以外，其他3組小鼠的隱窩都顯著變淺，與陽性對(duì)照LcS組相比，只有L9組無顯著差異。V/C值可以綜合反映小鼠腸道的功能狀況，與生理鹽水組相比較，除了FDB86組以外，其他3組的V/C值顯著升高，有顯著差異，且L9組與對(duì)照組顯著性差異最大，L9組與陽性對(duì)照LcS組比較沒有顯著性差異，表明除FDB86組以外，L9、A6、BBMN68組均增加了腸道上皮細(xì)胞的數(shù)量，加大了腸道的吸收面積，進(jìn)而提高了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用率，其中L9組效果最為明顯，效果和陽性對(duì)照組沒有明顯差異。由此可見，在V/C指標(biāo)上面，實(shí)驗(yàn)室益生菌菌株L9的效果最好，其次是益生菌菌株A6和菌株BBMN68，最后是益生菌菌株FDB86。Li等人的試驗(yàn)同樣證明V/C值的升高，證明腸道吸收能力的增強(qiáng)[27]。由此試驗(yàn)結(jié)果可以推斷出L9對(duì)健康小鼠腸道的吸收能力有增強(qiáng)作用。

圖2 益生菌對(duì)小鼠腸道絨毛長(zhǎng)度及隱窩深度的影響

2.3 益生菌對(duì)腸上皮細(xì)胞增殖、分化的影響

對(duì)小鼠空腸腸段進(jìn)行免疫組化染色后，對(duì)每組中每只小鼠都利用熒光顯微鏡多角度多方位的拍照觀察，并統(tǒng)計(jì)每組小鼠腸道絨毛及隱窩上Ki67的表達(dá)量，部分樣品染色效果及Ki67的表達(dá)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖3所示。

圖3 益生菌對(duì)Ki67表達(dá)量的影響

圖4 益生菌對(duì)MUC2表達(dá)量的影響

如圖3所示，灌胃益生菌后，空腸中Ki67陽性細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，這與隱窩變淺的結(jié)果相一致，隱窩變淺標(biāo)志著細(xì)胞成熟率的上升，分泌功能的增強(qiáng)。從圖3可知，益生菌L9對(duì)Ki67數(shù)量的影響最有效，與陽性對(duì)照組LcS組相比較無顯著差異，而益生菌FDB86組與生理鹽水組無顯著差異。Ki67是分裂細(xì)胞核的代表物，其數(shù)量與隱窩深度相關(guān)，在圖2～3的試驗(yàn)結(jié)果中隱窩深度變淺與Ki67的數(shù)量減少是相一致的?？梢?，益生菌與小鼠腸道的成熟率密切相關(guān)，在Ki67指標(biāo)方面，實(shí)驗(yàn)室益生菌菌株L9的益生效果最好，其次是菌株BBMN68和菌株A6，最后是菌株FDB86。

對(duì)小鼠空腸腸段進(jìn)行免疫組化染色后，對(duì)每組中每只小鼠都利用熒光顯微鏡多角度多方位的拍照觀察，并統(tǒng)計(jì)每組小鼠腸道絨毛及隱窩上MUC2的表達(dá)量，部分樣品染色效果及MUC2的表達(dá)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖4所示。

如圖4所示，用益生菌對(duì)健康小鼠灌胃21d后，L9組、BBMN68組小鼠空腸組織上的黏蛋白MUC2的數(shù)量顯著增加，與陽性對(duì)照組LcS組相比較無顯著差異，表明副干酪乳桿菌L9組和BBMN68組的益生菌在腸道黏蛋白分泌量上與LcS組沒有差異，而益生菌A6組和FDB86組與陽性對(duì)照組LcS有顯著差異，與生理鹽水組沒有差異，表明此兩組菌在空腸腸段中黏蛋白的分泌量沒有L9及BBMN68兩株益生菌效果好。因此，在MUC2指標(biāo)上實(shí)驗(yàn)室益生菌菌株L9和BBMN68效果最好。

3 結(jié)論

綜上所述，實(shí)驗(yàn)室中副干酪乳桿菌L9、動(dòng)物雙歧桿菌A6、唾液乳桿菌FDB86、長(zhǎng)雙歧BBMN68這4種菌株中與陽性對(duì)照組干酪乳桿菌代田菌LcS在本實(shí)驗(yàn)所測(cè)的指標(biāo)中相比較，得出副干酪乳桿菌L9對(duì)健康小鼠腸道形態(tài)的影響與LcS組最為相似，在絨毛和隱窩的比值、Ki67及MUC2的表達(dá)量上沒有差異，故可以推測(cè)出，副干酪乳桿菌L9對(duì)健康小鼠腸道形態(tài)發(fā)育的影響與商業(yè)菌株LcS的生理功能相一致，具有繼續(xù)研發(fā)的價(jià)值，為后續(xù)探究副干酪乳桿菌L9對(duì)健康小鼠腸道影響的機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。

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Effects of Probiotics on Intestinal Morphology in Healthy Mice

WANG Xiao-cheng1, SUN Ya-nan2, REN Fa-zheng2, ZHANG Ming3, LIU Zuo-wen4, TONG Qi-gen1
(1. Beijing University of Agriculture, Beijing 102206; 2. Key Laboratory of Functional Dairy, Ministry of Education & Beijing Government, Beijing 100083; 3. School of Food and Chemical Engineering, Beijing Technology and Business University, Beijing 100024; 4. Fu Cheng Wu Feng Food Corporation Limited of Hebei, Sanhe 065200)

To evaluate the effect of probiotics on intestinal morphology in healthy mice, forty-eight three weeks old BalB/C male mice were randomly divided into 6 groups: negative control saline group, Lactobacillus paracasei L9 group, Bifidobacterium animalis A6 group, Bifidobacterium longum BBMN68 group, Lactobacillus salivarius FDB86 group ,positive control Lactobacillus casei Shirota (LcS) group, with 0.2mL/d dose was continuously administered to stomach for 21d and the mice sacrificed. Then using immunohistochemical method, the length of the jejunal villi and crypt depth, and intestinal epithelial cell proliferation (Ki67 nuclear antigen)cell differentiation (MUC2 sticky protein)were determined. Compared with the negative control saline group, Lactobacillus paracasei L9 had the most significant effect on intestinal morphology in healthy mice. Compared with the positive control Lactobacillus casei Shirota (LcS) group, Lactobacillus paracasei L9 was positively correlated with the positive control group. The results are consistent. The results showed that probiotics had an important effect on intestinal morphology in healthy mice. Lactobacillus paracasei L9 had a significant effect on the morphological development of mice in four probiotics.

Probiotics; Intestinal villi; Intestinal crypts

TS252.1

A

1004-4264（2017）06-0049-06

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.06.012

2017-05-20

王曉成(1989-)，女，碩士，主要從事功能性乳品相關(guān)研究。

仝其根(1962-)，男，教授，碩士，主要從事蛋品、食品添加劑、農(nóng)產(chǎn)品加工等科研與教學(xué)工作。