孫士梅，劉 暢，牛 熙，黃世會(huì)，王嘉福*，冉雪琴*

(1．貴州大學(xué) 農(nóng)業(yè)生物工程研究院，貴州 貴陽 550025；2．貴州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

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·研究報(bào)告·

基于CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建豬miR-136基因編輯載體

孫士梅1，劉 暢1，牛 熙1，黃世會(huì)2，王嘉福1*，冉雪琴2*

(1．貴州大學(xué) 農(nóng)業(yè)生物工程研究院，貴州 貴陽 550025；2．貴州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

為了闡明microRNA對(duì)豬產(chǎn)仔數(shù)的調(diào)節(jié)機(jī)制，采用CRISPR/Cas 9技術(shù)構(gòu)建針對(duì)豬miR-136的基因編輯表達(dá)載體。通過實(shí)驗(yàn)，在miR-136基因成熟區(qū)及其下游設(shè)計(jì)兩個(gè)單鏈引導(dǎo)RNA(sgRNA)，合成4條磷酸化的單鏈DNA寡核苷酸，復(fù)性后形成兩條帶粘性末端的雙鏈寡核苷酸片段，插入線性化的載體pX462的BpiI酶切位點(diǎn)處，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，經(jīng)測序確認(rèn)，得到兩個(gè)編輯表達(dá)載體pX462-miR-136-1和pX462-miR-136-2。構(gòu)建了兩個(gè)編輯miR-136基因的表達(dá)載體，為豬繁殖力的調(diào)控研究奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

豬；CRISPR/Cas 9技術(shù)；miR-136基因；sgRNA；基因編輯

CRISPR/Cas9技術(shù)是一種新型的基因編輯技術(shù)。1987年，日本大阪大學(xué)研究人員首次發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌堿性磷酸酶基因的編碼區(qū)附近含有簡單重復(fù)序列組成的特殊DNA序列，在單個(gè)重復(fù)序列之間還插入了間隔序列(space DNA)[1]。隨后發(fā)現(xiàn)這種間隔成簇短回文重復(fù)序列存在于大部分細(xì)菌和古細(xì)菌中，于2002年被正式命名為“CRISPR/Cas”系統(tǒng)。Cas9是Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)新研發(fā)的介導(dǎo)目標(biāo)DNA切割的核酸酶[2]。2012年，來自霍華德·休斯醫(yī)學(xué)研究所的研究人員發(fā)現(xiàn)Cas9蛋白是在crRNA(CRISPR RNA)與tracrRNA(trans-activating chimeric RNA)配對(duì)形成的RNA異二聚體的介導(dǎo)下切割目標(biāo)DNA，他們將這種RNA異二聚體改造為融合成一條sgRNA，以指導(dǎo)Cas9蛋白對(duì)靶DNA序列的剪切，從而發(fā)展出了CRISPR/Cas9技術(shù)[3]。CRISPR是一種來自細(xì)菌降解入侵的病毒DNA或外源DNA的免疫機(jī)制。在該機(jī)制中，Cas蛋白含有兩個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域，可以分別切割兩條DNA鏈。一旦與crRNA和tracrRNA結(jié)合形成復(fù)合物，Cas蛋白發(fā)揮核酸酶活性對(duì)復(fù)合物中的DNA進(jìn)行切割，造成DNA雙鏈斷裂，從而使入侵的外源DNA降解[4]。該技術(shù)已經(jīng)被運(yùn)用于構(gòu)建斑馬魚基因敲除細(xì)胞系[5]和小鼠動(dòng)物模型[6]。

MicroRNA是一類非編碼的單鏈小RNA，長度21-25 nt，由70-90 nt并具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈前體RNA(pre-miRNA)經(jīng)過Dicer酶的加工形成，通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與靶mRNA分子的3′-端非編碼區(qū)(3′-untranslated region，3′-UTR)結(jié)合，進(jìn)而抑制mRNA的后期翻譯[7]。MicroRNA在繁殖相關(guān)的基因表達(dá)、細(xì)胞分化等生命活動(dòng)中起重要的調(diào)控作用。

我們?cè)谘芯控i基因組重測序數(shù)據(jù)中，從7號(hào)染色體132018348-132081671位置發(fā)現(xiàn)一個(gè)大片段的缺失，經(jīng)基因注釋其中包含miR-136基因。研究發(fā)現(xiàn)miR-136的靶基因LHR等對(duì)動(dòng)物的睪丸和卵巢功能起作用[8，9]。為了探索miR-136對(duì)豬的繁殖力是否具有調(diào)節(jié)作用，本文應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建豬miR-136的基因編輯表達(dá)載體。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒與菌株 CRISPR/Cas9n質(zhì)粒pSpCas9n(BB)-2A-Puro (pX462) V2.0(#62987)購自Addgene公司，質(zhì)粒圖譜可于http：//www.addgene.org/62987/網(wǎng)站查詢。感受態(tài)細(xì)胞DH5α由貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏菌株。

1.1.2 試劑 Fast DigestBpiI、FastAP、10×FastDigest Buffer(Green)購自Thermo 公司；Plasmid Safe exonuclease、10×Plasmid Safe Buffer、10 mmol/L ATP購自Epicentr公司：2×T4Ligation Buffer、T4DNA ligase購自Promega公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。1.1.3 引物合成與測序 寡鏈核苷酸(oligo)DNA和引物合成以及測序由上海英濰捷基有限公司完成。1.2 方法

1.2.1 sgRNA oligo序列的設(shè)計(jì) 根據(jù)http：//www.mirbase.org/網(wǎng)站確定miR-136基因序列(圖1)；根據(jù)http：//crispr.mit.edu/網(wǎng)站設(shè)計(jì)在miR-136基因序列的成熟區(qū)和前體區(qū)設(shè)計(jì)sgRNA序列。sgRNA設(shè)計(jì)的原則：靶點(diǎn)前面為轉(zhuǎn)錄起始信號(hào)G，靶點(diǎn)的后面為PAM序列NGG，在其兩端加上酶切位點(diǎn)；根據(jù)Target Sequence Cloning Protocol標(biāo)準(zhǔn)，在每條sgRNA序列F鏈的5′端添加CACC，R鏈的5′端添加AAAC，與pX462質(zhì)粒經(jīng)BpiI酶切后形成的粘性末端互補(bǔ)。如F鏈的5′端第一個(gè)堿基不是G，則在5′端CACC下游添加一個(gè)G，相應(yīng)地R鏈的3′端再增加一個(gè)C(表1)。

表1 miR-136 sgRNA oligo和檢測引物序列

注：oligo序列上游的酶切位點(diǎn)用小寫字母表明，添加的堿基G和C加粗并下劃線。

圖1 miR-136基因前體序列

Fig.1 miR-136 gene precursor sequence

注：下劃線的堿基是miR-136成熟區(qū)

1.2.2 重組質(zhì)粒pX462-miR136-1和pX462-miR136-2的構(gòu)建 用BpiI對(duì)pX462質(zhì)粒進(jìn)行酶切，瓊脂糖凝膠電泳分離，膠回收線性化的載體。對(duì)oligo1、oligo2進(jìn)行磷酸化修飾和退火。用T4DNA連接酶將線性的pX462載體分別與退火后的oligo1、oligo2連接，反應(yīng)條件：37℃水浴30 min，16℃連接6-8 h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，在含氨芐青霉素抗性的LB固體平板上篩選克隆。在pX462載體插入位點(diǎn)的外圍設(shè)計(jì)一對(duì)引物UpX462和DpX462(表1)，用于篩選陽性菌落。挑取陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，測定插入片段的堿基序列。

圖2 重組質(zhì)粒pX462-miR136的構(gòu)建流程

注：A是oligo1磷酸化和退火得到的插入片段；B是oligo2磷酸化和退火得到的插入片段；C是插入片段與線性的pX462載體連接的模式圖；D是構(gòu)建的重組質(zhì)粒模式圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 oligo1、oligo2的磷酸化和退火

合成oligoF1/R1、oligoF2/R2時(shí)分別在單鏈DNA的5’端增加了磷酸基團(tuán)修飾。兩條單鏈以1∶1比例混合，在90℃下孵育10 min，室溫下自然冷卻復(fù)性1～2 h。得到雙鏈的寡核酸片段oligo1、oligo2，瓊脂糖電泳檢測，條帶與預(yù)期大小相符(圖3)。

圖3 雙鏈的寡核酸片段oligo1、oligo2的檢測

注：M為DNA分子量；1泳道是oligo1退火得到的目的片段；2泳道是oligo2退火得到的目的片段。

2.2 pX462質(zhì)粒酶切

質(zhì)粒pX462上有BpiI(BbsI)酶切位點(diǎn)(圖4)，應(yīng)用BpiI酶切斷質(zhì)粒并去磷酸化，得到線性化的載體。瓊脂糖電泳檢測約為9 kb，與預(yù)期大小一致(圖5)。

圖4 pX462質(zhì)粒圖譜

注：箭頭是BbsI的識(shí)別位點(diǎn)。

圖5 pX462質(zhì)粒BbsI酶切鑒定

注：M為DNA分子量；1泳道是pX462質(zhì)粒；2、3泳道是pX462酶切。

2.3 重組質(zhì)粒pX462-miR136-1和pX462-miR136-2構(gòu)建

重組質(zhì)粒pX462-miR136的構(gòu)建流程如圖2所示，按3∶1的比例分別將得到的一對(duì)雙鏈的寡核酸片段與線性化載體pX462連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，以UpX462/DpX462引物進(jìn)行PCR檢定，得到2#與4#克隆擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致的目的片段(圖6)。經(jīng)測序驗(yàn)證(圖7、8)，在重組質(zhì)粒的BpiI酶切位點(diǎn)處插入了oligo1和oligo2片段，方向和堿基序列與預(yù)期一致，證實(shí)oligo1、oligo2正確插入了pX462質(zhì)粒中，得到重組質(zhì)粒pX462-miR136-1和pX462-miR136-2。

圖6 重組質(zhì)粒菌落PCR鑒定

注：M為DNA分子量；1泳道是pX462質(zhì)粒；2泳道是pX462-miR136-1；4泳道是pX462-miR136-2；3、5、6、7泳道陰性克隆。

圖7 重組質(zhì)粒pX462 -miR-136-1測序結(jié)果

注：方框是插入的正確片段

圖8 重組質(zhì)粒pX462 -miR-136-2測序結(jié)果

注：方框是插入的正確片段

3 結(jié)論與討論

本文應(yīng)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建了miR-136基因編輯的表達(dá)載體。應(yīng)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)以實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的敲除，選擇靶基因的識(shí)別序列(sgRNA識(shí)別序列)是第一步。根據(jù)II型CRISPR/Cas9系統(tǒng)的生物學(xué)性質(zhì)，目標(biāo)基因的識(shí)別序列需要是一段20 bp左右的DNA序列，在序列末端緊鄰PAM三聯(lián)核苷酸結(jié)構(gòu)(NGG或者NAG，N代表任何堿基)[10]。本文根據(jù)miRNA的作用機(jī)理，按照靶點(diǎn)的設(shè)計(jì)原則，選擇miR-136成熟區(qū)種子序列與前體序列兩個(gè)位置[11]，設(shè)計(jì)兩條sgRNA，其靶點(diǎn)序列的間距是0～20 bp[12]。

Cas9核酸內(nèi)切酶有HNH和RuvC兩個(gè)活性位點(diǎn)，切割后斷裂雙鏈DNA，誘發(fā)基因組DNA啟動(dòng)同源重組或非同源末端連接機(jī)制進(jìn)行DNA雙鏈的修復(fù)，修復(fù)過程中可能產(chǎn)生堿基的插入或缺失，改變基因的結(jié)構(gòu)引起突變[13]。CRISPR/Cas9的特異性與跟sgRNA配對(duì)且靠近PAM處的7～12 bp有關(guān)，因此CRISPR/Cas9的靶向特異性非常低[14]。Ran等將Cas9在RuvC催化位點(diǎn)進(jìn)行了突變，改造成在sgRNA互補(bǔ)鏈制造單鏈切口的切口酶(Cas9n)，由一對(duì)sgRNA分別引導(dǎo)來實(shí)現(xiàn)靶位點(diǎn)的切割，此方法能顯著提高基因的敲除效率[15]。

本研究選用改良的pX462質(zhì)粒，該質(zhì)粒是為含U6啟動(dòng)子的sgRNA骨架表達(dá)載體，表達(dá)具有Cas9 D10A切口酶突變的Cas9n(單鏈切口的核酸酶Cas9)。在酶切pX462質(zhì)粒時(shí)，應(yīng)用20 uL酶切體系，加入2IU酶(BbsI)，10分鐘的效果最佳，與插入片段進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化時(shí)效率比較高。成功構(gòu)建的兩個(gè)重組表達(dá)載體pX462-miR-136-1和pX462-miR-136-2為下一步轉(zhuǎn)染豬繁殖細(xì)胞系中奠定了基礎(chǔ)。

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Construction of Gig miR-136 Gene Editing Vector Based on CRISPR/Cas9 Technique

SUNShi-mei1，LIUChang1，NIUXi1，HUANGShi-hui2，WANGJia-fu1*，RANXue-qin2*

(1.InstituteforAgriculturalBioengineeringofGuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China; 2.FacultyofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China)

The present paper aims to explore the molecular mechanism of microRNA on the litter size of pig. The expressed vector to edit the miR-136 gene was constructed using the clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) and associated nuclease Cas9 (CRISPR/Cas9) technique. A pair of single guide RNAs (sgRNA) were designed at the miR-136 gene mature sequence and its downstream location based on the precursor of pig miR-136. Four single DNA oligonucleotides were synthesized with a phosphorylation on each strand of the 5`-end, and annealed into two double-strand oligo fragments: oligo 1 and oligo 2. Both of these oligos were inserted into theBpiIsite of plasmid pX462, respectively. After transforming into competent DH5α, the sequences of inserts were confirmed for the two recombinant plasmids as pX462-miR-136-1 and pX462-miR-136-2. Two expression vectors for miR-136 gene editing were constructed, which would be useful for the research of fecundity in pig.

pig; CRISPR/Cas9 technique; miR-136 gene; sgRNA; gene editing

2017-03-08；

2017-05-10

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)課題(2013AA102503)；貴州省農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目(黔科合NY[2013]3073號(hào))；貴州省“百”層次創(chuàng)新型人才項(xiàng)目(黔科合人才2016-4012號(hào))；國家自然科學(xué)基金(31672390)。

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

1008-0457(2017)04-0009-04 國際

10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2017.04.002

*通訊作者：王嘉福(1962-)，男，教授，主要研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)，E-mail：jfwang@ gzu.edu.cn； 冉雪琴(1967-)，女，教授，主要研究方向：動(dòng)物生理與分子生物學(xué)；E-mail：xqran@ gzu.edu.cn。