張曉巖，張先鈞，賈煒，蒲小燕，王海燕，梁宏，張杰(青海大學醫(yī)學院，西寧810016)

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西紅花苷預處理對急性高海拔低氧下大鼠海馬組織NF-κB及血清TNF-α的影響

張曉巖，張先鈞，賈煒，蒲小燕，王海燕，梁宏，張杰
(青海大學醫(yī)學院，西寧810016)

目的 觀察西紅花苷預處理對急性高海拔低氧條件下大鼠腦海馬組織核轉錄因子-κB(NF-κB)表達及血清腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平的影響。方法 將96只大鼠隨機分為對照組和觀察組各48只，觀察組給予西紅花苷50 mg/(kg·d)肌內注射，對照組給予等量生理鹽水肌內注射。連續(xù)給藥3 d后運至高海拔低氧環(huán)境，在第1、3、5、7天取材。取大鼠腦海馬組織，采用RT-PCR方法檢測NF-κB mRNA表達，免疫組化法檢測NF-κB表達；取大鼠頸動脈組，采用ELISA法檢測血清TNF-α水平。結果 觀察組海馬組織NF-κB mRNA及蛋白表達在第1、3、5天明顯低于對照組(P均<0.05)；觀察組血清TNF-α水平在第1、3、5天明顯低于對照組(P均<0.05)。結論 在急性高海拔低氧條件下,西紅花苷提前干預能通過下調大鼠腦海馬組織NF-κB表達及血清TNF-α水平，減輕炎性反應，發(fā)揮保護腦海馬神經(jīng)元的作用。

西紅花苷；高海拔；低氧；腦海馬組織；核轉錄因子-κB；腫瘤壞死因子α；大鼠

腦組織對缺血缺氧非常敏感，低氧條件可使腦海馬神經(jīng)元存活數(shù)量下降、凋亡增加[1]。高海拔地區(qū)低氣壓和低氧分壓是一個獨特的生態(tài)環(huán)境因素，嚴重影響機體正常的生理機能。急性低氧條件下，大腦急性缺氧可造成腦組織低氧損傷，引起不可逆的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷。藏紅花為鳶尾科植物番紅花的干燥柱頭，具有活血化瘀、涼血解毒、解郁安神、抗抑郁等功效。西紅花苷是藏紅花主要有效成分，是一類水溶性的類胡蘿卜素，具有較強的抗氧化活性[2]。大量研究證實，西紅花苷具有抗凋亡[3]、抗神經(jīng)性炎癥和神經(jīng)細胞退行性變[4]、保護缺血性腦損傷、改善學習記憶障礙[5，6]等作用。西紅花苷預處理可保護腦神經(jīng)元在低氧條件下的損傷。2016年7月，我們采用西紅花苷提前干預，觀察急性高海拔低氧條件下大鼠腦海馬組織核轉錄因子-κB(NF-κB)活性及血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平的變化，為其防治急性低氧腦損傷奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級SPF級雄性SD大鼠96只，體質量180～200 g，由北京大學實驗動物中心提供，適應性喂養(yǎng)1周。西紅花苷購自Sigma公司；小鼠抗大鼠NF-κB p56一抗購自Abcam公司；山羊抗小鼠二抗及辣根過氧化物酶顯色試劑盒購自武漢博士德公司；總RNA提取試劑盒、DNA MarkerⅠ、瓊脂糖購自TIANGEN公司；TNF-α ELISA試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 動物分組及處理 將大鼠隨機分為觀察組和對照組各48只，在青海省西寧市(海拔2 200 m)分別給予西紅花苷50 mg/(kg·d)、等量生理鹽水后肢肌內注射。連續(xù)給藥3 d后運至高海拔低氧環(huán)境(青海省果洛州甘德縣，海拔4 200 m)飼養(yǎng)。兩組于第1、3、5、7天各取12只大鼠，25%烏拉坦5 mL/kg腹腔注射麻醉，頸動脈取血，3 500 r/min離心10 min，取上清液，-20 ℃保存，用于檢測血清TNF-α；然后將大鼠斷頭處死，快速取出全腦，冰上剝離海馬組織，置于液氮中保存，用于檢測NF-κB mRNA和蛋白。

1.3 海馬組織NF-κB mRNA檢測 采用RT-PCR方法。采用TRIzol法提取海馬組織總RNA，逆轉錄合成cDNA。PCR擴增引物由上海生工生物工程有限公司合成。NF-κB p56上游引物5′-TGCCTCCAGTGAGAAGAACA-3′,下游引物5′-GCACCAGAAGTCCAGGGTTA-3′,引物長度302 bp；β-actin上游引物5′-CGCGAGTACAACCTTCTTGC-3′,下游引物5′-CAACACAGCCTGGATGGCTA-3′,引物長度480 bp。反應體系：模板2 μg，引物各1 μL，Mix 25 μL，用ddH2O補至50 μL。反應條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min，72 ℃ 5 min，4 ℃ 1 h，共30個循環(huán)。取反應產物行瓊脂糖凝膠電泳，BIO-RAD凝膠成像儀拍攝圖片，Quantity one軟件進行數(shù)據(jù)處理，以NF-κB p56與內參β-actin的比值計算其相對表達量。

1.4 海馬組織NF-κB蛋白檢測 采用免疫組化法。將大鼠海馬組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，冠狀面切片，常規(guī)烤片、脫蠟、水化及抗原修復。加入3% H2O2室溫孵育10 min，PBS沖洗3遍；5%胎牛血清封閉10 min，甩去余液；加一抗，37 ℃孵育1 h，PBS沖洗3遍；加辣根過氧化物酶標記的二抗，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3遍。DAB顯色，自來水沖洗干凈后過蒸餾水；蘇木素復染，自來水沖洗，脫水透明，樹膠封片。在顯微鏡下找到海馬CA1區(qū)，400倍下留取照片。以神經(jīng)細胞核或胞質呈棕黃色為陽性細胞，每張取3個視野，用Leica QWinV3圖像分析軟件測IOD值。

1.5 血清TNF-α檢測 采用ELISA法。將動脈血上清液按100 μL/孔加入相應孔中，室溫孵育2 h。然后洗板5次，加入生物素化抗體工作液100 μL/孔，室溫孵育1 h。洗板5次，后加入酶結合物工作液100 μL/孔，避光室溫孵育20 min。后洗板5次，再滴加入顯色劑100 μL/孔，避光室溫孵育20 min。最后加入終止液50 μL/孔，混勻后即刻測量A450值。

2 結果

2.1 兩組海馬組織NF-κB mRNA表達比較 觀察組第1、3、5、7天海馬組織NF-κB mRNA的相對表達量分別為0.11±0.03、0.12±0.02、0.20±0.02、0.23±0.02，對照組分別為0.35±0.02、0.34±0.03、0.28±0.02、0.24±0.03，觀察組第1、3、5天明顯低于對照組(P均<0.05)。對照組第5、7天NF-κB mRNA相對表達量均低于第1、3天(P均<0.05)，觀察組第5、7天NF-κB mRNA相對表達量高于第1、3天(P均<0.05)。

2.2 兩組海馬組織NF-κB蛋白表達比較 觀察組第1、3、5、7天海馬組織NF-κB蛋白的IOD值分別為758.04±38.83、774.98±37.81、1 642.01±272.57、1 893.57±254.06，對照組分別為3 507.46±317.96、3 432.57±446.68、2 688.62±246.95、2 053.08±226.13，觀察組第1、3、5天NF-κB相對表達量均低于對照組(P均<0.05)。

2.3 兩組血清TNF-α水平比較 見表1。觀察組第1、3、5天血清TNF-α水平均低于對照組(P均<0.05)。對照組第5、7天血清TNF-α水平低于第1、3天(P均<0.05)。觀察組第1、3、5天血清TNF-α水平呈逐漸上升趨勢，但均低于對照組相應時間點(P均<0.05)。

表1 各組血清TNF-α水平比較

注：與對照組同期比較，*P<0.05；與同組其他時間比較，#P<0.05。

3 討論

神經(jīng)系統(tǒng)在高海拔低氧的特殊環(huán)境中形態(tài)結構及功能將會發(fā)生很大變化，而海馬神經(jīng)細胞極易受到低氧環(huán)境的損傷，其中多種促炎癥因子發(fā)揮了極其重要的作用。西紅花作為傳統(tǒng)藏藥材，主治“心憂郁積，氣悶不散，瘀血”。近年來，其在高原環(huán)境對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥理作用逐漸引起人們重視。西紅花苷是藏紅花最主要的活性成分，具有明顯的抗氧化活性，能夠抑制活性氧的產生，是一種神經(jīng)細胞的強抗氧化劑[8，9]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，西紅花苷可以通過增加海馬組織胰島素樣生長因子1表達，增強高海拔低氧條件下大鼠的學習記憶能力[7]。

NF-κB是與炎癥及凋亡有關的重要轉錄因子，活化后促使機體效應細胞大量釋放促炎細胞因子，導致組織發(fā)生過度炎癥反應和組織損傷的關鍵環(huán)節(jié)[10]。NF-κB可以被多種刺激因素(如應激、炎癥、氧自由基、低氧、紫外線等)激活，其主要作用是調控編碼多種細胞因子參與免疫、炎癥、細胞凋亡等生理和病理過程中的基因表達調控。當細胞處于靜息狀態(tài)時，NF-κB與NF-κB抑制蛋白(IκB)結合成p65蛋白/p50的異源二聚體或p65的同型二聚體，并以失活狀態(tài)存在于細胞的胞質中。IκB和NF-κB以蛋白-蛋白相互作用，并掩蓋NF-κB/Rel蛋白的核定位信號，使NF-κB無法向細胞核內移動。而當細胞受缺氧刺激時，IκB激酶(IKK)在氧化應激過程中被激活，可能通過IKKγ/NF-κB必需調節(jié)蛋白(NEMO)與磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶(AKT)途徑交聯(lián)而使ATM磷酸化，從而誘導NF-κB磷酸化，觸發(fā)IκB多泛素化，并通過降解泛素-蛋白酶，導致NF-κB被活化，p65/p50與IκB解離而轉入核內與特異的啟動子結合，從而調控相關基因的表達[11,12]。NF-κB誘導眾多細胞因子如IL-1、IL-6和TNF-α等高表達。研究[13]發(fā)現(xiàn)，腦缺血能激活NF-κB，繼而促進多種炎癥因子及凋亡基因的表達。本研究將大鼠用西紅花苷預處理后運至高海拔低氧環(huán)境，觀察大鼠腦海馬CA1區(qū)NF-κB p56表達，發(fā)現(xiàn)觀察組NF-κB p56蛋白和mRNA表達在第1、3、5天均低于對照組。這說明西紅花苷預處理能夠在第1、3、5天明顯下調急性低氧條件下大鼠海馬組織中NF-κB表達。

研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α是較早釋放的具有多種生物學效應的重要促炎細胞因子，在炎癥反應過程中可激活細胞因子級聯(lián)反應誘導白細胞介素和花生四烯酸代謝產物、氧自由基等合成，TNF-α在腦組織中被激活呈現(xiàn)高表達，具有神經(jīng)毒性，可以加速神經(jīng)細胞的死亡[14]。NF-κB能夠增強TNF-α基因轉錄，在某些細胞和組織中，NF-κB與TNF-α具有密切關系[15]。NF-κB是機體對TNF-α產生生理性反應得到的重要中介物，NF-κB激活后可以誘導TNF-α表達。本研究結果顯示，急性低氧條件可刺激TNF-α水平上升，而觀察組血清TNF-α水平在第1、3、5天明顯低于對照組。提示西紅花苷預處理能夠明顯下調急性低氧條件下大鼠血清TNF-α的表達。第7天兩組表達接近，可能是由于觀察組失去藥效導致。

綜上所述，急性高海拔低氧條件可明顯增加大鼠腦海馬組織NF-κB表達，提高血清TNF-α水平，導致海馬神經(jīng)損傷；而西紅花苷預處理可下調NF-κB活化與TNF-α表達，這可能是西紅花苷減輕腦急性低氧損傷的機制之一。

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國家自然科學基金資助項目(81260685)；青海省科技廳項目(2016-ZJ-708)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.26.009

R282.5

A

1002-266X(2017)26-0032-03

2016-12-05)