牛琛，張一楊，李金鳳，李瑩淑，李玉紅，田慎謙，王悅，馮福民(華北理工大學公共衛(wèi)生學院，河北唐山063000)

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·論著·

異煙肼對人肝細胞CYP1A1啟動子區(qū)甲基化的影響

牛琛，張一楊，李金鳳，李瑩淑，李玉紅，田慎謙，王悅，馮福民
(華北理工大學公共衛(wèi)生學院，河北唐山063000)

目的 觀察異煙肼對人肝細胞細胞色素P4501A1(CYP1A1)啟動子區(qū)CpG島甲基化的影響，探討異煙肼致肝細胞損傷的機制。方法 將肝細胞分為觀察組和對照組，觀察組分別加入200、400、800 μg/mL異煙肼，對照組加入同體積含DMSO的培養(yǎng)液。采用乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒檢測細胞培養(yǎng)上清液中的LDH水平來觀察細胞損傷情況，實時熒光定量PCR方法檢測細胞CYP1A1、DNA甲基轉移酶1(DNMT1)、DNMT3a、DNMT3b mRNA的相對表達量，酶聯免疫吸附法檢測細胞DNMT1、DNMT3a、DNMT3b蛋白水平，采用亞硫酸鹽修飾后測序法檢測CYP1A1啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)。結果 觀察組細胞培養(yǎng)上清液中的LDH水平均高于對照組，800 μg/mL異煙肼組最高(P均<0.05)。與對照組比較，觀察組隨異煙肼濃度升高，CYP1A1 mRNA表達呈先升高后降低趨勢，差異均有統計學意義(P均<0.05)；DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA和蛋白表達均隨異煙肼濃度升高而升高，800 μg/mL異煙肼組高于其他組(P均<0.05)。細胞CYP1A1基因啟動子區(qū)甲基化率為82.9%，高于對照組的79.6%(P<0.05)。結論 異煙肼可導致肝細胞CYP1A1基因啟動子區(qū)高甲基化，進而引起肝細胞損傷。

異煙肼；藥物性肝損傷；細胞色素P4501A1;DNA甲基化；乳酸脫氫酶；DNA甲基轉移酶；人肝細胞

異煙肼(INH)是WHO推薦的標準抗結核一線藥物，臨床廣泛用于治療結核病。但長期用藥和不規(guī)范用藥均可引起肝臟損傷[1]。體內Ⅰ相、Ⅱ相反應參與了異煙肼的代謝過程，細胞色素P450(CYP450)是參與Ⅰ相反應的主要酶系[2]，在代謝過程中發(fā)揮重要作用[3]。CYP1A1是CYP450家族成員，CYP1A1基因啟動子區(qū)高甲基化可能在抗結核藥物性肝損傷的過程中發(fā)揮作用[8]。甲基化是表觀遺傳學的一部分，指由S-腺苷甲硫氨酸提供甲基，在DNA甲基轉移酶(DNMT)的作用下，將甲基轉移到胞嘧啶的過程[4]。基因啟動子區(qū)的甲基化能夠調控目的基因的表達[5]，從而影響疾病的發(fā)生發(fā)展。研究發(fā)現，甲基化作用與肝纖維化[6]、急慢性乙型肝炎[7]、肝癌[8]、脂肪肝[9]等疾病的發(fā)生發(fā)展有關。當細胞受到外界刺激時，細胞內乳酸脫氫酶(LDH)會進入細胞外，因此檢測細胞培養(yǎng)液中的LDH可反映細胞損傷[10]。DNMT是DNA甲基轉移酶，通過檢測細胞中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b表達可反映細胞的甲基化狀態(tài)。2016年10～11月，我們使用異煙肼處理人肝細胞，觀察細胞的損傷情況和細胞CYP1A1基因啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)，探討異煙肼致肝損傷的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝細胞HL-7702購自上海中科院。異煙肼、二甲基亞砜(DMSO)購自日本TCI公司，RPMI1640、胎牛血清、青霉素與鏈霉素分別購自CORNING、CLARK、BI公司，反轉錄試劑盒和SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒購自TaKaRa公司，乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒購自南京建成，Heraeus高速離心機，C1000 PCR擴增儀，熒光定量RCR儀。

1.2 細胞培養(yǎng)與分組處理 人肝細胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和鏈霉素、90% RPMI1640培養(yǎng)液于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞長滿后用0.25%胰蛋白酶消化傳代。取對數生長期細胞，消化懸浮，加入培養(yǎng)液制成1×105/mL的細胞懸液，接種到6孔板中。將細胞分為兩組，預培養(yǎng)24 h后，異煙肼組分別加入200、400、800 μg/mL異煙肼，每個濃度設6個復孔，對照組加入同體積含DMSO的培養(yǎng)液。培養(yǎng)6 h后收獲細胞。

1.3 細胞培養(yǎng)上清液中LDH水平檢測 取20 μL細胞培養(yǎng)上清液，使用LDH檢測試劑盒測定LDH活性。

1.4 細胞DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA檢測 采用實時熒光定量PCR方法。采用TRIzol法提取RNA，逆轉錄合成cDNA。逆轉錄反應條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 1 min。CYP1A1上游引物5′-CTCTTTGGAGCTGGGTTTGAC-3′，下游引物5′-GCTGTGGGGGATGGTGAA-3′；DNMT1上游引物5′-ACCTGGCTAAAGTCAAATCC-3′，下游引物5′-ATTCACTTCCCGGTTGTAAG-3′；DNMT3a上游引物5′-CAGCTTCCACGTTGCCTTCT-3′，下游引物5′-CATCTGCAAGCTGTCTCCCTTT-3′；DNMT3b上游引物5′-TTGGAATAGGGGACCTCGTGTG-3′，下游引物5′-AGAGACCTCGGAGAACTTGCCATC-3′；GAPDH上游引物5′-TCTCCCCTCCTCACAGTTGC-3′，下游引物5′-AAGCCGAGACGACGACAGAC-3′。PCR反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，共40個循環(huán)。以GAPDH基因為內參，目的基因的相對表達量采用目的基因校正相對表達量2-ΔΔCt公式進行計算。實驗重復3次。

1.5 細胞DNMT1、DNMT3a、DNMT3b蛋白檢測 采用酶聯免疫吸附法。取對數生長期細胞，加入細胞裂解液提取蛋白，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗體，用封板膜封住反應孔，37 ℃水溫育60 min。棄去液體，洗板。加入底物，37 ℃避光孵育15 min，加入終止液終止反應。于450 nm波長處測定各孔OD值。在Excel工作表中繪制標準曲線，以標準品濃度為橫坐標，對應OD值為縱坐標，繪制標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值。

1.6 CYP1A1基因啟動子區(qū)CpG島甲基化檢測 采用亞硫酸鹽修飾后測序(BSP)法。使用DNA提取試劑盒提取細胞DNA，委托上海生工生物工程公司使用甲基化測序分析軟件(QUMA)進行甲基化測序。

2 結果

2.1 兩組細胞培養(yǎng)上清液中LDH水平比較 200、400、800 μg/mL異煙肼組和對照組細胞培養(yǎng)上清液中LDH水平分別為(288.10±35.20)、(366.14±63.05)、(515.25±86.21)、(236.84±14.51)U/L。隨異煙肼濃度升高，LDH逐漸升高，800 μg/mL異煙肼組LDH水平高于其他各組(P均<0.01)。

2.2 兩組細胞DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA表達比較 見表1。與對照組比較，400、800 μg/mL異煙肼組DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA表達均升高(P均﹤0.05)，其中800 μg/mL異煙肼組DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA表達高于其他各組(P均﹤0.01)。

表1 兩組細胞DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA表達比較

注：與對照組比較，#P<0.05，*P<0.01。

2.3 兩組細胞DNMT1、DNMT3a、DNMT3b蛋白水平比較 見表2。與對照組比較，400、800 μg/mL異煙肼組DNMT1、DNMT3a、DNMT3b蛋白表達均升高(P均﹤0.05)，其中800 μg/mL異煙肼組DNMT1、DNMT3a、DNMT3b蛋白表達高于其他各組(P均﹤0.01)。

表2 各組細胞DNMT1、DNMT3a、DNMT3b蛋白表達比較

注：與對照組比較，#P<0.05，*P<0.01。

2.4 兩組細胞CYP1A1 mRNA表達比較 200、400、800 μg/mL異煙肼組細胞CYP1A1 mRNA相對表達量分別為1.15±0.51、0.78±0.12、0.52±0.19。與對照組的1.00±0.00相比，200 μg/mL異煙肼組CYP1A1表達升高(P<0.05)；400、800 μg/mL異煙肼組降低(P均<0.01)，800 μg/mL異煙肼組最低。

2.5 兩組細胞CYP1A1啟動子區(qū)CpG島甲基化水平比較 為了明確CYP1A1 mRNA表達是否受啟動子區(qū)的甲基化調控，本研究選取細胞損傷最嚴重、DNMT升高最明顯、CYP1A1 mRNA降低最明顯的800 μg/mL異煙肼組和對照組進行甲基化測序。結果顯示，對照組CYP1A1啟動子區(qū)甲基化率為79.6%，異煙肼組CYP1A1啟動子區(qū)甲基化率為82.9%，異煙肼組高于對照組(P<0.05)。

2.6 LDH與CYP1A1、DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA表達的相關性 相關性分析顯示，LDH與CYP1A1 mRNA表達呈負相關(r=-0.814，P<0.01)，與DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA表達呈正相關(r分別為0.661、0.815、0.475，P均<0.05)。

3 討論

研究發(fā)現，異煙肼可被CYP450家族代謝為有毒產物，導致肝臟損傷[11]。本研究顯示，向肝細胞中加入不同濃度異煙肼后，細胞培養(yǎng)液中的LDH水平均高于對照組，800 μg/mL異煙肼組最高，細胞損傷最嚴重。

胃癌、肺癌中DNMT呈高表達[12]。DNMT1不但能參與甲基化狀態(tài)的維持和非CpG位點從頭甲基化，還與甲基化的延伸有關；DNMT3a、DNMT3b主要參與到啟動子區(qū)甲基化修飾的過程中[13]。這三種DNMT的變化從側面反映了甲基化過程中的變化[14]。本研究顯示，隨著異煙肼作用濃度的升高，DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA和蛋白表達也隨之升高，提示DNMT活性升高可能會使甲基化的作用加強。相關性分析顯示，LDH與DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA表達呈正相關，提示細胞損傷越嚴重，DNMT在細胞內參與甲基化的作用越強。

CYP1A1是CYP450家族成員之一。CYP1A1與肺癌相關性的報道較多，但異煙肼引起肝損傷的報道較少，尤其是CYP1A1啟動子區(qū)甲基化與異煙肼致肝損傷的關系。CYP1A1作為CYP450酶系家族成員，在Ⅰ相反應中發(fā)揮重要作用，也是肝癌、子宮平滑肌瘤和食管癌的危險因素[15～17]。有研究[18]表明，將CYP1A1野生型小鼠和基因缺陷型小鼠暴露于高氧環(huán)境中，經過一段時間飼養(yǎng)后取肺組織檢測其損傷和炎性因子變化;結果顯示,CYP1A1缺陷型小鼠與野生型小鼠相比肺部組織和血管水腫加重并且炎性因子升高，說明CYP1A1基因缺陷型小鼠肺部更容易受到高氧誘導的損傷，提示CYP1A1缺失可能增加氧化應激的敏感性。本研究結果顯示，人肝細胞中CYP1A1 mRNA表達隨異煙肼濃度的升高呈先升高后降低的趨勢，說明高劑量異煙肼能夠降低CYP1A1表達。相關性分析結果顯示，LDH與CYP1A1的表達呈負相關，說明細胞損傷越嚴重CYP1A1 mRNA降低越明顯。另一方面，隨著DNMT表達升高，提示細胞中甲基化作用加強，而CYP1A1表達的降低又暗示可能受甲基化作用的調控。我們根據LDH、CYP1A1、DNMT1、DNMT3a、DNMT3b結果，選擇變化最明顯的800 μg/mL異煙肼組進行CYP1A1啟動子區(qū)甲基化測序。結果顯示，異煙肼組甲基化率為82.9%，高于對照組。說明異煙肼通過提高DNMT表達，增加CYP1A1啟動子區(qū)的甲基化。

綜上所述，異煙肼對人肝細胞具有損傷作用，高濃度異煙肼的損傷作用更強；隨著細胞損傷加重，DNMT表達隨之升高，提示異煙肼可改變細胞內的甲基化狀態(tài)；經過測序檢測發(fā)現異煙肼組CYP1A1啟動子區(qū)甲基化升高，與之對應的CYP1A1 mRNA表達降低，提示CYP1A1啟動子區(qū)甲基化的升高降低了mRNA表達。因此認為，CYP1A1基因啟動子區(qū)高甲基化與異煙肼致肝細胞損傷有關。

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摘自《中國學術期刊(光盤版)檢索與評價數據規(guī)范》(修訂版CAJ-CD B/T 1-2006)

Effect of isoniazid on methylation of CYP1A1 promoter region of human hepatic cells

NIUChen,ZHANGYiyang,LIJinfeng,LIYingshu,LIYuhong,TIANShenqian,WANGYue,FENGFumin

(SchoolofPublicHealth,NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China)

Objective To observe the effect of isoniazid on methylation of CpG island in cytochrome P4501A1 (CYP1A1) promoter region of human hepatocytes and to explore the mechanism of isoniazid-induced hepatocyte injury. Methods Liver cells were divided into the experimental group and control group. Cells in the experimental group were treated with 200, 400, and 800 μg/mL isoniazid, respectively. Cells in the control group were added with the same volume of DMSO culture medium. The LDH level in the supernatant was measured by lactate dehydrogenase (LDH) assay kit. The relative expression of CYP1A1, DNA methyltransferase 1 (DNMT1), DNMT3a, and DNMT3b mRNA was detected by real-time fluorescent quantitative PCR. The protein levels of DNMT1, DNMT3a, and DNMT3b were detected by enzyme-linked immunosorbent assay. The methylation of CYP1A1 promoter was detected by bisulfite sequencing PCR. Results The level of LDH in the supernatant of the experimental group was higher than that in the control group, and the LDH level was the highest in the 800 μg/mL isoniazid group (allP<0.05). Compared with the control group, the expression of CYP1A1 mRNA in the experimental group first increased and then decreased with the increasing concentrations of isoniazid (allP<0.05). DNMT1, DNMT3a, and DNMT3b mRNA and protein expression increased with the increase of isoniazid concentration, and the 800 μg/mL isoniazid group was the highest (P<0.05). The methylation rate of CYP1A1 gene promoter region was 82.9%, which was higher than that of control group (79.6%) (P<0.05). Conclusion Isoniazid can cause human hepatocyte injury, and the mechanism may be related to CYP1A1 gene promoter hypermethylation.

isoniazid; drug-induced hepatic injury; cytochrome P4501A1; DNA methylation; lactate dehydrogenase; DNA methyltransferase; human hepatic cells

國家自然科學基金資助項目(81041096)。

牛琛(1992-)，男，碩士研究生，主要研究方向為傳染病的防治。E-mail: 1737147219@qq.com

馮福民(1963-)，男，教授，博士生導師。主要研究方向為傳染病的防治。E-mail: fm_feng@sina.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.26.001

R525

A

1002-266X(2017)26-0001-04

2017-02-18)

的標識

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