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2017-08-09 00:42:45肖能文李俊生
環(huán)境科學(xué)研究 2017年8期
閆 冰, 齊 月, 付 剛, 賀 婧, 肖能文, 李俊生*
1.中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院, 北京 100012 2.北京師范大學(xué)水科學(xué)研究院, 北京 100875 3.中國(guó)人民大學(xué)環(huán)境學(xué)院, 北京 100872
莠去津?qū)σ吧参锶郝湎峦寥牢⑸锕δ芏鄻有缘挠绊?/p>
閆 冰1,2, 齊 月1,2, 付 剛1,2, 賀 婧1,3, 肖能文1, 李俊生1*
1.中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院, 北京 100012 2.北京師范大學(xué)水科學(xué)研究院, 北京 100875 3.中國(guó)人民大學(xué)環(huán)境學(xué)院, 北京 100872
為探明亞致死劑量農(nóng)藥對(duì)土壤微生物多樣性影響，基于大田控制試驗(yàn)，采用Biolog-ECO微平板技術(shù)分析噴施亞致死劑量的莠去津?qū)σ吧参锶郝湎峦寥牢⑸锶郝涔δ芏鄻有缘挠绊? 結(jié)果表明：①莠去津的噴施濃度對(duì)土壤微生物群落利用全部碳源的能力無顯著影響(P>0.05)，但與噴施處理后第30天相比，處理后第60天的土壤微生物群落利用全部碳源的能力有所降低，其中處理Ⅰ〔噴施濃度(以質(zhì)量濃度計(jì))為1 200 ghm2〕、處理Ⅲ(噴施濃度為300 ghm2)顯著下降(P<0.05)，而CK(對(duì)照組)、處理Ⅱ(噴施濃度為600 ghm2)降低程度不顯著(P>0.05)，并且其各處理間土壤微生物群落對(duì)全部碳源的利用能力大小為CK>處理Ⅲ>處理Ⅱ>處理Ⅰ. ②噴施處理后第30天土壤微生物群落對(duì)碳水化合物類碳源的利用能力最強(qiáng)，對(duì)羧酸類碳源的利用能力相對(duì)較弱；噴施處理后第60天土壤微生物群落對(duì)碳水化合物類碳源的利用能力降幅最大，處理Ⅰ、處理Ⅱ、處理Ⅲ分別下降了0.63、0.78、0.85、0.76. ③噴施除草劑后第30天處理Ⅱ的Shannon-Wiener指數(shù)和Simpson指數(shù)顯著低于其他處理(P<0.05)，而第60天各處理間多樣性指數(shù)無顯著差異；與噴施處理后第30天相比，第60天各處理多樣性指數(shù)都有所下降，但沒有顯著差異(P>0.05). ④對(duì)土壤微生物群落碳源利用能力進(jìn)行主成分分析結(jié)果顯示，提取的與土壤微生物碳源利用相關(guān)的主成分累積貢獻(xiàn)率為86.6%，主成分1能夠區(qū)分噴施處理后兩個(gè)時(shí)期的土壤微生物群落特征. ⑤冗余分析(RDA)表明，pH是土壤微生物利用碳源能力差異的重要影響因素之一. 研究顯示，除草劑莠去津的施用可在一定程度上降低野生植物群落下土壤微生物群落功能多樣性.
莠去津; 土壤微生物; 微生物功能多樣性; Biolog-ECO微平板技術(shù)
土壤微生物是土壤及整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，是生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)中的重要驅(qū)動(dòng)者，對(duì)土壤肥力的形成、污染物降解和土壤結(jié)構(gòu)保持等起著積極作用[1]，并且在各種生物地球化學(xué)循環(huán)中扮演著不可替代的角色[2]. 土壤中含有數(shù)量驚人的土壤微生物，并且具有極其豐富的微生物多樣性[3]. 土壤微生物多樣性對(duì)維持土壤生態(tài)系統(tǒng)健康穩(wěn)定及可持續(xù)性至關(guān)重要[4- 5]，是評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量的重要生物學(xué)指標(biāo)[6].
除草劑是當(dāng)今廣泛使用的一類農(nóng)藥，由于具有高效和適合機(jī)械化作業(yè)等特點(diǎn)，其產(chǎn)量和使用量都呈現(xiàn)出逐年增加的趨勢(shì)[7- 10]. 除草劑的大量施用在給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來效益的同時(shí)，也給生態(tài)環(huán)境帶來一系列的影響. 農(nóng)田中噴施的除草劑通過直接和間接的方式進(jìn)入土壤，對(duì)土壤微生物數(shù)量、多樣性、生態(tài)特征等產(chǎn)生影響[11- 14].有研究[15]顯示，土壤微生物多樣性對(duì)植物生長(zhǎng)及產(chǎn)量都有強(qiáng)烈的影響. 并且，有研究[16]認(rèn)為土壤微生物在土壤中農(nóng)藥的降解上扮演著重要角色. 目前，化學(xué)農(nóng)藥的施用對(duì)土壤微生物及其活性的影響，已成為評(píng)價(jià)農(nóng)藥生態(tài)安全的重要指標(biāo)之一[17- 18].
農(nóng)田周邊野生植物群落的生物多樣性是農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)生物多樣性中的重要組成部分，其為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供了重要的服務(wù)功能[19]. 野生植物多樣性促進(jìn)作物害蟲的天敵和傳粉動(dòng)物群落多樣性和密度的發(fā)展，還可以作為作物害蟲防治的植物誘餌，并促進(jìn)農(nóng)田及周邊土壤的養(yǎng)分循環(huán)[20- 21]. 一直以來人們關(guān)注的主要是除草劑的除草效果[22- 23]及其對(duì)田內(nèi)土壤微生物的影響[12- 13]，而對(duì)于農(nóng)田除草劑施用過程中飄散到周邊的亞致死劑量的除草劑對(duì)生物多樣性的影響研究較少. 亞致死劑量的除草劑可能會(huì)影響農(nóng)田周邊野生植物群落的生物多樣性，也可能對(duì)土壤微生物產(chǎn)生影響，因此，研究亞致死劑量的除草劑對(duì)土壤微生物影響至關(guān)重要.
該研究基于室外大田控制試驗(yàn)，采用Biolog-ECO微平板技術(shù)對(duì)不同亞致死劑量除草劑施用下土壤微生物群落功能多樣性變化進(jìn)行研究，以期為評(píng)價(jià)亞致死劑量除草劑在土壤中的生態(tài)安全提供參考，為探索更為經(jīng)濟(jì)合理地使用除草劑提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為減少環(huán)境污染提供參考.
1 材料與方法
1.1 研究區(qū)概況
試驗(yàn)地設(shè)置在中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院北京順義試驗(yàn)基地內(nèi)，該試驗(yàn)基地位于北京市(39.4°N～41.6°N、115.7°E～117.4°E)順義區(qū)趙全營(yíng)鎮(zhèn). 該地屬典型的北溫帶半濕潤(rùn)大陸性季風(fēng)氣候，夏季高溫多雨，冬季寒冷干燥，春、秋短促，全年無霜期180～200 d，年均氣溫13.4 ℃，年均降水量595 mm. 降水季節(jié)分配不均勻，全年80%的降水集中在6—8月.
1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)
試驗(yàn)所用地塊于2011—2013年種植過玉米和油菜，并且未施用過任何農(nóng)藥，于2014年3月進(jìn)行人工翻地，充分均勻混合使整個(gè)試驗(yàn)地塊土壤處于勻質(zhì)狀態(tài). 試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，設(shè)置四組處理：CK(對(duì)照組，噴施等量的清水)、處理Ⅰ〔大田推薦劑量，噴施濃度(以質(zhì)量濃度計(jì))為 1 200 ghm2，以ai(有效成分)計(jì)，下同〕、處理Ⅱ(大田推薦劑量的12，噴施濃度為600 ghm2)、處理Ⅲ(大田推薦劑量的14，噴施濃度為300 ghm2)，每個(gè)處理三次重復(fù)，試驗(yàn)共設(shè)置12個(gè)，小區(qū)大小為3 m×5 m，各小區(qū)間設(shè)置寬度為2 m 的隔離帶. 試驗(yàn)于2014年6月20日進(jìn)行除草劑噴施處理，噴施前用塑料薄膜圍建起高度為1.5 m的隔離網(wǎng)，防止除草劑飄散導(dǎo)致各試驗(yàn)處理間產(chǎn)生相互影響.
試驗(yàn)所用除草劑為莠去津(山東勝邦綠野化學(xué)有限公司生產(chǎn))，具有土壤處理作用兼有莖葉處理作用，能被植物根吸收，華北地區(qū)大田推薦劑量為 1 200 ghm2. 試驗(yàn)所用噴霧器為上海生產(chǎn)的worth牌NS- 5型手動(dòng)農(nóng)藥噴霧器，噴頭壓力設(shè)定為2×105Pa.
各試驗(yàn)小區(qū)內(nèi)的植物群落類型都為野生植物群落，主要物種組成為馬唐(Digitariasanguinalis)、反枝莧(Amaranthusretroflexus)、苘麻(AbutilontheophrastiMedicus)、藜(Chenopodiumalbum)等.
1.3 樣品采集
試驗(yàn)在除草劑噴施處理后第30天、第60天進(jìn)行樣品采集，于2014年7月20日進(jìn)行第一次樣品采集，于2014年8月20日進(jìn)行第二次樣品采集. 取樣時(shí)除去地表的凋落物層，垂直取0～15 cm的土壤，每個(gè)小區(qū)內(nèi)用五點(diǎn)取樣法取樣并進(jìn)行充分混勻后記做一個(gè)樣品，除去植物殘?bào)w、根系、石塊等雜物，用無菌自封袋封裝再用冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室放入4 ℃冰箱中保存待用.
1.4 研究方法
采用電位法測(cè)定土壤pH，稱取10 g過2 mm篩的風(fēng)干土，加入25 mL去CO2的超純水，土水比為1∶2.5，振蕩2 min后靜置30 min進(jìn)行土壤pH測(cè)定，用元素分析儀(Costech ECS 4012，Italy)測(cè)量土壤w(TC)、w(TN).
利用Biolog-ECO微平板法研究施用除草劑對(duì)土壤微生物功能多樣性的影響. 稱取相當(dāng)于10 g干質(zhì)量的鮮土置于無菌錐形瓶中，加入90 mL濃度為0.85%的無菌生理鹽水，將混合液放置在恒溫?fù)u床上振蕩30 min(200 rmin)，靜止沉淀15 min，吸取上清液，采用十倍稀釋法將其用無菌生理鹽水稀釋至濃度為10-3. 將制備好的微生物菌懸浮液倒入無菌移液槽中，用八通道移液器將菌懸液接種于Biolog-ECO微平板中，每孔150 μL，全部接種工作在超凈工作臺(tái)上完成. 最后，將Biolog-ECO微平板置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)7 d，每隔24 h用酶標(biāo)儀讀取590 nm處的吸光值.
根據(jù)讀取的吸光值數(shù)據(jù)計(jì)算Biolog-ECO微平板板孔的AWCD(average well color development，平均顏色變化率)〔見式(1)〕，用以表示土壤微生物群落利用全部碳源的能力[24]. 采用培養(yǎng)第72小時(shí)時(shí)的數(shù)據(jù)計(jì)算Shannon-Wiener指數(shù)(H′)〔見式(2)〕、Simpson指數(shù)(D)〔見式(3)〕、McIntos指數(shù)(U)〔見式(4)〕，豐富度指數(shù)(S)用有顏色變化的微孔數(shù)(微孔光密度值>0.15)表示[25- 27]，用于反映土壤微生物群落的功能多樣性.
(1)
(2)
(3)
(4)
式中：Ci為第i孔在590 nm下的光密度值；R為對(duì)照孔的光密度，若Ci-R≤0，記為0；n為Biolog-ECO微平板的碳源種類數(shù)目，n=31；Pi為第i孔相對(duì)光密度值(C-R)與整個(gè)平板相對(duì)光密度總和的比率；ni為第i孔的相對(duì)吸光度.
利用SPSS 22.0對(duì)土壤微生物功能多樣性指數(shù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用最小顯著差異法(LSD)進(jìn)行多重比較. 根據(jù)培養(yǎng)第72小時(shí)數(shù)據(jù)，利用R軟件vegan包進(jìn)行主成分分析(PCA)及冗余分析(RDA)，并用ggplot2包進(jìn)行繪圖.
2 結(jié)果與分析
2.1 土壤微生物利用全部碳源的代謝活性變化
噴施處理后第30天、第60天土壤微生物群落AWCD隨培養(yǎng)時(shí)間的變化情況如圖1所示. 由圖1可見，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，土壤微生物對(duì)全部碳源的代謝能力呈現(xiàn)出增加的趨勢(shì). 噴施處理后第30天、培養(yǎng)第168小時(shí)各處理組之間無顯著差異(P>0.05)，但處理Ⅲ的AWCD值相對(duì)較高，而其他三組處理的AWCD值非常接近. 噴施處理后第60天，各處理組間AWCD值大小為CK>處理Ⅲ>處理Ⅱ>處理Ⅰ，但單因素方差分析結(jié)果表明，培養(yǎng)第168小時(shí)各處理組間AWCD值無顯著差異(P>0.05). 表明噴施處理后第60天，不同處理對(duì)土壤微生物活性沒有顯著影響. 對(duì)比分析噴施處理后第30天和第60天兩個(gè)階段土壤微生物群落AWCD值(見表1)發(fā)現(xiàn)，處理后第60天各處理土壤微生物群落AWCD值都有所下降，其中處理Ⅰ和處理Ⅲ顯著降低(P<0.05)，而CK和處理Ⅱ沒有顯著降低(P>0.05).
2.2 土壤微生物利用不同種類碳源的動(dòng)力學(xué)特征
Biolog-ECO微平板中的全部碳源可劃分為六大類，即多聚物類、糖類、氨基酸類、胺類、羧酸類、酚酸類. 培養(yǎng)第72小時(shí)時(shí)，不同處理下的土壤微生物對(duì)不同碳源利用情況如圖2所示. 由圖2可知，噴施處理后第30天土壤微生物對(duì)碳水化合物類碳源的利用
圖1 不同處理土壤微生物群落平均顏色變化率(AWCD)隨培養(yǎng)時(shí)間的變化Fig.1 Variation of soil microbial communities average well color development(AWCD) with incubation time in different treatment
Table 1 ANOVA results of AWCD for different treatments incubation 168 hours under 30 d and 60 d after spraying
能力最強(qiáng)，對(duì)羧酸類碳源的利用能力最弱，并且對(duì)碳水化合物類碳源和羧酸類碳源的利用能力上存在顯著差異(P<0.05)，說明利用碳水化合物類碳源的土壤微生物群落顯著多于利用羧酸類碳源的土壤微生物群落. 噴施處理后第30天，各處理間土壤微生物利用羧酸類和氨基酸類碳源能力都存在顯著差異(P<0.05)，對(duì)其他類型碳源利用能力無顯著差異(P>0.05)，說明不同處理對(duì)利用羧酸類和氨基酸類碳源的微生物影響較大. 噴施處理后第60天土壤微生物對(duì)多聚物、碳水化合物、氨基酸和胺類碳源的利用能力相對(duì)較強(qiáng)，對(duì)酚酸類和羧酸類碳源的利用能力相對(duì)較弱. 噴施處理后第60天，各處理間土壤微生物利用各類碳源均無顯著差異，說明噴施處理后第60天各處理造成的差異減弱. 對(duì)比噴施處理后第30天和第60天土壤微生物利用各類碳源的能力發(fā)現(xiàn)，碳水化合物類碳源和氨基酸類碳源在兩個(gè)時(shí)期內(nèi)的AWCD值降幅最大.
注：同一碳源類型中不同字母表示差異顯著(P≤0.05).圖2 不同處理土壤微生物對(duì)各類碳源利用情況Fig.2 Utilization of different carbon sources of soil microorganisms under the different treatments
2.3 土壤微生物對(duì)碳源利用的多樣性指數(shù)分析
由表2可知，噴施處理后后第30天土壤微生物群落Shannon-Wiener指數(shù)和Simpson指數(shù)在處理Ⅱ中顯著低于其他處理(P<0.05)，不同處理對(duì)McIntosh指數(shù)和豐富度指數(shù)沒有顯著影響(P>0.05). 噴施除草劑處理后第60天，各處理對(duì)土壤微生物群落多樣性指數(shù)都無顯著影響(P>0.05). 同時(shí)，對(duì)噴施處理后后第30天和第60天各處理的多樣性指數(shù)進(jìn)行t檢驗(yàn)(數(shù)據(jù)未列出)發(fā)現(xiàn)，與第30天相比，第60天的土壤微生物多樣性指數(shù)降低，但所有處理的第30天和第60天土壤微生物多樣性指數(shù)都無顯著差異(P>0.05). 說明噴施除草劑處理后，隨著時(shí)間的變化土壤微生物群落功能多樣性并不存在顯著變化的情況. 噴施處理后第30天，各處理對(duì)土壤微生物群落Shannon-Wiener指數(shù)和Simpson指數(shù)有顯著影響(P<0.05)，而噴施處理后第60天這種影響不顯著，說明噴施除草劑對(duì)土壤微生物群落功能多樣性有影響，但60 d后這種影響開始減退或各處理間差異消失.
2.4 土壤微生物群落利用碳源的主成分分析
表2 不同處理土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)
注：數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差. 同一行中不同字母表示差異顯著(P≤0.05).
基于培養(yǎng)第72 小時(shí)時(shí)的吸光值數(shù)據(jù)，對(duì)噴施處理后第30天和第60天的土壤微生物代謝碳源能力進(jìn)行主成分分析(PCA)，按照主成分提取原則[28]共提取了7個(gè)主成分(principal component，PC). 結(jié)果顯示，7個(gè)主成分累積方差貢獻(xiàn)率為86.6%，其中PC1(主成分1)～PC7(主成分7)的方差貢獻(xiàn)率分別為60.36%、7.48%、5.95%、3.79%、3.52%、3.10%和2.44%.
不同處理土壤微生物碳源代謝的PCA排序圖如圖3所示. 由圖3可知，PC1和PC2共解釋了67.84%的變異. 在PC1上噴藥后各處理明顯分為兩簇，第30天的所有樣地聚為一簇，第60天的所有樣地聚為另一簇. PCA分析發(fā)現(xiàn)，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)在噴施處理后第30天和第60天間呈現(xiàn)出顯著差異(P<0.05). 在PC2上，噴施處理后第30天處理Ⅱ的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和其他處理存在顯著差異(P<0.05)，噴施處理后第60天各處理間的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)沒有顯示出顯著差異(P>0.05).
注：30 d和60 d分別表示噴施處理后第30天和第60天，下同.圖3 不同處理土壤微生物群落利用碳源能力的主成分分析Fig.3 Principal component analysis of carbon sources utilization of soil microbial communities under different treatments
通過對(duì)主成分相關(guān)性矩陣進(jìn)行分析(見表3)可知，對(duì)PC1貢獻(xiàn)較大的碳源共12種，其中碳水化合物類碳源占66.67%，氨基酸類碳源占16.67，多聚物類碳源和酚酸類碳源均占8.33%，說明影響PC1的主要是碳水化合物類碳源，其次是氨基酸類碳源. 對(duì)PC2貢獻(xiàn)較大的碳源只有一種，為碳水化合物類碳源.
表3 與PC1、PC2顯著相關(guān)的主要碳源種類
2.4 土壤微生物群落功能冗余分析
利用培養(yǎng)第72 小時(shí)的吸光值數(shù)據(jù)進(jìn)行降趨對(duì)應(yīng)分析(detrended correspondence analysis，DCA)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，排序軸中的最大值為1.1，因此選擇冗余分析(RDA)方法分析環(huán)境因子與土壤微生物碳源代謝能力之間的關(guān)系(見圖7). 結(jié)果顯示，軸1和軸2分別解釋碳源代謝能力總變異的38.32%和2.51%，pH、w(TC)和w(TN)與軸1和軸2都呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，其中pH與土壤微生物碳源代謝能力相關(guān)性最強(qiáng)(箭頭連線長(zhǎng)度最長(zhǎng)). 蒙特卡羅置換檢驗(yàn)(Monte Carlo permutation test)顯示顯著性為0.02，則認(rèn)為排序結(jié)果可以接受環(huán)境因子對(duì)碳源代謝能力變異的解釋量.
注：TC—w(TC)；TN—w(TN).圖4 土壤微生物群落功能特征與環(huán)境因子的冗余分析Fig.4 RDA for environmental factors and soil microbial function diversity
3 討論
土壤微生物群落利用全部碳源的能力隨著處理后時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，與噴施處理后第30天相比，噴施處理后第60天土壤微生物利用碳源的能力降低，處理Ⅰ和處理Ⅲ的土壤微生物群落AWCD都顯著下降，但同一時(shí)期內(nèi)各處理間土壤微生物群落利用碳源的能力沒有顯著差異. 說明莠去津在不同濃度梯度下對(duì)土壤微生物活性沒有產(chǎn)生顯著影響，而隨著時(shí)間增加除草劑對(duì)土壤微生物活性的影響呈現(xiàn)出增加的趨勢(shì). 噴施處理后第30天各處理土壤微生物群落對(duì)碳源的利用能力表現(xiàn)為處理Ⅰ相對(duì)較高. 有研究認(rèn)為，在土壤中有農(nóng)藥開始介入時(shí)，土壤微生物群落對(duì)進(jìn)入到土壤中的農(nóng)藥具有一定的耐受性，并且一些微生物會(huì)利用農(nóng)藥為碳源進(jìn)行分解作用，這會(huì)導(dǎo)致微生物進(jìn)行繁殖[29]. 該研究發(fā)現(xiàn)，莠去津?qū)ν寥牢⑸锶郝涞挠绊懺趪娛┨幚砗蟮?0天開始顯現(xiàn)，表現(xiàn)為CK處理的土壤微生物群落利用碳源能力相對(duì)較大，其次是處理Ⅲ、處理Ⅱ、處理Ⅰ. 因此，噴施處理后第60天各噴施農(nóng)藥處理組相比，低濃度莠去津處理的土壤微生物群落活性相對(duì)較高.
土壤微生物對(duì)不同碳源利用能力的差異在一定程度上指示土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)組成[30]. 噴施處理后兩個(gè)時(shí)期(第30天、第60天)土壤微生物群落對(duì)羧酸類碳源的利用能力都較低，并且各處理下土壤微生物群落對(duì)碳水化合物類碳源的利用能力降幅最大，隨著時(shí)間的增加對(duì)利用碳水化合物類碳源的微生物的影響加劇. 研究[31- 32]發(fā)現(xiàn)，干擾后不同時(shí)期偏好利用不同類型碳源的土壤微生物可能增加或減少. 不同處理間土壤微生物對(duì)某些類型碳源利用存在顯著差異，同時(shí)也對(duì)一些類型碳源的利用沒有顯著差異. 姚斌等[33]認(rèn)為，土壤微生物對(duì)不同類型碳源的利用不同，可能是除草劑進(jìn)入土壤后土壤微生物能利用的碳源種類發(fā)生了改變. 孫約兵等[34]研究發(fā)現(xiàn)，施用一定濃度的硝磺草酮后，土壤微生物群落對(duì)Biolog-ECO微平板中全部碳源的代謝能力整體上呈現(xiàn)出升高的狀態(tài)，但從土壤微生物對(duì)各類型的碳源利用能力上看，不同濃度的硝磺草酮處理間存在一定的差異.
Shannon-Wiener指數(shù)、Simpson指數(shù)、McIntosh指數(shù)和豐富度指數(shù)分布用來反映土壤微生物的豐富度、最常見的物種優(yōu)勢(shì)度和均勻度[30,35]. 噴施除草劑后，隨著時(shí)間的增加各多樣性指數(shù)都有所降低，但是差異并未達(dá)到顯著水平. 楊永華等[36]研究認(rèn)為，農(nóng)藥污染的土壤中土壤微生物群落Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和McIntosh指數(shù)顯著降低，主要原因是由于受農(nóng)藥污染土壤微生物群落中利用碳源的微生物物種的均一程度受到顯著影響.
噴施處理后第30天，土壤微生物群落Shannon-Wiener指數(shù)和Simpson指數(shù)在處理Ⅱ中顯著低于其他處理，而噴施處理后第60天，各處理間土壤微生物群落多樣性指數(shù)表現(xiàn)出無顯著差異. 分析認(rèn)為，在莠去津施用初期，土壤微生物群落對(duì)不同濃度的處理響應(yīng)不同，碳源利用的多樣性存在明顯差異，而隨著時(shí)間的推移，這種影響被微生物群落自身的修復(fù)調(diào)劑能力抵消. 除草劑進(jìn)入土壤后可能造成土壤微生物群落功能發(fā)生變化，適量的農(nóng)藥處理將使得土壤中原有的微生物群落內(nèi)部種群間的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系發(fā)生變化，原有的平衡遭到破壞，優(yōu)勢(shì)類群改變[37]. Ros等[38]研究發(fā)現(xiàn)，高濃度莠去津刺激土壤細(xì)菌生長(zhǎng)，這些都可能使微生物多樣性降低. Moreno等[39]通過研究不同濃度莠去津處理下的土壤微生物量碳和呼吸發(fā)現(xiàn)，高濃度條件下土壤微生物量碳減少，同時(shí)土壤微生物呼吸增強(qiáng). 但是筆者并沒有發(fā)現(xiàn)高濃度的莠去津能夠顯著減少土壤微生物群落的功能多樣性指數(shù). 鄭麗萍等[40]認(rèn)為，低濃度有機(jī)氯會(huì)造成逆境刺激微生物代謝加強(qiáng)，導(dǎo)致土壤微生物對(duì)碳源的利用率較高，而高濃度有機(jī)氯污染可能對(duì)微生物的活性起極大的抑制作用，減少微生物多樣性. 農(nóng)藥作為土壤微生物群落的外來干擾因素，濃度較小時(shí)，其干擾被微生物群落自身強(qiáng)大的功能性冗余所抵消，而當(dāng)其濃度增大時(shí)，可能使得某些微生物菌種的生長(zhǎng)受到抑制，最終導(dǎo)致土壤微生物群落均勻性下降[41]. 對(duì)土壤微生物代謝特性進(jìn)行RDA分析，表明pH是土壤微生物碳源利用能力差異的重要因子，推測(cè)噴施莠去津?qū)ν寥览砘再|(zhì)的影響是造成土壤微生物碳源利用能力差異的重要原因. 但筆者發(fā)現(xiàn)，包括pH在內(nèi)的環(huán)境因子只能解釋變量的42.21%，因此除此之外還存在其他影響因素，需要進(jìn)一步研究.
該研究對(duì)亞致死劑量除草劑莠去津處理后的土壤微生物群落功能多樣性進(jìn)行了研究，得到了一些初步結(jié)果. 雖然Biolog-ECO微平板技術(shù)能夠簡(jiǎn)單、方便、快捷靈敏地反映出土壤微生物碳源代謝能力，進(jìn)而評(píng)估土壤微生物群落碳源代謝功能多樣性. 但由于其自身存在的局限性，即微平板中只有31種碳源，導(dǎo)致其不能反映自然條件下土壤中的復(fù)雜環(huán)境，致使所得的研究結(jié)果也并不能夠完整地反映土壤中微生物群落的功能多樣性和復(fù)雜性[42]. 因此，在后續(xù)的研究中，還應(yīng)結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)，深入研究亞致死劑量除草劑對(duì)非靶標(biāo)植物群落下的土壤微生物群落的影響，以期為闡釋除草劑對(duì)土壤微生物多樣性的影響提供理論依據(jù).
4 結(jié)論
a) 噴施不同濃度莠去津后對(duì)土壤微生物代謝活性存在一定程度的影響，但是差異不明顯. 全劑量的莠去津(處理Ⅰ)噴施處理后，對(duì)土壤微生物代謝活性的影響程度最大，亞致死劑量的影響程度相對(duì)較弱.
b) 噴施除草劑莠去津后，隨著時(shí)間的增加對(duì)利用不同類型碳源的土壤微生物群落都存在一定的影響，其中對(duì)利用碳水化合物類碳源的微生物的影響最為強(qiáng)烈.
c) 噴施莠去津后，土壤微生物群落的Shannon-Wiener指數(shù)、Simpson指數(shù)和McIntosh指數(shù)都呈下降趨勢(shì)，但沒有達(dá)到顯著水平(P>0.05). 除草劑的施用在一定程度上降低土壤微生物群落功能多樣性.
d) 土壤理化因子是土壤微生物代謝能力差異的重要影響因素，該研究中pH、TN、TC都對(duì)土壤微生物群落代謝碳源能力有顯著影響，而pH的影響最強(qiáng)烈.
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Effects of Atrazine on Soil Microbial Functional Diversity of Wild Weed Communities
YAN Bing1,2, QI Yue1,2, FU Gang1,2, HE Jing1,3, XIAO Nengwen1, LI Junsheng1*
1.Chinese Research Academy of Environmental Sciences, Beijing 100012, China 2.College of Water Sciences, Beijing Normal University, Beijing 100875, China 3.School of Environment and Natural Resources, Renmin University of China, Beijing 100872, China
To evaluate the impacts of atrazine on soil microbial communities under wild weed communities, the functional diversity of soil microbial communities in different treatments was investigated with Biolog-ECO micro-plates. The results showed that spraying concentrations of atrazine had no significant influence on soil microbial carbon utilization (P>0.05). Compared with the 30thday after spraying, the soil microbial carbon utilization ability was reduced in the 60thday. The I and III treatments were reduced significantly (P<0.05), while the CK and II treatments had no significant reduction (P>0.05). After spraying herbicide, the order of the ability of soil microbial carbon utilization after 60 days was CK>III>II>I. The utilization abilities of different types of carbon sources were different after spraying herbicide. 30 days after spraying, the soil microbial communities mostly used carbohydrates as carbon source, and used Carboxylic acid least. 60 days after spraying, the ability to use carbohydrates as carbon source was largely declined, with treatments declined by 0.63, 0.78, 0.85, 0.76 respectively. 30 days after spraying herbicide, the Shannon-Wiener and Simpson indices of soil microbial community in treatment II were significant less than other treatments (P<0.05), but the diversity indices showed no significant differences among treatments 30 days after spraying herbicide. Compared with the 30thday after spraying, the diversity index was decreased in the 60thday after spraying, but the differences were not significant (P>0.05). Principal component analysis demonstrated that the principal components extracted from 31 carbon sources were related to soil microbial carbon source utilization; the principal components accounted for 86.6% of the total variables variance. Principal component 1 could separate characteristics of soil microbial community after spraying. Redundancy Analysis showed that pH was the main factor that was most highly correlated with variance of soil microbial carbon utilization. The functional diversity of soil microbial communities will be changed by spraying the herbicide atrazine.
atrazine; soil microorganisms; functional diversity; Biolog-ECO micro-plate
2017-02-14
2017-04-18
科技部重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2016YFC1201100)；北京市財(cái)政資金項(xiàng)目(PXM2014- 178218- 000005)
閆冰(1986-)，男，黑龍江綏化人，yanbing718@126.com.
*責(zé)任作者，李俊生(1968-)，男，安徽巢湖人，研究員，博士，博導(dǎo)，主要從事生物多樣性保護(hù)、自然保護(hù)區(qū)管理、生物安全評(píng)估以及氣候變化影響評(píng)價(jià)研究，lijsh@craes.org.cn
X172
1001- 6929(2017)08- 1246- 09
A
10.13198j.issn.1001- 6929.2017.02.54
閆冰,齊月,付剛,等.莠去津?qū)σ吧参锶郝湎峦寥牢⑸锕δ芏鄻有缘挠绊慬J].環(huán)境科學(xué)研究,2017,30(8):1246- 1254.
YAN Bing,QI Yue,FU Gang,etal.Effects of atrazine on soil microbial functional diversity of wild weed communities [J].Research of Environmental Sciences,2017,30(8):1246- 1254.
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閆 冰, 齊 月, 付 剛, 賀 婧, 肖能文, 李俊生*
1.中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院, 北京 100012 2.北京師范大學(xué)水科學(xué)研究院, 北京 100875 3.中國(guó)人民大學(xué)環(huán)境學(xué)院, 北京 100872
莠去津?qū)σ吧参锶郝湎峦寥牢⑸锕δ芏鄻有缘挠绊?/p>
閆 冰1,2, 齊 月1,2, 付 剛1,2, 賀 婧1,3, 肖能文1, 李俊生1*
1.中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院, 北京 100012 2.北京師范大學(xué)水科學(xué)研究院, 北京 100875 3.中國(guó)人民大學(xué)環(huán)境學(xué)院, 北京 100872
為探明亞致死劑量農(nóng)藥對(duì)土壤微生物多樣性影響，基于大田控制試驗(yàn)，采用Biolog-ECO微平板技術(shù)分析噴施亞致死劑量的莠去津?qū)σ吧参锶郝湎峦寥牢⑸锶郝涔δ芏鄻有缘挠绊? 結(jié)果表明：①莠去津的噴施濃度對(duì)土壤微生物群落利用全部碳源的能力無顯著影響(P>0.05)，但與噴施處理后第30天相比，處理后第60天的土壤微生物群落利用全部碳源的能力有所降低，其中處理Ⅰ〔噴施濃度(以質(zhì)量濃度計(jì))為1 200 ghm2〕、處理Ⅲ(噴施濃度為300 ghm2)顯著下降(P<0.05)，而CK(對(duì)照組)、處理Ⅱ(噴施濃度為600 ghm2)降低程度不顯著(P>0.05)，并且其各處理間土壤微生物群落對(duì)全部碳源的利用能力大小為CK>處理Ⅲ>處理Ⅱ>處理Ⅰ. ②噴施處理后第30天土壤微生物群落對(duì)碳水化合物類碳源的利用能力最強(qiáng)，對(duì)羧酸類碳源的利用能力相對(duì)較弱；噴施處理后第60天土壤微生物群落對(duì)碳水化合物類碳源的利用能力降幅最大，處理Ⅰ、處理Ⅱ、處理Ⅲ分別下降了0.63、0.78、0.85、0.76. ③噴施除草劑后第30天處理Ⅱ的Shannon-Wiener指數(shù)和Simpson指數(shù)顯著低于其他處理(P<0.05)，而第60天各處理間多樣性指數(shù)無顯著差異；與噴施處理后第30天相比，第60天各處理多樣性指數(shù)都有所下降，但沒有顯著差異(P>0.05). ④對(duì)土壤微生物群落碳源利用能力進(jìn)行主成分分析結(jié)果顯示，提取的與土壤微生物碳源利用相關(guān)的主成分累積貢獻(xiàn)率為86.6%，主成分1能夠區(qū)分噴施處理后兩個(gè)時(shí)期的土壤微生物群落特征. ⑤冗余分析(RDA)表明，pH是土壤微生物利用碳源能力差異的重要影響因素之一. 研究顯示，除草劑莠去津的施用可在一定程度上降低野生植物群落下土壤微生物群落功能多樣性.
莠去津; 土壤微生物; 微生物功能多樣性; Biolog-ECO微平板技術(shù)
土壤微生物是土壤及整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，是生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)中的重要驅(qū)動(dòng)者，對(duì)土壤肥力的形成、污染物降解和土壤結(jié)構(gòu)保持等起著積極作用[1]，并且在各種生物地球化學(xué)循環(huán)中扮演著不可替代的角色[2]. 土壤中含有數(shù)量驚人的土壤微生物，并且具有極其豐富的微生物多樣性[3]. 土壤微生物多樣性對(duì)維持土壤生態(tài)系統(tǒng)健康穩(wěn)定及可持續(xù)性至關(guān)重要[4- 5]，是評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量的重要生物學(xué)指標(biāo)[6].
除草劑是當(dāng)今廣泛使用的一類農(nóng)藥，由于具有高效和適合機(jī)械化作業(yè)等特點(diǎn)，其產(chǎn)量和使用量都呈現(xiàn)出逐年增加的趨勢(shì)[7- 10]. 除草劑的大量施用在給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來效益的同時(shí)，也給生態(tài)環(huán)境帶來一系列的影響. 農(nóng)田中噴施的除草劑通過直接和間接的方式進(jìn)入土壤，對(duì)土壤微生物數(shù)量、多樣性、生態(tài)特征等產(chǎn)生影響[11- 14].有研究[15]顯示，土壤微生物多樣性對(duì)植物生長(zhǎng)及產(chǎn)量都有強(qiáng)烈的影響. 并且，有研究[16]認(rèn)為土壤微生物在土壤中農(nóng)藥的降解上扮演著重要角色. 目前，化學(xué)農(nóng)藥的施用對(duì)土壤微生物及其活性的影響，已成為評(píng)價(jià)農(nóng)藥生態(tài)安全的重要指標(biāo)之一[17- 18].
農(nóng)田周邊野生植物群落的生物多樣性是農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)生物多樣性中的重要組成部分，其為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供了重要的服務(wù)功能[19]. 野生植物多樣性促進(jìn)作物害蟲的天敵和傳粉動(dòng)物群落多樣性和密度的發(fā)展，還可以作為作物害蟲防治的植物誘餌，并促進(jìn)農(nóng)田及周邊土壤的養(yǎng)分循環(huán)[20- 21]. 一直以來人們關(guān)注的主要是除草劑的除草效果[22- 23]及其對(duì)田內(nèi)土壤微生物的影響[12- 13]，而對(duì)于農(nóng)田除草劑施用過程中飄散到周邊的亞致死劑量的除草劑對(duì)生物多樣性的影響研究較少. 亞致死劑量的除草劑可能會(huì)影響農(nóng)田周邊野生植物群落的生物多樣性，也可能對(duì)土壤微生物產(chǎn)生影響，因此，研究亞致死劑量的除草劑對(duì)土壤微生物影響至關(guān)重要.
該研究基于室外大田控制試驗(yàn)，采用Biolog-ECO微平板技術(shù)對(duì)不同亞致死劑量除草劑施用下土壤微生物群落功能多樣性變化進(jìn)行研究，以期為評(píng)價(jià)亞致死劑量除草劑在土壤中的生態(tài)安全提供參考，為探索更為經(jīng)濟(jì)合理地使用除草劑提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為減少環(huán)境污染提供參考.
1 材料與方法
1.1 研究區(qū)概況
試驗(yàn)地設(shè)置在中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院北京順義試驗(yàn)基地內(nèi)，該試驗(yàn)基地位于北京市(39.4°N～41.6°N、115.7°E～117.4°E)順義區(qū)趙全營(yíng)鎮(zhèn). 該地屬典型的北溫帶半濕潤(rùn)大陸性季風(fēng)氣候，夏季高溫多雨，冬季寒冷干燥，春、秋短促，全年無霜期180～200 d，年均氣溫13.4 ℃，年均降水量595 mm. 降水季節(jié)分配不均勻，全年80%的降水集中在6—8月.
1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)
試驗(yàn)所用地塊于2011—2013年種植過玉米和油菜，并且未施用過任何農(nóng)藥，于2014年3月進(jìn)行人工翻地，充分均勻混合使整個(gè)試驗(yàn)地塊土壤處于勻質(zhì)狀態(tài). 試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，設(shè)置四組處理：CK(對(duì)照組，噴施等量的清水)、處理Ⅰ〔大田推薦劑量，噴施濃度(以質(zhì)量濃度計(jì))為 1 200 ghm2，以ai(有效成分)計(jì)，下同〕、處理Ⅱ(大田推薦劑量的12，噴施濃度為600 ghm2)、處理Ⅲ(大田推薦劑量的14，噴施濃度為300 ghm2)，每個(gè)處理三次重復(fù)，試驗(yàn)共設(shè)置12個(gè)，小區(qū)大小為3 m×5 m，各小區(qū)間設(shè)置寬度為2 m 的隔離帶. 試驗(yàn)于2014年6月20日進(jìn)行除草劑噴施處理，噴施前用塑料薄膜圍建起高度為1.5 m的隔離網(wǎng)，防止除草劑飄散導(dǎo)致各試驗(yàn)處理間產(chǎn)生相互影響.
試驗(yàn)所用除草劑為莠去津(山東勝邦綠野化學(xué)有限公司生產(chǎn))，具有土壤處理作用兼有莖葉處理作用，能被植物根吸收，華北地區(qū)大田推薦劑量為 1 200 ghm2. 試驗(yàn)所用噴霧器為上海生產(chǎn)的worth牌NS- 5型手動(dòng)農(nóng)藥噴霧器，噴頭壓力設(shè)定為2×105Pa.
各試驗(yàn)小區(qū)內(nèi)的植物群落類型都為野生植物群落，主要物種組成為馬唐(Digitariasanguinalis)、反枝莧(Amaranthusretroflexus)、苘麻(AbutilontheophrastiMedicus)、藜(Chenopodiumalbum)等.
1.3 樣品采集
試驗(yàn)在除草劑噴施處理后第30天、第60天進(jìn)行樣品采集，于2014年7月20日進(jìn)行第一次樣品采集，于2014年8月20日進(jìn)行第二次樣品采集. 取樣時(shí)除去地表的凋落物層，垂直取0～15 cm的土壤，每個(gè)小區(qū)內(nèi)用五點(diǎn)取樣法取樣并進(jìn)行充分混勻后記做一個(gè)樣品，除去植物殘?bào)w、根系、石塊等雜物，用無菌自封袋封裝再用冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室放入4 ℃冰箱中保存待用.
1.4 研究方法
采用電位法測(cè)定土壤pH，稱取10 g過2 mm篩的風(fēng)干土，加入25 mL去CO2的超純水，土水比為1∶2.5，振蕩2 min后靜置30 min進(jìn)行土壤pH測(cè)定，用元素分析儀(Costech ECS 4012，Italy)測(cè)量土壤w(TC)、w(TN).
利用Biolog-ECO微平板法研究施用除草劑對(duì)土壤微生物功能多樣性的影響. 稱取相當(dāng)于10 g干質(zhì)量的鮮土置于無菌錐形瓶中，加入90 mL濃度為0.85%的無菌生理鹽水，將混合液放置在恒溫?fù)u床上振蕩30 min(200 rmin)，靜止沉淀15 min，吸取上清液，采用十倍稀釋法將其用無菌生理鹽水稀釋至濃度為10-3. 將制備好的微生物菌懸浮液倒入無菌移液槽中，用八通道移液器將菌懸液接種于Biolog-ECO微平板中，每孔150 μL，全部接種工作在超凈工作臺(tái)上完成. 最后，將Biolog-ECO微平板置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)7 d，每隔24 h用酶標(biāo)儀讀取590 nm處的吸光值.
根據(jù)讀取的吸光值數(shù)據(jù)計(jì)算Biolog-ECO微平板板孔的AWCD(average well color development，平均顏色變化率)〔見式(1)〕，用以表示土壤微生物群落利用全部碳源的能力[24]. 采用培養(yǎng)第72小時(shí)時(shí)的數(shù)據(jù)計(jì)算Shannon-Wiener指數(shù)(H′)〔見式(2)〕、Simpson指數(shù)(D)〔見式(3)〕、McIntos指數(shù)(U)〔見式(4)〕，豐富度指數(shù)(S)用有顏色變化的微孔數(shù)(微孔光密度值>0.15)表示[25- 27]，用于反映土壤微生物群落的功能多樣性.
(1)
(2)
(3)
(4)
式中：Ci為第i孔在590 nm下的光密度值；R為對(duì)照孔的光密度，若Ci-R≤0，記為0；n為Biolog-ECO微平板的碳源種類數(shù)目，n=31；Pi為第i孔相對(duì)光密度值(C-R)與整個(gè)平板相對(duì)光密度總和的比率；ni為第i孔的相對(duì)吸光度.
利用SPSS 22.0對(duì)土壤微生物功能多樣性指數(shù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用最小顯著差異法(LSD)進(jìn)行多重比較. 根據(jù)培養(yǎng)第72小時(shí)數(shù)據(jù)，利用R軟件vegan包進(jìn)行主成分分析(PCA)及冗余分析(RDA)，并用ggplot2包進(jìn)行繪圖.
2 結(jié)果與分析
2.1 土壤微生物利用全部碳源的代謝活性變化
噴施處理后第30天、第60天土壤微生物群落AWCD隨培養(yǎng)時(shí)間的變化情況如圖1所示. 由圖1可見，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，土壤微生物對(duì)全部碳源的代謝能力呈現(xiàn)出增加的趨勢(shì). 噴施處理后第30天、培養(yǎng)第168小時(shí)各處理組之間無顯著差異(P>0.05)，但處理Ⅲ的AWCD值相對(duì)較高，而其他三組處理的AWCD值非常接近. 噴施處理后第60天，各處理組間AWCD值大小為CK>處理Ⅲ>處理Ⅱ>處理Ⅰ，但單因素方差分析結(jié)果表明，培養(yǎng)第168小時(shí)各處理組間AWCD值無顯著差異(P>0.05). 表明噴施處理后第60天，不同處理對(duì)土壤微生物活性沒有顯著影響. 對(duì)比分析噴施處理后第30天和第60天兩個(gè)階段土壤微生物群落AWCD值(見表1)發(fā)現(xiàn)，處理后第60天各處理土壤微生物群落AWCD值都有所下降，其中處理Ⅰ和處理Ⅲ顯著降低(P<0.05)，而CK和處理Ⅱ沒有顯著降低(P>0.05).
2.2 土壤微生物利用不同種類碳源的動(dòng)力學(xué)特征
Biolog-ECO微平板中的全部碳源可劃分為六大類，即多聚物類、糖類、氨基酸類、胺類、羧酸類、酚酸類. 培養(yǎng)第72小時(shí)時(shí)，不同處理下的土壤微生物對(duì)不同碳源利用情況如圖2所示. 由圖2可知，噴施處理后第30天土壤微生物對(duì)碳水化合物類碳源的利用
圖1 不同處理土壤微生物群落平均顏色變化率(AWCD)隨培養(yǎng)時(shí)間的變化Fig.1 Variation of soil microbial communities average well color development(AWCD) with incubation time in different treatment
Table 1 ANOVA results of AWCD for different treatments incubation 168 hours under 30 d and 60 d after spraying
能力最強(qiáng)，對(duì)羧酸類碳源的利用能力最弱，并且對(duì)碳水化合物類碳源和羧酸類碳源的利用能力上存在顯著差異(P<0.05)，說明利用碳水化合物類碳源的土壤微生物群落顯著多于利用羧酸類碳源的土壤微生物群落. 噴施處理后第30天，各處理間土壤微生物利用羧酸類和氨基酸類碳源能力都存在顯著差異(P<0.05)，對(duì)其他類型碳源利用能力無顯著差異(P>0.05)，說明不同處理對(duì)利用羧酸類和氨基酸類碳源的微生物影響較大. 噴施處理后第60天土壤微生物對(duì)多聚物、碳水化合物、氨基酸和胺類碳源的利用能力相對(duì)較強(qiáng)，對(duì)酚酸類和羧酸類碳源的利用能力相對(duì)較弱. 噴施處理后第60天，各處理間土壤微生物利用各類碳源均無顯著差異，說明噴施處理后第60天各處理造成的差異減弱. 對(duì)比噴施處理后第30天和第60天土壤微生物利用各類碳源的能力發(fā)現(xiàn)，碳水化合物類碳源和氨基酸類碳源在兩個(gè)時(shí)期內(nèi)的AWCD值降幅最大.
注：同一碳源類型中不同字母表示差異顯著(P≤0.05).圖2 不同處理土壤微生物對(duì)各類碳源利用情況Fig.2 Utilization of different carbon sources of soil microorganisms under the different treatments
2.3 土壤微生物對(duì)碳源利用的多樣性指數(shù)分析
由表2可知，噴施處理后后第30天土壤微生物群落Shannon-Wiener指數(shù)和Simpson指數(shù)在處理Ⅱ中顯著低于其他處理(P<0.05)，不同處理對(duì)McIntosh指數(shù)和豐富度指數(shù)沒有顯著影響(P>0.05). 噴施除草劑處理后第60天，各處理對(duì)土壤微生物群落多樣性指數(shù)都無顯著影響(P>0.05). 同時(shí)，對(duì)噴施處理后后第30天和第60天各處理的多樣性指數(shù)進(jìn)行t檢驗(yàn)(數(shù)據(jù)未列出)發(fā)現(xiàn)，與第30天相比，第60天的土壤微生物多樣性指數(shù)降低，但所有處理的第30天和第60天土壤微生物多樣性指數(shù)都無顯著差異(P>0.05). 說明噴施除草劑處理后，隨著時(shí)間的變化土壤微生物群落功能多樣性并不存在顯著變化的情況. 噴施處理后第30天，各處理對(duì)土壤微生物群落Shannon-Wiener指數(shù)和Simpson指數(shù)有顯著影響(P<0.05)，而噴施處理后第60天這種影響不顯著，說明噴施除草劑對(duì)土壤微生物群落功能多樣性有影響，但60 d后這種影響開始減退或各處理間差異消失.
2.4 土壤微生物群落利用碳源的主成分分析
表2 不同處理土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)
注：數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差. 同一行中不同字母表示差異顯著(P≤0.05).
基于培養(yǎng)第72 小時(shí)時(shí)的吸光值數(shù)據(jù)，對(duì)噴施處理后第30天和第60天的土壤微生物代謝碳源能力進(jìn)行主成分分析(PCA)，按照主成分提取原則[28]共提取了7個(gè)主成分(principal component，PC). 結(jié)果顯示，7個(gè)主成分累積方差貢獻(xiàn)率為86.6%，其中PC1(主成分1)～PC7(主成分7)的方差貢獻(xiàn)率分別為60.36%、7.48%、5.95%、3.79%、3.52%、3.10%和2.44%.
不同處理土壤微生物碳源代謝的PCA排序圖如圖3所示. 由圖3可知，PC1和PC2共解釋了67.84%的變異. 在PC1上噴藥后各處理明顯分為兩簇，第30天的所有樣地聚為一簇，第60天的所有樣地聚為另一簇. PCA分析發(fā)現(xiàn)，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)在噴施處理后第30天和第60天間呈現(xiàn)出顯著差異(P<0.05). 在PC2上，噴施處理后第30天處理Ⅱ的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和其他處理存在顯著差異(P<0.05)，噴施處理后第60天各處理間的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)沒有顯示出顯著差異(P>0.05).
注：30 d和60 d分別表示噴施處理后第30天和第60天，下同.圖3 不同處理土壤微生物群落利用碳源能力的主成分分析Fig.3 Principal component analysis of carbon sources utilization of soil microbial communities under different treatments
通過對(duì)主成分相關(guān)性矩陣進(jìn)行分析(見表3)可知，對(duì)PC1貢獻(xiàn)較大的碳源共12種，其中碳水化合物類碳源占66.67%，氨基酸類碳源占16.67，多聚物類碳源和酚酸類碳源均占8.33%，說明影響PC1的主要是碳水化合物類碳源，其次是氨基酸類碳源. 對(duì)PC2貢獻(xiàn)較大的碳源只有一種，為碳水化合物類碳源.
表3 與PC1、PC2顯著相關(guān)的主要碳源種類
2.4 土壤微生物群落功能冗余分析
利用培養(yǎng)第72 小時(shí)的吸光值數(shù)據(jù)進(jìn)行降趨對(duì)應(yīng)分析(detrended correspondence analysis，DCA)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，排序軸中的最大值為1.1，因此選擇冗余分析(RDA)方法分析環(huán)境因子與土壤微生物碳源代謝能力之間的關(guān)系(見圖7). 結(jié)果顯示，軸1和軸2分別解釋碳源代謝能力總變異的38.32%和2.51%，pH、w(TC)和w(TN)與軸1和軸2都呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，其中pH與土壤微生物碳源代謝能力相關(guān)性最強(qiáng)(箭頭連線長(zhǎng)度最長(zhǎng)). 蒙特卡羅置換檢驗(yàn)(Monte Carlo permutation test)顯示顯著性為0.02，則認(rèn)為排序結(jié)果可以接受環(huán)境因子對(duì)碳源代謝能力變異的解釋量.
注：TC—w(TC)；TN—w(TN).圖4 土壤微生物群落功能特征與環(huán)境因子的冗余分析Fig.4 RDA for environmental factors and soil microbial function diversity
3 討論
土壤微生物群落利用全部碳源的能力隨著處理后時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，與噴施處理后第30天相比，噴施處理后第60天土壤微生物利用碳源的能力降低，處理Ⅰ和處理Ⅲ的土壤微生物群落AWCD都顯著下降，但同一時(shí)期內(nèi)各處理間土壤微生物群落利用碳源的能力沒有顯著差異. 說明莠去津在不同濃度梯度下對(duì)土壤微生物活性沒有產(chǎn)生顯著影響，而隨著時(shí)間增加除草劑對(duì)土壤微生物活性的影響呈現(xiàn)出增加的趨勢(shì). 噴施處理后第30天各處理土壤微生物群落對(duì)碳源的利用能力表現(xiàn)為處理Ⅰ相對(duì)較高. 有研究認(rèn)為，在土壤中有農(nóng)藥開始介入時(shí)，土壤微生物群落對(duì)進(jìn)入到土壤中的農(nóng)藥具有一定的耐受性，并且一些微生物會(huì)利用農(nóng)藥為碳源進(jìn)行分解作用，這會(huì)導(dǎo)致微生物進(jìn)行繁殖[29]. 該研究發(fā)現(xiàn)，莠去津?qū)ν寥牢⑸锶郝涞挠绊懺趪娛┨幚砗蟮?0天開始顯現(xiàn)，表現(xiàn)為CK處理的土壤微生物群落利用碳源能力相對(duì)較大，其次是處理Ⅲ、處理Ⅱ、處理Ⅰ. 因此，噴施處理后第60天各噴施農(nóng)藥處理組相比，低濃度莠去津處理的土壤微生物群落活性相對(duì)較高.
土壤微生物對(duì)不同碳源利用能力的差異在一定程度上指示土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)組成[30]. 噴施處理后兩個(gè)時(shí)期(第30天、第60天)土壤微生物群落對(duì)羧酸類碳源的利用能力都較低，并且各處理下土壤微生物群落對(duì)碳水化合物類碳源的利用能力降幅最大，隨著時(shí)間的增加對(duì)利用碳水化合物類碳源的微生物的影響加劇. 研究[31- 32]發(fā)現(xiàn)，干擾后不同時(shí)期偏好利用不同類型碳源的土壤微生物可能增加或減少. 不同處理間土壤微生物對(duì)某些類型碳源利用存在顯著差異，同時(shí)也對(duì)一些類型碳源的利用沒有顯著差異. 姚斌等[33]認(rèn)為，土壤微生物對(duì)不同類型碳源的利用不同，可能是除草劑進(jìn)入土壤后土壤微生物能利用的碳源種類發(fā)生了改變. 孫約兵等[34]研究發(fā)現(xiàn)，施用一定濃度的硝磺草酮后，土壤微生物群落對(duì)Biolog-ECO微平板中全部碳源的代謝能力整體上呈現(xiàn)出升高的狀態(tài)，但從土壤微生物對(duì)各類型的碳源利用能力上看，不同濃度的硝磺草酮處理間存在一定的差異.
Shannon-Wiener指數(shù)、Simpson指數(shù)、McIntosh指數(shù)和豐富度指數(shù)分布用來反映土壤微生物的豐富度、最常見的物種優(yōu)勢(shì)度和均勻度[30,35]. 噴施除草劑后，隨著時(shí)間的增加各多樣性指數(shù)都有所降低，但是差異并未達(dá)到顯著水平. 楊永華等[36]研究認(rèn)為，農(nóng)藥污染的土壤中土壤微生物群落Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和McIntosh指數(shù)顯著降低，主要原因是由于受農(nóng)藥污染土壤微生物群落中利用碳源的微生物物種的均一程度受到顯著影響.
噴施處理后第30天，土壤微生物群落Shannon-Wiener指數(shù)和Simpson指數(shù)在處理Ⅱ中顯著低于其他處理，而噴施處理后第60天，各處理間土壤微生物群落多樣性指數(shù)表現(xiàn)出無顯著差異. 分析認(rèn)為，在莠去津施用初期，土壤微生物群落對(duì)不同濃度的處理響應(yīng)不同，碳源利用的多樣性存在明顯差異，而隨著時(shí)間的推移，這種影響被微生物群落自身的修復(fù)調(diào)劑能力抵消. 除草劑進(jìn)入土壤后可能造成土壤微生物群落功能發(fā)生變化，適量的農(nóng)藥處理將使得土壤中原有的微生物群落內(nèi)部種群間的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系發(fā)生變化，原有的平衡遭到破壞，優(yōu)勢(shì)類群改變[37]. Ros等[38]研究發(fā)現(xiàn)，高濃度莠去津刺激土壤細(xì)菌生長(zhǎng)，這些都可能使微生物多樣性降低. Moreno等[39]通過研究不同濃度莠去津處理下的土壤微生物量碳和呼吸發(fā)現(xiàn)，高濃度條件下土壤微生物量碳減少，同時(shí)土壤微生物呼吸增強(qiáng). 但是筆者并沒有發(fā)現(xiàn)高濃度的莠去津能夠顯著減少土壤微生物群落的功能多樣性指數(shù). 鄭麗萍等[40]認(rèn)為，低濃度有機(jī)氯會(huì)造成逆境刺激微生物代謝加強(qiáng)，導(dǎo)致土壤微生物對(duì)碳源的利用率較高，而高濃度有機(jī)氯污染可能對(duì)微生物的活性起極大的抑制作用，減少微生物多樣性. 農(nóng)藥作為土壤微生物群落的外來干擾因素，濃度較小時(shí)，其干擾被微生物群落自身強(qiáng)大的功能性冗余所抵消，而當(dāng)其濃度增大時(shí)，可能使得某些微生物菌種的生長(zhǎng)受到抑制，最終導(dǎo)致土壤微生物群落均勻性下降[41]. 對(duì)土壤微生物代謝特性進(jìn)行RDA分析，表明pH是土壤微生物碳源利用能力差異的重要因子，推測(cè)噴施莠去津?qū)ν寥览砘再|(zhì)的影響是造成土壤微生物碳源利用能力差異的重要原因. 但筆者發(fā)現(xiàn)，包括pH在內(nèi)的環(huán)境因子只能解釋變量的42.21%，因此除此之外還存在其他影響因素，需要進(jìn)一步研究.
該研究對(duì)亞致死劑量除草劑莠去津處理后的土壤微生物群落功能多樣性進(jìn)行了研究，得到了一些初步結(jié)果. 雖然Biolog-ECO微平板技術(shù)能夠簡(jiǎn)單、方便、快捷靈敏地反映出土壤微生物碳源代謝能力，進(jìn)而評(píng)估土壤微生物群落碳源代謝功能多樣性. 但由于其自身存在的局限性，即微平板中只有31種碳源，導(dǎo)致其不能反映自然條件下土壤中的復(fù)雜環(huán)境，致使所得的研究結(jié)果也并不能夠完整地反映土壤中微生物群落的功能多樣性和復(fù)雜性[42]. 因此，在后續(xù)的研究中，還應(yīng)結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)，深入研究亞致死劑量除草劑對(duì)非靶標(biāo)植物群落下的土壤微生物群落的影響，以期為闡釋除草劑對(duì)土壤微生物多樣性的影響提供理論依據(jù).
4 結(jié)論
a) 噴施不同濃度莠去津后對(duì)土壤微生物代謝活性存在一定程度的影響，但是差異不明顯. 全劑量的莠去津(處理Ⅰ)噴施處理后，對(duì)土壤微生物代謝活性的影響程度最大，亞致死劑量的影響程度相對(duì)較弱.
b) 噴施除草劑莠去津后，隨著時(shí)間的增加對(duì)利用不同類型碳源的土壤微生物群落都存在一定的影響，其中對(duì)利用碳水化合物類碳源的微生物的影響最為強(qiáng)烈.
c) 噴施莠去津后，土壤微生物群落的Shannon-Wiener指數(shù)、Simpson指數(shù)和McIntosh指數(shù)都呈下降趨勢(shì)，但沒有達(dá)到顯著水平(P>0.05). 除草劑的施用在一定程度上降低土壤微生物群落功能多樣性.
d) 土壤理化因子是土壤微生物代謝能力差異的重要影響因素，該研究中pH、TN、TC都對(duì)土壤微生物群落代謝碳源能力有顯著影響，而pH的影響最強(qiáng)烈.
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Effects of Atrazine on Soil Microbial Functional Diversity of Wild Weed Communities
YAN Bing1,2, QI Yue1,2, FU Gang1,2, HE Jing1,3, XIAO Nengwen1, LI Junsheng1*
1.Chinese Research Academy of Environmental Sciences, Beijing 100012, China 2.College of Water Sciences, Beijing Normal University, Beijing 100875, China 3.School of Environment and Natural Resources, Renmin University of China, Beijing 100872, China
To evaluate the impacts of atrazine on soil microbial communities under wild weed communities, the functional diversity of soil microbial communities in different treatments was investigated with Biolog-ECO micro-plates. The results showed that spraying concentrations of atrazine had no significant influence on soil microbial carbon utilization (P>0.05). Compared with the 30thday after spraying, the soil microbial carbon utilization ability was reduced in the 60thday. The I and III treatments were reduced significantly (P<0.05), while the CK and II treatments had no significant reduction (P>0.05). After spraying herbicide, the order of the ability of soil microbial carbon utilization after 60 days was CK>III>II>I. The utilization abilities of different types of carbon sources were different after spraying herbicide. 30 days after spraying, the soil microbial communities mostly used carbohydrates as carbon source, and used Carboxylic acid least. 60 days after spraying, the ability to use carbohydrates as carbon source was largely declined, with treatments declined by 0.63, 0.78, 0.85, 0.76 respectively. 30 days after spraying herbicide, the Shannon-Wiener and Simpson indices of soil microbial community in treatment II were significant less than other treatments (P<0.05), but the diversity indices showed no significant differences among treatments 30 days after spraying herbicide. Compared with the 30thday after spraying, the diversity index was decreased in the 60thday after spraying, but the differences were not significant (P>0.05). Principal component analysis demonstrated that the principal components extracted from 31 carbon sources were related to soil microbial carbon source utilization; the principal components accounted for 86.6% of the total variables variance. Principal component 1 could separate characteristics of soil microbial community after spraying. Redundancy Analysis showed that pH was the main factor that was most highly correlated with variance of soil microbial carbon utilization. The functional diversity of soil microbial communities will be changed by spraying the herbicide atrazine.
atrazine; soil microorganisms; functional diversity; Biolog-ECO micro-plate
2017-02-14
2017-04-18
科技部重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2016YFC1201100)；北京市財(cái)政資金項(xiàng)目(PXM2014- 178218- 000005)
閆冰(1986-)，男，黑龍江綏化人，yanbing718@126.com.
*責(zé)任作者，李俊生(1968-)，男，安徽巢湖人，研究員，博士，博導(dǎo)，主要從事生物多樣性保護(hù)、自然保護(hù)區(qū)管理、生物安全評(píng)估以及氣候變化影響評(píng)價(jià)研究，lijsh@craes.org.cn
X172
1001- 6929(2017)08- 1246- 09
A
10.13198j.issn.1001- 6929.2017.02.54
閆冰,齊月,付剛,等.莠去津?qū)σ吧参锶郝湎峦寥牢⑸锕δ芏鄻有缘挠绊慬J].環(huán)境科學(xué)研究,2017,30(8):1246- 1254.
YAN Bing,QI Yue,FU Gang,etal.Effects of atrazine on soil microbial functional diversity of wild weed communities [J].Research of Environmental Sciences,2017,30(8):1246- 1254.
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