李玲++陸曉晨++馬懷宇++呂德國(guó)

摘要：試驗(yàn)以山定子（Malus baccata Borkh.）實(shí)生苗為試驗(yàn)材料，研究根域亞低溫下不同外源氮（NO3-和NH4+）對(duì)山定子根系活力、根系氮代謝關(guān)鍵酶活性以及根系抗氧化酶活性的影響。結(jié)果表明，亞低溫條件下，添加外源氮可在一定時(shí)間內(nèi)提高山定子的根系活力；提高了山定子根系硝酸還原酶（NR）和谷氨酸合酶（GOGAT）活性，但降低了谷氨酰胺合成酶（GS）活性，谷氨酸脫氫酶（GDH）活性整體呈上升趨勢(shì)。不同氮源對(duì)山定子根系氮代謝酶活性影響不同，NH4+處理的山定子根系GS活性和GDH活性高于NO3-處理。亞低溫條件下，添加外源氮提高了根系過(guò)氧化物酶（POD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）活性，但降低了超氧化物歧化酶（SOD）活性。因此，施加外源氮可緩解根域亞低溫對(duì)植株生長(zhǎng)的傷害。同時(shí)研究表明，兩種外源氮對(duì)山定子根系響應(yīng)亞低溫具有不同的影響，為蘋(píng)果生產(chǎn)中合理施用氮肥提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：亞低溫；外源氮；山定子（Malus baccata Borkh.）；根系；氮代謝；抗氧化酶

中圖分類號(hào)：S661.9；Q945.13 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）13-2471-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.13.018

Effects of Different Exogenous Nitrogen on Nitrogen Metabolism of Malus baccata Borkh. Roots Under Mild Hypothermia

LI Ling1，LU Xiao-chen2，MA Huai-yu2，L？譈 De-guo2

（1.Xingcheng Secondary Vocational and Technical College， Xingcheng 125100， Liaoning， China；

2.College of Horticulture， Shenyang Agricultural University， Shenyang 110866， China）

Abstract： The seedlings of Malus baccata Borkh. were used as materials to study the efficiency of exogenous nitrogen on root vigor， nitrogen metabolism， and activities of antioxidant enzymes in roots under mild hypothermia. The results showed that， under mild hypothermia exogenous nitrogen increased root vigor within a certain time， increased the activities of the nitrate reductase and glutamate synthase， but reduced glutamine synthetase activity， while glutamate dehydrogenase activity showed an upward trend as a whole. In addition， different kinds of nitrogen showed different effects on enzyme activities of root nitrogen metabolism. The activities of glutamine synthetase and glutamate dehydrogenase by NH4+ treatment were higher than that by NO3- treatment. Under mild hypothermia， exogenous nitrogen significantly enhanced the activities of POD and CAT， but had negative effects on SOD activity. Therefore， exogenous nitrogen can alleviate the damage caused by mild hypothermia stress on the root zone. The results showed that two kinds of exogenous nitrogen had different effects on the response of mild hypothermia， which provided the theoretical basis for rational application of nitrogen fertilizer in apple production.

Key words： mild hypothermia； exogenous nitrogen； Malus baccata Borkh.； root； nitrogen metabolism； antioxidant enzyme

目前，隨著中國(guó)蘋(píng)果抗寒育種研究的不斷進(jìn)步，寒富蘋(píng)果已經(jīng)成為具有代表性的抗寒大果型品種，并在沈陽(yáng)等蘋(píng)果產(chǎn)區(qū)廣泛栽植。但是沈陽(yáng)地區(qū)早春氣溫回升較快，而土溫回升相對(duì)滯后，導(dǎo)致植株根系處于亞低溫狀態(tài)，影響生長(zhǎng)季初期植株的生長(zhǎng)發(fā)育。

氮代謝是植物的基礎(chǔ)生理過(guò)程之一，是春季樹(shù)體恢復(fù)生長(zhǎng)、萌芽、展葉、開(kāi)花等生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。王海寧等[1]研究了不同蘋(píng)果砧木對(duì)硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的吸收利用，結(jié)果表明，蘋(píng)果砧木是喜硝態(tài)氮植物，對(duì)硝態(tài)氮的利用率及征調(diào)能力均高于銨態(tài)氮。植物的氮代謝過(guò)程中，有一系列的相關(guān)酶參與反應(yīng)，其中硝酸還原酶（NR）、谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸合酶（GOGAT）及谷氨酸脫氫酶（GDH）為氮代謝途徑中的關(guān)鍵酶。氮代謝對(duì)環(huán)境溫度比較敏感，尤其是低溫。關(guān)于低溫脅迫的研究表明，根系GS活性在逐漸降溫和迅速降溫條件下均有顯著的提高，其中迅速降溫處理GS活性較高，根系GDH活性呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，GOGAT活性較低，可能是由于逐漸降溫使根系有較長(zhǎng)時(shí)間的反應(yīng)過(guò)程，對(duì)氮代謝功能傷害較小，為迅速降溫條件下根系應(yīng)激反應(yīng)更強(qiáng)烈提供了證據(jù)[2]。研究表明，外源施加不同形態(tài)的氮素可以提高植株葉綠素含量、根系活力及氮代謝關(guān)鍵酶活性，以緩解低溫對(duì)植株的傷害[3]。另有研究表明[4]，在逆境條件下植物的抗氧化酶系統(tǒng)均可清除體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧等物質(zhì)。其中超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）在活性氧的清除方面發(fā)揮重要的作用，保持體內(nèi)活性氧代謝的平衡，從而對(duì)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)起到保護(hù)作用，在一定程度上增加植株對(duì)逆境脅迫的抵抗能力。上述各項(xiàng)酶活力能夠較好地反映植物的抗逆性強(qiáng)弱，但其在不同處理下的變化存在差異[5，6]。劉國(guó)英等[7]研究發(fā)現(xiàn)，亞低溫條件下，不同硝銨配比對(duì)番茄幼苗抗氧化酶活性有一定的影響，當(dāng)NO3--N/NH4+-N比例為75/25時(shí)最有利于提高番茄植株的抗寒性。

為此，試驗(yàn)以北方地區(qū)常用蘋(píng)果砧木山定子為試驗(yàn)材料，研究亞低溫條件下不同外源氮對(duì)植物氮代謝及活性氧清除系統(tǒng)調(diào)節(jié)的生理特征，以期為蘋(píng)果生產(chǎn)中氮肥的合理施用以及對(duì)亞低溫條件下根系功能的改善提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2015年4月在沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹(shù)栽培與生理生態(tài)試驗(yàn)基地進(jìn)行，以當(dāng)年生山定子（Malus baccata Borkh.）實(shí)生苗為試驗(yàn)材料，種子經(jīng)層積催芽后播于穴盤(pán)中，常規(guī)管理，待幼苗長(zhǎng)出4～5片真葉后移苗至黑色塑料營(yíng)養(yǎng)缽（上口直徑10 cm×高10 cm）中，待山定子實(shí)生苗長(zhǎng)至15片真葉時(shí)，挑選生長(zhǎng)一致的轉(zhuǎn)入人工氣候箱進(jìn)行試驗(yàn)處理。

1.2 試驗(yàn)處理

1.2.1 亞低溫處理 根系置于5 ℃的條件下后，將整株植株放入培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱溫度為18 ℃（晝）/ 8 ℃（夜），光照14 h，以整株植株都生長(zhǎng)在18 ℃（晝）/8 ℃（夜）中的幼苗作為對(duì)照，分別于處理后0、2、4、6、8、10、12、14、16 d進(jìn)行取樣，試驗(yàn)5次重復(fù)。

1.2.2 加氮處理 在亞低溫處理前，根系分別澆灌2 mmol/L的KNO3和2 mmol/L的NH4Cl溶液。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 根系氮代謝關(guān)鍵酶活性的測(cè)定 根系活力采用TTC法測(cè)定[8]；硝酸還原酶（NR）采用磺胺比色法測(cè)定[9]。

按參考文獻(xiàn)[10]的方法提取根系中的粗酶液，取根系樣品0.2 g，加入2 mL提取緩沖液，冰浴研磨，轉(zhuǎn)移于離心管中離心，上清液即為粗酶提取液，粗酶液用于谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合酶、谷氨酸脫氫酶活性的測(cè)定。

GS活性參考文獻(xiàn)[9]的方法測(cè)定；NADH-GOGAT活性采用參考文獻(xiàn)[11]的方法測(cè)定，以在30 ℃條件下反應(yīng)混合液每分鐘減少1 μmol的NADH為一個(gè)酶活性單位，總NADH-GOGAT活性計(jì)算以每分鐘每毫克酶液催化NADH減少的微摩爾數(shù)表示；NADH-GDH活性參考參考文獻(xiàn)[12]的方法測(cè)定，GDH活性以每分鐘在30℃下氧化1 μmol的NADH為1個(gè)酶活單位。

1.3.2 根系抗氧化酶活性的測(cè)定 SOD活性測(cè)定參考文獻(xiàn)[13]的方法，以抑制氮藍(lán)四唑（NBT）光氧化還原50%的酶量為1個(gè)活力單位（U）；POD活性采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定，以每分鐘OD值變化0.1為一個(gè)酶活單位（U）；CAT活性采用文獻(xiàn)[14]的方法測(cè)定，以每分鐘OD值降低0.043 6的酶量為1個(gè)活力單位（U）。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源氮對(duì)亞低溫下山定子根系活力的影響

由圖1可見(jiàn)，對(duì)照的根系活力在處理的前2 d快速下降，此后保持在較低的水平。添加NO3-處理和添加NH4+處理的根系活力在前4 d表現(xiàn)出相反的變化趨勢(shì)，前者的根系活力先升高后降低，后者的根系活力先下降后升高。4 d后兩個(gè)處理的根系活力呈上升的趨勢(shì)并且始終高于對(duì)照。添加NO3-處理的根系活力在第10 天達(dá)到最大值，并且明顯高于NH4+處理，為對(duì)照的1.72倍，之后根系活力逐漸降低。NH4+處理的根系活力4 d后呈上升的趨勢(shì)，但在4～12 d一直低于NO3-處理，12 d后出現(xiàn)一個(gè)快速升高的階段，在14 d后略高于NO3-處理。

2.2 外源氮對(duì)亞低溫下山定子根系氮代謝關(guān)鍵酶活性的影響

2.2.1 外源氮對(duì)亞低溫下山定子根系谷氨酰胺合成酶活性的影響 由圖2可見(jiàn)，對(duì)照中GS活性一直保持在較高水平。與對(duì)照相比，添加氮素處理后，根系GS活性在處理的前2 d大幅度降低，此后穩(wěn)定在較低水平。添加NO3-和NH4+處理的GS活性水平在第2～16天一直相近。至處理結(jié)束，添加NO3-和NH4+處理的GS活性均顯著低于對(duì)照，分別為對(duì)照的58.73%、62.03%。

2.2.2 外源氮對(duì)亞低溫下山定子根系硝酸還原酶活性的影響 由圖3可見(jiàn)，處理過(guò)程中，對(duì)照的NR活性不斷增強(qiáng)，但低于添加氮素處理的植株。添加NO3-處理的NR活性在前4 d呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，此后開(kāi)始降低，在第6天酶活性降到低谷后又呈升高的趨勢(shì)，而添加NH4+處理的NR活性則在前6 d呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，此后開(kāi)始下降，在第8天酶活性降到低谷后又呈上升的趨勢(shì)。至處理的第10天添加NO3-和NH4+處理的NR活性達(dá)到峰值，分別為對(duì)照的1.2倍和1.3倍，10 d后NO3-處理的NR活性迅速下降，至第14天達(dá)到低谷后又有所升高，NH4+處理的NR活性在10 d后趨于穩(wěn)定。處理期間，添加NH4+處理的NR活性始終高于添加NO3-處理的NR活性。

2.2.3 外源氮對(duì)亞低溫下山定子根系谷氨酸合酶活性影響 由圖4可見(jiàn)，對(duì)照中GOGAT的活性一直保持在較低水平。與對(duì)照相比，添加不同形態(tài)氮素后，NH4+處理的根系GOGAT活性始終顯著高于對(duì)照和NO3-處理，添加NO3-處理的根系GOGAT活性在處理的0～10 d低于對(duì)照，處理10 d后酶活力迅速上升并且顯著高于對(duì)照。添加NO3-處理后，根系GOGAT活性在處理的0～6 d緩慢下降，到第6天下降到最小值，比對(duì)照降低了53.32%，處理6～10 d根系GOGAT活性趨于穩(wěn)定，10 d后GOGAT活性迅速升高，到處理的12 d時(shí)升高到最大值，為對(duì)照的3.04倍。添加NH4+處理后，根系GOGAT活性表現(xiàn)出迅速升高的趨勢(shì)，到處理的第8天達(dá)到最大值，為對(duì)照的4.57倍。

2.2.4 外源氮對(duì)亞低溫下山定子根系谷氨酸脫氫酶活性的影響 由圖5可見(jiàn)，添加NH4+后山定子根系GDH活性始終高于對(duì)照和NO3-處理，NH4+處理的根系GDH活性呈現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢(shì)，到處理的第10天達(dá)到最大值，為對(duì)照的1.61倍，處理10 d后根系GDH活性逐漸下降到對(duì)照水平。添加NO3-處理的根系GDH活性呈現(xiàn)出先下降后上升的變化趨勢(shì)。NO3-處理根系GDH活性在處理0～4 d表現(xiàn)為下降趨勢(shì)，至第4天下降到最小值，比對(duì)照降低了47.87%，處理4～10 d中根系GDH活性迅速上升，在第10天上升到最大值，為對(duì)照的1.32倍。至第16天NO3-和NH4+處理與對(duì)照三者間差異不大。

2.3 外源氮對(duì)亞低溫下山定子根系抗氧化酶活性的影響

2.3.1 外源氮對(duì)亞低溫下山定子根系過(guò)氧化物酶活性的影響 由圖6可知，亞低溫條件下添加不同形態(tài)的氮素后，根系POD活性均高于對(duì)照。添加NO3-處理后，0～6 d根系POD活性表現(xiàn)為上升的變化趨勢(shì)，處理的第8天活性出現(xiàn)降低后又有所上升，處理14～16 d根系POD活性表現(xiàn)出明顯的增加趨勢(shì)。添加NH4+處理后，0～2 d根系POD活性呈現(xiàn)出上升的變化趨勢(shì)，第2～4天活力有所降低，4 d后根系POD活性緩慢增加，第8天后根系POD活性增加幅度加大，至第12天達(dá)到最高值，約為對(duì)照的2倍，14 d后根系POD活性迅速降低，逐漸接近對(duì)照值。處理期間，除第4、6、16天外，其余根系POD活性都表現(xiàn)為NO3-處理低于NH4+處理。

2.3.2 外源氮對(duì)亞低溫下山定子根系超氧化物歧化酶活性的影響 由圖7可知，在亞低溫條件下添加不同形態(tài)的氮素后，根系SOD活性均低于對(duì)照。添加NO3-處理后，根系SOD活性在處理的0～2 d表現(xiàn)為下降的變化趨勢(shì)，第2～14天SOD活性的變化趨勢(shì)基本保持水平，從第14天開(kāi)始略有上升。添加NH4+處理后，根系SOD活力一直表現(xiàn)為下降的趨勢(shì)，直至處理的第14天達(dá)到最小值，比對(duì)照降低了5.57%，14 d后根系SOD活性上升至與NO3-處理相近。在整個(gè)處理期間，NH4+處理的根系SOD活性在0～10 d一直高于NO3-處理，但12 d后則下降至低于NO3-處理。

2.3.3 外源氮對(duì)亞低溫下山定子根系過(guò)氧化氫酶的影響 由圖8可知，亞低溫條件下添加不同形態(tài)的氮素后，根系CAT活性基本都高于對(duì)照。添加NO3-處理后，根系CAT活性在2～4 d處理中迅速升高，第4天達(dá)到最大值，為對(duì)照的2.05倍，4～6 d CAT活性降低，6 d后根系CAT活性雖有所上升，但變化趨勢(shì)比較平緩，14 d后活性出現(xiàn)下降變化。添加NH4+處理后，根系CAT活性在處理的2～4 d也表現(xiàn)出迅速上升的變化趨勢(shì)，4～8 d活性有所降低，處理8 d后根系CAT活性又迅速增加，至第10天達(dá)到最大值，處理10 d后根系CAT活性變化趨勢(shì)基本穩(wěn)定。在整個(gè)處理期間，0～10 d中根系CAT活力表現(xiàn)為NO3-處理高于NH4+處理，處理10 d后表現(xiàn)為NO3-處理低于NH4+處理。

3 小結(jié)與討論

在逆境條件下，根系是首先遭受傷害的器官，根系活力反映了根系代謝能力的強(qiáng)弱，直接影響植株的生長(zhǎng)和抗逆性。本試驗(yàn)中，在亞低溫條件下添加不同形態(tài)氮素后對(duì)根系活力有一定的影響，兩處理的根系活力皆比對(duì)照高，表明在亞低溫下添加外源氮素能在一定程度上提高根系的代謝活力，促進(jìn)了根系對(duì)氮素的同化，從而來(lái)抵抗低溫環(huán)境的脅迫。并且在亞低溫條件下，添加NO3-處理的根系活力高于添加NH4+處理的根系活力，原因可能是由于植物吸收利用NO3-需要先消耗能量將其還原進(jìn)而加以同化[15]，而NH4+可直接被同化利用，所以添加NO3-處理的根系活力有所增加。

氮代謝是植物生長(zhǎng)發(fā)育中的重要代謝過(guò)程，植物可利用的氮素形態(tài)主要有NO3--N和NH4+-N兩種形式，并且都為主動(dòng)吸收過(guò)程。其中硝酸還原酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合酶以及谷氨酸脫氫酶為氮素同化過(guò)程中的關(guān)鍵酶。NR在氮素同化過(guò)程中可以將NO3-還原，生成NH4+后進(jìn)一步進(jìn)行同化[16]。對(duì)于亞低溫條件下添加不同形態(tài)氮素的處理來(lái)說(shuō)，處理后根系NR活性均處于上升的變化趨勢(shì)，兩個(gè)處理之間添加NO3-處理的NR活性大于NH4+處理。有研究表明，NR活性與其底物的含量密切相關(guān)，是硝酸鹽還原過(guò)程中的關(guān)鍵酶，硝態(tài)氮還原能力的強(qiáng)弱及植物吸收和積累硝態(tài)氮的能力與其活性的高低直接相關(guān)[17]。推測(cè)出現(xiàn)此種結(jié)果可能是由于外源添加NO3--N提高了根系周圍的NO3-離子濃度，進(jìn)而誘導(dǎo)了NR活性的升高。

GS/GOGAT系統(tǒng)是高等植物氨同化過(guò)程中的主要途徑[18]，通過(guò)這一途徑產(chǎn)生的谷氨酰胺和谷氨酸是合成其他代謝產(chǎn)物的前體物質(zhì)。GDH是銨同化過(guò)程中的另一種關(guān)鍵酶，雖然其作用尚有爭(zhēng)議，但初步研究表明，GDH有兩種作用，在外源氮含量過(guò)高時(shí)進(jìn)行NH4+的同化，而在一定條件下又可分解谷氨酸來(lái)為T(mén)CA循環(huán)提供碳骨架[19]，并且有研究指出GDH可能在植物逆境條件下對(duì)緩解銨毒害有重要作用[20]。添加不同形態(tài)氮素對(duì)根系銨同化過(guò)程中的酶活性也存在一定的影響，NH4+處理的GS活性高于NO3-處理，有研究表明，銨態(tài)氮較硝態(tài)氮對(duì)GS活性的促進(jìn)作用更為明顯[21，22]，與本研究結(jié)果一致。本試驗(yàn)結(jié)果表明，亞低溫條件下添加不同形態(tài)氮素后，根系GDH活性表現(xiàn)為上升的變化趨勢(shì)，并且GDH活性一直表現(xiàn)為NH4+處理大于NO3-處理，可能是由于NH4+的大量積累誘導(dǎo)了酶活性的增加，從而來(lái)解除NH4+對(duì)根系的不良影響。

亞低溫條件下，添加不同形態(tài)氮素后明顯降低了根系SOD活性，尤其是對(duì)處理后期酶活性的抑制作用加強(qiáng)，說(shuō)明添加氮素后不僅沒(méi)有緩解亞低溫對(duì)SOD活性的抑制作用，還加劇了處理后期（第8天后）酶活性的抑制程度，且NH4+對(duì)酶活性的抑制作用較強(qiáng)（處理第12天后），這可能是NH4+-N處理后期加重亞低溫脅迫對(duì)SOD的抑制作用。但氮素處理明顯提高了CAT、POD活性，尤其是在處理的中后期NH4+處理的促進(jìn)效應(yīng)強(qiáng)于NO3-。由此看來(lái)，亞低溫下抗氧化酶對(duì)NO3--N和NH4+-N處理的響應(yīng)各異，他們之間的互作機(jī)理還需進(jìn)一步的研究。

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