李玲　趙耀　曹珂珂

摘 要：目的：以乳酸菌為研究對象，研究設(shè)計其凍干工藝。方法：采用響應(yīng)面法優(yōu)化篩選出真空冷凍干燥的保護劑配方。結(jié)果：單因素實驗結(jié)果表明脫脂乳、麥芽糊精和葡萄糖3種保護劑保護效果較好，以細胞存活率為響應(yīng)值，篩選出最佳復(fù)合保護劑為脫脂乳9.51%，麥芽糊精7.77%，葡萄糖7.56%。結(jié)論：通過試驗測得凍干后的存活率可達到90.08%，與預(yù)測值90.8303%接近。

關(guān)鍵詞：乳酸菌；真空冷凍干燥；保護劑；存活率

中圖分類號 Q935 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2017）14-0043-03

Abstract：Objective：The research aimed to study the freeze-drying process of lactic acid bacteria. Method：The response surface method was used to optimize the protective agent for vacuum freeze - drying.Result：The results of single factor experiments showed that the protective effect of defatted milk， maltodextrin and glucose was better， and the best survival rate was 9.51%，maltodextrin was 7.77%，7.56% glucose.Conclusion：The survival rate of the freeze-dried method was 90.08%， which was close to the predicted value of 90.8303%.

Key words：Lactic Acid Bacteria；Freeze-drying；Protectant；Survival rate

近年來，由于微生物學(xué)的迅速發(fā)展，乳酸菌得到了廣泛的研究和開發(fā)，它對機體多方面的保健功能逐漸得到了人們的重視[1]。目前，乳酸菌在乳制品的生產(chǎn)中已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用，它可作為發(fā)酵劑用于酸奶、大豆酸奶、乳飲料等乳制品的生產(chǎn)。乳酸菌凍干粉的制備通常采用真空冷凍干燥技術(shù)，而在冷凍干燥過程中，對菌體的損傷是不可避免的，所以添加適宜的保護劑提高菌種的存活率對乳制品工藝生產(chǎn)具有十分重要的意義[2]。為此，本研究選取5種保護效果較好的凍干保護劑作為實驗對象，通過單因素實驗選擇3種效果較好的凍干保護劑，然后采用 Design-Expert8.0.6軟件的中響應(yīng)面試驗建立數(shù)學(xué)模型確定最佳凍干保護劑配方[3-6]。

1 材料和方法

1.1 實驗材料與儀器

1.1.1 菌種 乳球菌屬（Lactococcus）C1菌株，由同組實驗同學(xué)從酸奶、泡菜中分離而得，并保存在實驗室冰箱供使用。

1.1.2 培養(yǎng)基 MRS液體培養(yǎng)基（用于菌種的傳代、擴培和種子液制備）、MRS固體培養(yǎng)基（用于菌落計數(shù)），均由上海星科生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 主要藥品 葡萄糖、谷氨酸鈉、維生素C、麥芽糊精、脫脂乳。

1.1.4 主要儀器與設(shè)備 BHC-1300IIA/B2-生物潔凈安全柜、DY04-12-44-00-立式壓力蒸汽滅菌器筒、YPB1003-電子天平、JW-3021H-High Speed Centrifuge、CVC FD8-5-冷凍干燥機、BC-50S-冰箱。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程 菌種活化→制備菌液→離心收集菌體（稱重）→加入保護劑溶液→計活菌數(shù)（cfu/mL）→分裝→冰箱預(yù)凍（24h）→真空冷凍干燥→復(fù)水→計活菌數(shù)（cfu/mL）→計算存活率[7]。

1.2.2 菌種活化 取出冰箱里面冷藏的乳酸球菌，以3%的接種量接到100mLMRS液體培養(yǎng)基（滅菌）做第一次活化，經(jīng)37℃恒溫培養(yǎng)24h后，吸取300μL涂平板檢測菌種的純度并記錄下活菌數(shù)，然后進行第二次活化。

1.2.3 活菌測定 以MRS固體培養(yǎng)基為計數(shù)培養(yǎng)基，采用梯度稀釋平板法計數(shù)[8]測活菌數(shù)。

1.2.4 菌體制備 通過查閱大量文獻確定最佳離心條件（4℃，6000r/min，15min）[9]。取8個50mL的無菌離心管，等量移入40mL菌液，在最佳離心條件下進行平衡離心。離心完畢后，取沉淀，用與上述菌液等體積的無菌生理鹽水（用于洗滌菌體）溶解沉淀菌體，進行第二次離心，最終得到乳酸菌泥。

1.2.5 真空冷凍干燥 將平皿先放入4℃冰箱平衡30min，然后放置-40℃冰箱中進行預(yù)冷凍20h。冷凍完成后放入真空冷凍干燥機中，設(shè)置溫度-50℃，抽真空（20～40Pa），干燥24h。

1.2.6 存活率的測定 將充分干燥成粉末的菌體取出后自然解凍，加入13.3mL滅菌的生理鹽水復(fù)水30min，用微量移液器吸取與凍干前等量的1mL菌液進行稀釋涂板計數(shù)。測定凍干前后的活菌數(shù)目，得出3組平行實驗的平均值，最終計算求得保護劑的冷凍存活率[10]。計算公式為：存活率（%）=復(fù)水凍干后的活菌數(shù)/樣品凍干后的活菌數(shù)×100

1.2.7 試驗設(shè)計 通過單因素試驗確定3種對乳酸菌保護效果較好的保護劑，然后采用Box-Behnken實驗設(shè)計，進行響應(yīng)面實驗，最終確定最佳復(fù)合保護劑，并進行結(jié)果驗證。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素保護劑的結(jié)果與分析 根據(jù)保護劑對菌體冷凍干燥的保護機理，結(jié)合有關(guān)文獻報道[11-13]，選取脫脂乳、麥芽糊精、葡萄糖、維生素C、谷氨酸鈉作為單因素保護劑，以存活率為目標，研究它們對乳酸菌的凍干保護效果，通過單因素實驗，選取最優(yōu)的保護劑濃度列表，結(jié)果如表1所示。單因素實驗結(jié)果顯示，脫脂乳、麥芽糊精和葡萄糖這3種保護劑對菌體保護效果較好，其中脫脂乳作為保護劑的影響最顯著，其次是麥芽糊精與葡萄糖，其他保護劑保護效果并不是很理想。因此選取脫脂乳、麥芽糊精和葡萄糖為優(yōu)化因子，然后根據(jù)結(jié)果確定它們各自的添加量，進行復(fù)合保護劑的優(yōu)化。

2.2 Box-Behnken實驗設(shè)計結(jié)果與響應(yīng)面分析

2.2.1 響應(yīng)面實驗因子與水平 根據(jù)單因素實驗結(jié)果，進行三因素三水平響應(yīng)面實驗，表2為試驗因素與水平編碼表。

2.2.2 響應(yīng)面實驗設(shè)計與結(jié)果 詳見表3。

2.2.3 回歸模型與方差分析 對表3的實驗結(jié)果進行回歸分析，編碼值A(chǔ)、B、C分別代表葡萄糖、脫脂乳和麥芽糊精，方差分析數(shù)據(jù)如表4所示。

2.00AB-2.70AC+1.82BC-1.38A2-3.71B2-4.86C2。

由表4可知，回歸方程失擬項顯示不顯著（P=0.0881）且大于0.05，無失擬數(shù)據(jù)存在，實驗與模型擬合效果較好，說明此次的實驗值與預(yù)測值誤差小。模型中F=28.12、P<0.0001、R2=0.9731、R2adj=0.9385，表明模型是較顯著的，有很好的實驗意義。從表4可知，只有C2的P值小于0.001，表示C2影響最為顯著，A2、B2的P值均小于0.05說明A2、B2對存活率也有顯著影響。一次項B的P值=0.001小于0.05，而A、C項的P值均大于0.05，所以葡萄糖和麥芽糊精對存活率沒有顯著影響。交互項的P值均小于0.05，所以葡萄糖與脫脂乳、葡萄糖與麥芽糊精、脫脂乳與麥芽糊精對響應(yīng)值的交互影響都顯[14]。

2.2.4 響應(yīng)曲面圖及等高線圖的分析 圖1～3為Design-Expert8.0.6軟件設(shè)計得出等高線圖和其對應(yīng)的3D圖，從圖中能夠直觀地看出葡萄糖、脫脂乳、麥芽糊精對存活率的影響程度和它們兩兩之間的交互作用。在等高線圖中，橢圓型或馬鞍型的高線表示顯著，而圓型的等高線表示較不顯著[15]。

由圖1可見，等高線呈橢圓形，表明葡萄糖和脫脂乳交互影響顯著。當麥芽糊精濃度為7.5%時，脫脂乳濃度范圍在7.5%～9.51%，葡萄糖濃度范圍在6%～7.56%時，凍干粉的存活率一直在增長，達到峰值后，增長趨勢越來越緩慢。當脫脂乳濃度為9.51%時，葡萄糖濃度為7.56%時，響應(yīng)值達到最高點。

由圖2可見，等高線也呈橢圓形，說明麥芽糊精與葡萄糖交互作用也顯著，當脫脂乳濃度為11.5%時，麥芽糊精濃度范圍5.5%～7.77%，葡萄糖濃度范圍在6%～7.56%時，凍干粉的存活率一直在增長，達到峰值后，增長趨勢越來越緩慢。當麥芽糊精濃度為7.77%時，葡萄糖濃度為7.56%時，此時的存活率達到最大。

由圖3顯示，等高線呈橢圓形并不明顯，說明脫脂乳與麥芽糊精交互作用相比上述因素之間較不顯著，當葡萄糖濃度為9%時，脫脂乳濃度范圍在7.5%～9.51%時，麥芽糊精濃度范圍在5.5%～7.77%，響應(yīng)值一直在提高，達到峰值后，增長趨勢越來越緩慢。當麥芽糊精濃度為7.77%時，葡萄糖濃度為7.56%時，此時的存活率達到最大。

2.3 驗證實驗 通過Design-Expert8.0.6軟件計算得到，當葡萄糖濃度為7.56%、脫脂乳濃度為9.51%、麥芽糊精濃度為7.77%時，存活率達到預(yù)測最大值為90.8303% 在此條件下平行實驗3次，求得平均值為90.08%，相對誤差為0.83%，實測值與預(yù)測值有稍許差異，表明響應(yīng)面法得到的數(shù)學(xué)模型基本可靠。

3 結(jié)論

通過單因素實驗找出了脫脂乳、葡萄糖、麥芽糊精3個單因素作為優(yōu)化因子，然后結(jié)合響應(yīng)面法，找出存活率達到最高時的最佳復(fù)配保護劑為：當葡萄糖濃度為7.56%、脫脂乳濃度為9.51%、麥芽糊精濃度為7.77%，在此條件下預(yù)測值為90.8303%。通過驗證試驗，得出的存活率為90.08%。相對誤差值為0.83%，復(fù)配保護劑的存活率90.08%與不加保護劑時相比有非常明顯提高。

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（責編：張宏民）