沈春修　鄭子峰

摘 要：該研究以平臥菊三七的葉片為外植體，對(duì)影響其愈傷組織誘導(dǎo)及芽分化的相關(guān)因素進(jìn)行了探討。結(jié)果表明，適合平臥菊三七愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+2，4-D 1mg/L；愈傷組織分化出芽的培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.4mg/L。在1/2 MS+NAA 0.2 mg/L+IBA 0.3mg/L的培養(yǎng)基配方上生根較好，移栽到不同基質(zhì)中的組培苗，存活率達(dá)100%。

關(guān)鍵詞：平臥菊三七；組織培養(yǎng)；外植體

中圖分類號(hào) S565.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2017）14-0038-03

Abstract：Taking leaf blade of Gynura procumbens（Lour.）Merr as explants material，the factors that influence the callus induction and bud differentiation of Gynura procumbens（Lour.）Merr were studied.The results showed that the initial medium for the callus induction was MS+2，4-D 1 mg/L；the best medium for adventitious was MS+6-BA 1 mg/L+ NAA 0.4mg/L.The best subculture media for shoot proliferation was 1/2 MS+NAA 0.2 mg/L+IBA 0.3mg/L.Tissue culture seedlings were transplanted to a different matrix，the survival rate was 100%.

Key words：Gynura procumbens（Lour.）Merr；Tissue culture；Explant

平臥菊三七[Gynura procumbens（Lour.）Merr.]為菊科菊三七屬多年生宿根草本植物，是新開發(fā)出的一種藥食兼用的特種經(jīng)濟(jì)作物，具有通經(jīng)活絡(luò)，止痛消腫，消炎止咳，清熱解毒，活血生肌、抗病毒和增強(qiáng)人體免疫力等功效[1]。目前在江西宜春靖安縣有大規(guī)模種植，并且已建立平臥菊三七苗木繁育科技示范基地3個(gè)，面積約13.33hm2。平臥菊三七的繁殖方式主要是種子繁殖和扦插繁殖，而這2種傳統(tǒng)的繁殖方法易受到季節(jié)的影響，遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)上大規(guī)模的需求，急需找到一種快速繁殖種苗的新方法。植物組織培養(yǎng)是近幾十年來發(fā)展起來的一項(xiàng)無性繁殖技術(shù)，具有繁育周期短、種苗供應(yīng)量大的特點(diǎn)，并且能很好的保證母本的優(yōu)良品種特性。國(guó)內(nèi)有部分研究者對(duì)平臥菊三七的組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行了研究，如宋錫全等[2]以平臥菊三七的莖段為材料，利用誘導(dǎo)叢生不定芽培養(yǎng)基培育形成試管苗，同時(shí)還試驗(yàn)了3種培養(yǎng)基對(duì)莖段帶菌液體培養(yǎng)生根生長(zhǎng)的影響；石泰雷等[3]以平臥菊三七幼嫩莖段為材料，在已有分化培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，用市售普通白糖替代分析純蔗糖，并去除部分有機(jī)成分對(duì)平臥菊三七的快繁體系進(jìn)行了優(yōu)化；黃寶祥等[4]以平臥菊三七莖段為外植體，對(duì)其進(jìn)行增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)和栽培試驗(yàn)，并取得一些結(jié)果。但以上這些研究都是以平臥菊三七莖段為材料，沒有獲得其愈傷組織，其繁殖率遠(yuǎn)沒有達(dá)到預(yù)期的高效，同時(shí)，對(duì)平臥菊三七品種后期的改良也不能提供進(jìn)一步的技術(shù)支持。

鑒于此，本研究將選取平臥菊三七葉片為初代培養(yǎng)的外植體，通過脫分化誘導(dǎo)愈傷組織，再分化形成芽苗，從而獲得平臥菊三七的組培苗，同時(shí)進(jìn)一步加速平臥菊三七的擴(kuò)繁周期，提高平臥菊三七繼代增殖培養(yǎng)速率與質(zhì)量，優(yōu)化平臥菊三七生根條件，為最終建立優(yōu)質(zhì)高效的平臥菊三七組培快繁技術(shù)體系提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 平臥菊三七采自江西宜春靖安縣（北緯28°46′～29°06′，東經(jīng)114°55′～115°31′），栽植于宜春學(xué)院試驗(yàn)基地，剪去當(dāng)年生枝條上的新葉。

1.2 方法

1.2.1 外植體滅菌 外植體采集時(shí)間為晴天上午，取平臥菊三七生長(zhǎng)期內(nèi)健康無病蟲害、生長(zhǎng)旺盛植株的當(dāng)年生枝條上的新葉。先用洗潔精水漂洗5～15min，流水沖洗30min左右。后浸泡于無菌水中待用，于超凈工作臺(tái)上將外植體用75%的乙醇消毒處理15～20s，無菌水沖洗3～5次，然后用0.1%的升汞浸泡6～8min，再用無菌水沖洗多次，將葉片置于已滅菌的濾紙上吸干表面的水分后，用解剖刀切成面積大小為1cm2左右的小塊。

1.2.2 平臥菊三七叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng) 將生長(zhǎng)狀況良好的愈傷組織切成小塊，接種到叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基配方為MS培養(yǎng)基添加不同量的6-BA和NAA（見表1），培養(yǎng)約30d后統(tǒng)計(jì)叢生芽的出芽率及生長(zhǎng)情況。

1.2.3 平臥菊三七組培苗生根培養(yǎng)和煉苗移栽 選取生長(zhǎng)良好，長(zhǎng)勢(shì)一致的分化苗接到生根培養(yǎng)基中，平臥菊三七生根培養(yǎng)基以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度IBA，培養(yǎng)一段時(shí)間后統(tǒng)計(jì)其生根率。當(dāng)組培苗生長(zhǎng)到一定高度時(shí)，從光照培養(yǎng)箱中取出，打開瓶蓋，倒入少量無菌水，置于室內(nèi)（避免陽光直射），一星期后，洗去根部培養(yǎng)基，晾干植株表面水分，栽植于不同基質(zhì)中，45d后統(tǒng)計(jì)成活率及生長(zhǎng)情況。

1.2.4 培養(yǎng)條件 誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)條件為暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25～28℃；其余階段培養(yǎng)條件均為光照強(qiáng)度3000lx，光照時(shí)間12h，培養(yǎng)溫度為25～28℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 平臥菊三七的愈傷組織誘導(dǎo) 平臥菊三七葉片組織塊接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，7d后觀察到葉片邊緣開始卷曲，并看到有黃色、顆粒狀愈傷組織產(chǎn)生，20d后統(tǒng)計(jì)其出愈率。結(jié)果見表1和圖1A。由表1可知，不同濃度的2，4-D均可誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，當(dāng)2，4-D濃度為1mg/L時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)到最高；繼續(xù)增加2，4-D的濃度，愈傷組織誘導(dǎo)率反而下降，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，這些愈傷組織較早出現(xiàn)老化現(xiàn)象。因此，適合平臥菊三七愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2，4-D1mg/L+0.7%瓊脂+2%蔗糖。

2.2 平臥菊三七叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng) 生長(zhǎng)狀況良好的平臥菊三七愈傷組織在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)30d后，觀察不定芽生長(zhǎng)情況，結(jié)果見表2和圖1C和圖1D。由表2可知，影響平臥菊三七叢生芽生長(zhǎng)的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑主要是細(xì)胞分裂素6-BA和生長(zhǎng)素NAA的協(xié)同作用，在6-BA濃度一定的情況下，當(dāng)NAA濃度從0.2mg/L增加到0.6mg/L時(shí)，平臥菊三七叢生芽的出芽率先增加后減少；但是當(dāng)NAA濃度為0.4mg/L時(shí)，隨著6-BA的增加，平臥菊三七叢生芽的出芽率程大幅度變化，最高可達(dá)71.3%，最低甚至為0%，沒有出芽，說明對(duì)于平臥菊三七叢生芽的誘導(dǎo)，激素6-BA和NAA的濃度只要達(dá)到合適的范圍，才能保證出芽率最高。因此，最適合平臥菊三七愈傷組織分化出芽的培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 1mg/L+NAA0.4mg/L+0.7%瓊脂+2%蔗糖。當(dāng)平臥菊三七叢生芽長(zhǎng)到4～5cm高時(shí)，隨即移到增值壯苗培養(yǎng)基中繼續(xù)生長(zhǎng)。20d后，苗會(huì)進(jìn)一步長(zhǎng)高長(zhǎng)壯，就可以進(jìn)行下一步的生根培養(yǎng)了。

2.3 平臥菊三七組培苗的生根培養(yǎng)和煉苗移栽 將平臥菊三七幼苗接入生根培養(yǎng)基中約10d左右開始生根，20d后隨機(jī)挑選3瓶統(tǒng)計(jì)平臥菊三七生根情況，結(jié)果見表3和圖1E及圖1F。由表3可知，IBA對(duì)平臥菊三七生根有一定的促進(jìn)作用；當(dāng)不加IBA時(shí)，根系生長(zhǎng)緩慢；當(dāng)IBA濃度從0.1mg/mL增加到0.5mg/mL時(shí)，根系生長(zhǎng)數(shù)量增多，彼此差異變化幅度不大，綜合比較，平臥菊三七最適生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.5mg/mL IBA+0.2mg/mL NAA。同時(shí)，將生長(zhǎng)良好的幼苗經(jīng)過適當(dāng)煉苗后，移栽至不同基質(zhì)中，45d后觀察平臥菊三七生長(zhǎng)狀況，結(jié)果表明，平臥菊三七組培苗對(duì)土壤要求不是特別嚴(yán)格，在各種基質(zhì)中都可以存活，存活率達(dá)100%。

3 結(jié)論與討論

植物離體快速繁殖體系的建立，需要離體的外植體材料在無菌的條件下完成脫分化和再分化，才能培養(yǎng)出組培苗。本研究中，選用葉片作為外植體，當(dāng)培養(yǎng)基中2，4-D濃度小于1mg/L時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率逐漸增加；當(dāng)2，4-D濃度高于1mg/L時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率反而下降，并且培養(yǎng)出的愈傷組織質(zhì)地也較差，顏色較暗。說明2，4-D濃度過高或者過低不利于愈傷組織的誘導(dǎo)。這與一些學(xué)者的研究結(jié)果是一致的，盡管較高濃度的2，4-D有利于胚性愈傷組織的誘導(dǎo)，但一定程度上2，4-D也是促使愈傷組織褐化的一個(gè)因素[5-9]。故對(duì)于愈傷組織的誘導(dǎo)2，4-D使用的濃度不宜過大，從而減少培養(yǎng)過程中材料組織的無性系變異。本實(shí)驗(yàn)中最適合的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為MS+2，4-D1mg/L+0.7%瓊脂+2%蔗糖。

在植物愈傷組織分化中，6-BA是一種重要的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，單獨(dú)使用可以使愈傷組織得以分化[10]。但通常與其他植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配合使用，能起到更好的效果。本研究中，最適合平臥菊三七愈傷組織分化出芽的培養(yǎng)基配方為MS+6-BA1mg/L+NAA0.4mg/L+0.7%瓊脂+2%蔗糖，表明平臥菊三七愈傷組織分化出芽過程中，6-BA和NAA的濃度達(dá)到合適配比后，能使其出芽率大幅度提高。

綜上所述，本研究成功建立了一套完整的平臥菊三七快速繁殖體系，為其工廠化和規(guī)?；缣峁┝思夹g(shù)支持。

參考文獻(xiàn)

[1]孫偉.菊三七扦插繁殖技術(shù)和藥用價(jià)值[J].中國(guó)野生植物資源，2007，26（3）：68.

[2]宋錫全，吳曉英，朱書晟.平臥菊三七莖段組織培養(yǎng)快速繁殖[J].貴州師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，29（4）：1-3.

[3]石泰雷，趙冬冬，禹波寧，等. 平臥菊三七快繁體系優(yōu)化研究[J].農(nóng)業(yè)科學(xué)研究，2012，32（2）：69-72.

[4]黃寶祥，朱培林，龔斌.平臥菊三七組培快繁研究[J].江西林業(yè)科技，2013，5：11-13.

[5]張東向，張崇浩，梅玲，等.荷蘭芹胚性愈傷組織誘導(dǎo)及胚狀體發(fā)生與內(nèi)源 IAA和ABA關(guān)系的初步研究[J] 植物研究，2001，21（1）：73-76.

[6]楊萬年，張秀紅，熊永華等.2，4-D和激動(dòng)素對(duì)煙草愈傷組織 IAA 氧化酶和細(xì)胞分裂，素氧化酶活性的影響[J].植物生理學(xué)通訊，2003，39（6）：589-591.

[7]黃卓烈，李明，譚紹滿，等.吲哚丁酸對(duì)桉樹插條多酚氧化酶的影響及其與生根的關(guān)系[J].廣西植物，2003，23（1）：77-82.

[8]黃璐，衛(wèi)志明.不同基因型玉米的再生能力和胚性與非胚性愈傷組織DNA的差異[J].植物生理學(xué)報(bào)，1999，25（4）：332-338.

[9]王雷，張君，于彥春，等.胚齡和2，4-D濃度對(duì)玉米自交系幼胚愈傷組織誘導(dǎo)率的影響[J].玉米科學(xué)，2001，9（3）：26-28.

[10]周宜君，周生闖，劉玉，等.植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)植物愈傷組織的誘導(dǎo)與分化的影響[J].中央民族大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2007，16（1）：23-28. （責(zé)編：張宏民）