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摘 要：為提高佛手瓜總黃酮提取率，采用酶輔助法對(duì)佛手瓜總黃酮的提取效果進(jìn)行了研究。以總黃酮提取率為指標(biāo)，研究了酶種類(lèi)、酶用量、酶解溫度、pH和酶解時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響，在此基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法對(duì)酶輔助提取佛手瓜總黃酮工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立了二次多項(xiàng)式模型，確定了最佳工藝條件。結(jié)果表明，在試驗(yàn)的4種酶中，以纖維素酶為水解酶的提取效果最好。纖維素酶輔助提取佛手瓜總黃酮的最佳工藝條件為：酶用量1.0%，酶解溫度47℃，pH5.2，酶解時(shí)間46min，該條件下總黃酮提取率為3.802%，與預(yù)測(cè)值相比，相對(duì)誤差為0.653%，表明回歸模型所得數(shù)據(jù)與實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合良好，驗(yàn)證了數(shù)學(xué)模型的有效性。該工藝與熱浸提法相比，總黃酮的提取率提高了25.9%，為佛手瓜總黃酮的深度開(kāi)發(fā)與利用提供了科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：佛手瓜；總黃酮；酶輔助；響應(yīng)面；優(yōu)化

中圖分類(lèi)號(hào) TQ28；S38；TS255；Q814 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2017）14-0020-06

Abstract：In this work the enzymes-assisted technology was used for extraction total flavonoids from Sechium edule（Jacq.） Swartz. The effects of enzymes types，enzyme amount，enzymolysis temperature，pH and enzymolysis time on the yield of total flavonoids were studied. The response surface method had been used to further optimize the extraction process by an establishment of quadratic polynomial regression equation for optimal extraction condition. The results showed that the cellulase was the best enzyme with the highest total flavonoids extraction yield，F(xiàn)urthermore，the optimal extraction conditions of total flavonoids were as follows： enzyme amount 1.0%，enzymolysis temperature 47 ℃，pH 5.2，enzymolysis time 46 min. The yield of total flavonoids was 3.802% and the relative error between the theoretic values （3.827%） and testing values （3.802%） was 0.653%，which indicated the obtained data were in good agreement with the experimental results and the feasible model fitted well with the experimental data. Meanwhile the extraction yield increased by 25.9% compared with the traditional extraction method. Results could provide scientific foundation for the exploitation and utilization of the total flavonoids in Sechium edule（Jacq.） Swartz.

Key words：Sechium edule（Jacq.） Swartz；Total flavonoids；Enzyme-assisted；Response surface methodology；Optimization

佛手瓜（Sechium edule（Jacq.）Swartz）又名拳頭瓜、萬(wàn)年瓜，為葫蘆科佛手瓜屬多年草本植物，佛手瓜味美可口、清脆多汁，是一種富含營(yíng)養(yǎng)的珍稀蔬菜[1]。佛手瓜原產(chǎn)于西印度群島、墨西哥一帶，于20世紀(jì)初引入我國(guó)，由于其適應(yīng)性強(qiáng)、高產(chǎn)質(zhì)優(yōu)、效益高，在我國(guó)的福建、廣東、廣西、云南等地區(qū)已廣泛栽種[2]。佛手瓜不僅含有豐富的鈣、鐵、鎂、鋅等微量元素，還含有胡蘿卜素、氨基酸、黃酮、多糖、果膠等天然功能性成分，是一種具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的藥食兩用保健蔬菜[3-4]。黃酮類(lèi)化合物是植物花、葉、根中的多酚類(lèi)物質(zhì)，具有抗氧化、抗衰老、降血糖、降血脂和預(yù)防心血管病等生理功能，可作為食品添加劑和功能性食品的原料，具有廣闊的應(yīng)用前景[5-7]。已有文獻(xiàn)[8]報(bào)道了佛手瓜總黃酮的提取，文獻(xiàn)中使用的乙醇浸提法簡(jiǎn)便易行，設(shè)備要求低，但提取效率較低。黃酮類(lèi)物質(zhì)主要存在于植物的細(xì)胞內(nèi)，而細(xì)胞壁主要由纖維素構(gòu)成，因此要使黃酮類(lèi)物質(zhì)從細(xì)胞內(nèi)溶出到溶劑主體，必須先破壞植物的細(xì)胞壁或使細(xì)胞壁分解，才能有利于黃酮類(lèi)物質(zhì)的溶出[9]。本研究在文獻(xiàn)報(bào)道的基礎(chǔ)上，采用酶對(duì)佛手瓜進(jìn)行酶解，以破壞其細(xì)胞壁，并對(duì)影響總黃酮提取率的因素進(jìn)行了分析與優(yōu)化，旨在為佛手瓜總黃酮的開(kāi)發(fā)與利用提供理論依據(jù)。

1 試驗(yàn)條件與方法

1.1 試劑與儀器 乙醇，分析純，汕頭西隴化工股份有限公司，使用時(shí)，配制成不同濃度（體積分?jǐn)?shù)）的乙醇溶液；氫氧化鈉，分析純，天津市北辰方正試劑廠；佛手瓜，購(gòu)于漳州西洋坪菜市場(chǎng)。蘆丁，標(biāo)準(zhǔn)品（UV≥98%），上海滬宇生物試劑公司；亞硝酸鈉，分析純，天津福晨化學(xué)試劑廠；硝酸鋁，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；中性蛋白酶，食品級(jí)5萬(wàn)U/g，南寧東恒華道生物科技有限責(zé)任公司；纖維素酶，食品級(jí)5萬(wàn)U/g，江蘇銳陽(yáng)生物科技有限公司；α-淀粉酶，食品級(jí)5萬(wàn)U/g，湖南鴻鷹祥生物工程股份有限公司；果膠酶，食品級(jí)5萬(wàn)U/g，河南譽(yù)信誠(chéng)生物科技有限公司。

采用上海美譜達(dá)儀器有限公司生產(chǎn)的UV-1800PC-DS2型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行吸光度測(cè)試；采用北京四環(huán)科學(xué)儀器廠生產(chǎn)的LGJ10-C型冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥；采用上海冰都電器有限公司生產(chǎn)的Q-250B型高速多功能粉碎機(jī)對(duì)佛手瓜進(jìn)行粉碎。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 利用硝酸鋁—亞硝酸鈉比色法[10]，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行繪制。將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品置于105℃的干燥箱中干燥至恒重，準(zhǔn)確稱(chēng)取蘆丁10mg，用80%乙醇定容至100mL的容量瓶中，得到100mg/L蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別量取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液于10mL的容量瓶中，分別加入0.3mL5%NaNO2溶液，搖勻，放置6min后加入0.3mL10%Al（NO3）3溶液，搖勻，放置6min后再加4mL4%NaOH溶液，搖勻，放置20min后用80%乙醇定容，放置30min后分別測(cè)定其在510nm波長(zhǎng)處的吸光度，以吸光度y為縱坐標(biāo)，蘆丁濃度x為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將結(jié)果進(jìn)行線性回歸，得方程為y=0.0102x-0.0013，相關(guān)系數(shù)R2=0.9999。

1.2.2 佛手瓜總黃酮的測(cè)定 取一定量的提取液于10mL的容量瓶中，按上述方法加相應(yīng)的試劑，同時(shí)作空白。測(cè)定在510nm處的吸光度，代入吸光度與濃度的回歸方程，計(jì)算得到總黃酮濃度，用式（1）進(jìn)行換算得總黃酮提取率。

佛手瓜總黃酮提取率（%）=[b×Vm×103×100] （1）

式中：m為佛手瓜的質(zhì)量/g；b為回歸方程計(jì)算的總黃酮質(zhì)量濃度/（mg·L-1）；V為提取液體積/L。

1.2.3 熱浸提取工藝 將佛手瓜洗凈切成條狀，并泡于蒸餾水中0.5h，撈起自然晾干后，冰凍，并于冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行干燥，粉碎，過(guò)80目篩備用。在裝有冷凝管的250mL三口燒瓶中，裝入一定量的佛手瓜粉末，按液料比20mL·g-1加入70%乙醇溶液，并于80℃恒溫浸取2h，過(guò)濾，濾渣再重復(fù)提取2次，結(jié)束后，合并濾液，濃縮，定容，按1.2.2中的方法計(jì)算得到總黃酮提取率。

1.2.4 佛手瓜總黃酮酶輔助提取 在250mL的燒杯中準(zhǔn)確加入佛手瓜粉末5g，加入75mL蒸餾水，攪拌混合均勻，加入所需要的酶，按工藝設(shè)定酶解時(shí)間、pH、酶解溫度對(duì)佛手瓜粉末進(jìn)行處理，處理完后，過(guò)濾并按1.2.3方法進(jìn)行提取、計(jì)算得佛手瓜總黃酮提取率，并據(jù)上述方法，重復(fù)做3次平行實(shí)驗(yàn)，得佛手瓜總黃酮提取率的平均值。

1.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用DesignExpert8.05b軟件，以總黃酮提取率為響應(yīng)值，據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取酶用量（A）、酶解溫度（B）、pH（C）、酶解時(shí)間（D）為考察因素，建立了四因素三水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)因素與水平編碼如表1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 酶種類(lèi)對(duì)提取率的影響 選取不加酶（對(duì)照）、纖維素酶、α-淀粉酶、果膠酶和中性蛋白酶在液料比為15mL·g-1、酶用量1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）、pH值和酶解溫度為各酶適宜范圍、酶解時(shí)間50min的條件下進(jìn)行預(yù)處理，并按1.2.3進(jìn)行佛手瓜總黃酮的提取，結(jié)果如圖1所示。由圖1中可以看出，加入酶后，佛手瓜中總黃酮的提取率增加。其中，纖維素酶使總黃酮的提取率增加最為顯著，果膠酶次之，α-淀粉酶和中性蛋白酶的作用較弱，總黃酮的提取率提高較不明顯。這是因?yàn)橹参镉行С煞执嬖谟谟衫w維素和果膠所構(gòu)成的細(xì)胞壁內(nèi)部，而纖維素酶和果膠酶能夠水解細(xì)胞壁中的纖維素和果膠來(lái)破壞細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)的黃酮類(lèi)物質(zhì)能夠充分釋放。果膠酶對(duì)佛手瓜總黃酮的提取效果低于纖維素酶，說(shuō)明佛手瓜中細(xì)胞壁上的果膠含量比纖維素含量低[11]；α-淀粉酶和中性蛋白酶的作用不明顯，說(shuō)明佛手瓜中淀粉和蛋白質(zhì)的含量相對(duì)較少[12]。故選擇纖維素酶為提取所用酶。

2.1.2 酶用量對(duì)提取率的影響 固定酶解溫度50℃、pH5.0、酶解時(shí)間50min的條件下，考察了酶用量（0.8%、0.9%、1.0%、1.1%、1.2%、1.3%）對(duì)佛手瓜總黃酮提取率的影響，其結(jié)果見(jiàn)圖2。

從圖2中可以看出，佛手瓜總黃酮提取率隨著酶用量的增加而增大，當(dāng)酶用量為1.0%時(shí)，佛手瓜總黃酮的提取率達(dá)到最大，當(dāng)酶用量超過(guò)1.0%后，總黃酮提取率又開(kāi)始下降，這是因?yàn)殡S著酶用量的增加，酶與佛手瓜顆粒細(xì)胞壁上的底物作用越來(lái)越多，加快了酶與底物的催化反應(yīng)，促進(jìn)了黃酮類(lèi)物質(zhì)的溶出而使得提取率提高，而當(dāng)酶用量過(guò)大時(shí)，過(guò)多的酶包裹著底物，阻礙了酶促反應(yīng)，從而導(dǎo)致了黃酮類(lèi)物質(zhì)溶出的困難[13]。故選擇酶用量為1.0%。

2.1.3 酶解溫度對(duì)提取率的影響 固定酶用量1.0%、pH5.0、酶解時(shí)間50min的條件下，考察了酶解溫度（40、45、50、55、60、65℃）對(duì)佛手瓜總黃酮提取率的影響，其結(jié)果見(jiàn)圖3。從圖3中可以看出，佛手瓜總黃酮提取率隨著酶解溫度的增加而增大，佛手瓜總黃酮在酶解溫度為50℃時(shí)，提取率達(dá)到最大，繼續(xù)增大酶解溫度，提取率又逐漸下降，這是因?yàn)樵谳^低溫度時(shí)，酶解反應(yīng)較為緩慢，隨著酶解溫度的升高，酶的活性增強(qiáng)，酶解反應(yīng)加快，總黃酮提取率增大，而當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)，酶會(huì)發(fā)生不可逆的變性而逐漸失活[14]，酶解能力下降，故選擇酶解溫度為50℃。

2.1.4 pH對(duì)提取率的影響 固定酶用量1.0%、酶解溫度50℃、酶解時(shí)間50min的條件下，考察pH（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5）對(duì)佛手瓜總黃酮提取率的影響，其結(jié)果見(jiàn)圖4。從圖4中可以看出，佛手瓜總黃酮提取率隨著pH的增加而增大，當(dāng)佛手瓜總黃酮在pH為5.0時(shí)，提取率達(dá)到最大，繼續(xù)增大pH，總黃酮的提取率迅速下降。這是因?yàn)槊副仨氃谶m宜的pH范圍內(nèi)才能存活，過(guò)高或過(guò)低的pH都將影響酶的解離，甚至?xí)姑甘セ钚裕w維素酶活性的降低將直接影響到對(duì)植物細(xì)胞壁的作用[15]，纖維素酶在pH=5.0時(shí)呈現(xiàn)了最大的活力，故選擇pH為5.0。

2.1.5 酶解時(shí)間對(duì)提取率的影響 固定酶用量1.0%、酶解溫度50℃、pH5.0的條件下，考察了酶解時(shí)間（30、40、50、60、70、80min）對(duì)佛手瓜總黃酮提取率的影響，其結(jié)果見(jiàn)圖5。從圖5中可以看出，佛手瓜總黃酮提取率隨著酶解時(shí)間的增加而增大，當(dāng)酶解時(shí)間在50min時(shí)，佛手瓜總黃酮提取率達(dá)到最大，超過(guò)50min后，提取率增加趨于緩慢。這是因?yàn)槊附鈺r(shí)間較短時(shí)，酶與底物作用不充分，隨著酶解時(shí)間的增加，酶與底物的作用更加充分，細(xì)胞壁破壞增強(qiáng)，促使佛手瓜總黃酮更容易地溶出而使得提取率增大，而當(dāng)酶解時(shí)間超過(guò)50min后，細(xì)胞壁上的纖維素已被酶解殆盡[16]，酶解時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，已無(wú)法再大幅度增加提取率，故選擇酶解時(shí)間為50min。

2.2 佛手瓜總黃酮提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化

2.2.1 回歸模型及顯著性檢驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以酶用量（A）、酶解溫度（B）、pH（C）、酶解時(shí)間（D）為自變量，采用Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，總黃酮提取率為響應(yīng)值，利用DesignExpert8.05b軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，結(jié)果如表2和表3所示。

利用Design-Expert8.05b軟件對(duì)表2實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析，得到響應(yīng)值與各工藝因素間的二次多項(xiàng)回歸模型為：

Y=3.77+0.049A-0.1B+0.14C-0.057D+0.071AB-0.051AC+0.035AD-0.035BC+0.051BD+0.074CD-0.16A2-0.17B2-0.16C2-0.072D2，

從表3的方差分析可知，該回歸模型極顯著（P<0.0001），回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2=0.9473，說(shuō)明該模型的響應(yīng)值有超過(guò)94%的數(shù)據(jù)可以用來(lái)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行解釋?zhuān)匠痰臄M合度好、可靠性高；P值為0.0916>0.05，失擬項(xiàng)F值4.14，失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明該模型誤差小，回歸模型顯著，擬合度較好，說(shuō)明在所考察的工藝條件范圍內(nèi)可以用本模型來(lái)分析與預(yù)測(cè)。從P值及F值可以得到各工藝間的對(duì)總黃酮提取率的影響順序?yàn)椋簆H>酶解溫度>酶解時(shí)間>酶用量。二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2，一次項(xiàng)B、C、D對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響極顯著（P<0.01）；一次項(xiàng)A，交互項(xiàng)AB、CD對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響顯著（P<0.05）；交互項(xiàng)AC、AD、BC、BD對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響不顯著（P>0.05）。

2.2.2 響應(yīng)面分析 根據(jù)響應(yīng)面及等高線的形狀，可以分析酶用量、酶解溫度、pH和酶解時(shí)間對(duì)佛手瓜總黃酮提取率的影響并且可以得到最佳參數(shù)及各工藝因素之間的相互作用，根據(jù)回歸方程繪制出響應(yīng)面及，如圖6所示，從圖6（A）中可知，酶用量和酶解溫度的交互作用顯著，酶用量較小時(shí)，酶解溫度對(duì)提取率的影響較大，隨著酶解溫度的增加總黃酮提取率迅速增大，而后總黃酮提取率又隨著酶解溫度的升高而降低；從圖6（B）中可知，酶用量和pH的交互作用不顯著，總黃酮提取率隨酶用量的增大和pH的增加均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)；從圖6（C）中可知，酶用量和酶解時(shí)間的交互作用不顯著，總黃酮提取率隨酶用量的增大呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，而總黃酮提取率隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先增大后又趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)；從圖6（D）中可知，酶解溫度和pH的交互作用不顯著，總黃酮提取率隨酶解溫度的升高和pH的增加均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)；從圖6（E）中可知，酶解溫度和酶解時(shí)間的交互作用不顯著，總黃酮提取率隨酶解溫度的升高呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，總黃酮提取率隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先增大后又趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)。從圖6（F）中可知，pH和酶解時(shí)間的交互作用顯著，隨著pH的增大，總黃酮提取率先迅速增大，而后又迅速減小，隨著酶解時(shí)間的增加，總黃酮提取率逐漸增大后趨于穩(wěn)定；由響應(yīng)面和等高線圖以及分析可以看出，各工藝間的主次因素順序?yàn)閜H>酶解溫度>酶解時(shí)間>酶用量。

2.2.3 最優(yōu)條件的確定及驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)回歸模型分析，得到佛手瓜總黃酮的纖維素酶輔助提取的最佳工藝條件為：酶用量1.0%、酶解溫度47.90℃、pH5.21、酶解時(shí)間46.59min，該條件下總黃酮提取率的最大理論值為3.827%。為檢測(cè)回歸方程的可靠性，并考慮到實(shí)驗(yàn)操作的便利性，將最優(yōu)條件修正為：酶用量1.0%、酶解溫度47℃、pH5.2、酶解時(shí)間46min，并進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到佛手瓜總黃酮提取率為3.792%、3.806%、3.808%，平均值為3.802%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.872%，與預(yù)測(cè)值相比，相對(duì)誤差為0.653%，表明回歸模型所得數(shù)據(jù)與實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合良好，驗(yàn)證了數(shù)學(xué)模型的有效性。經(jīng)過(guò)酶預(yù)處理后，與熱浸提法相比[8]，佛手瓜總黃酮的提取率提高了25.9%，為佛手瓜總黃酮的深度開(kāi)發(fā)與利用提供了科學(xué)依據(jù)。

3 結(jié)論與討論

（1）植物有效成分主要存在于植物細(xì)胞內(nèi)部，因此要使有效成分更多更快的溶出，必須破壞植物細(xì)胞壁。酶是專(zhuān)一而高效的催化劑，可以有效地破壞植物細(xì)胞壁上面的物質(zhì)，從而增加細(xì)胞壁的通透性。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，纖維素酶的對(duì)細(xì)胞壁的破壞效果最好，提取率最高，果膠酶次之，這與植物細(xì)胞壁主要由纖維素和果膠所組成的相符，因此采用纖維素酶來(lái)水解細(xì)胞壁上的纖維素，可以最大程度地破壞細(xì)胞壁，降低有效成分通過(guò)細(xì)胞壁的阻力，使植物細(xì)胞內(nèi)的有效成分更多更快地溶出，獲得最大的提取效果。

（2）以佛手瓜為原料，采用酶輔助法對(duì)佛手瓜總黃酮進(jìn)行了提取，并在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法對(duì)纖維素酶輔助提取佛手瓜總黃酮的工藝進(jìn)行了優(yōu)化，建立了二次多項(xiàng)式回歸模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在試驗(yàn)的4種酶中，纖維素酶對(duì)佛手瓜總黃酮的提取效果最好，纖維素酶輔助提取佛手瓜總黃酮的最佳工藝參數(shù)為：酶用量1.0%、酶解溫度47℃、pH5.2、酶解時(shí)間46min，進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到佛手瓜總黃酮提取率的平均值3.802%，與預(yù)測(cè)值相比，相對(duì)誤差為0.653%，表明回歸模型所得數(shù)據(jù)與實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合良好，驗(yàn)證了數(shù)學(xué)模型的有效性。經(jīng)過(guò)酶預(yù)處理后，與熱浸提法相比，佛手瓜總黃酮的提取率提高了25.9%，為佛手瓜總黃酮的深度開(kāi)發(fā)與利用提供了科學(xué)依據(jù)。

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（責(zé)編：張長(zhǎng)青）