林丹櫻 屈軍樂(lè)

(深圳大學(xué)光電工程學(xué)院,光電子器件與系統(tǒng)教育部/廣東省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,深圳 518060)

超分辨成像及超分辨關(guān)聯(lián)顯微技術(shù)研究進(jìn)展?

林丹櫻 屈軍樂(lè)?

(深圳大學(xué)光電工程學(xué)院,光電子器件與系統(tǒng)教育部/廣東省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,深圳 518060)

(2017年4月19日收到;2017年6月21日收到修改稿)

光學(xué)成像系統(tǒng)中有限孔徑對(duì)光波的衍射,使得光學(xué)顯微成像技術(shù)的分辨率受到“衍射極限”限制而無(wú)法進(jìn)一步提高.自1873年E.K.Abbe提出該問(wèn)題以來(lái),衍射極限就一直是學(xué)術(shù)界研究的熱點(diǎn).近年來(lái),隨著高強(qiáng)度激光、高靈敏探測(cè)器等光電器件研制技術(shù)以及新型熒光探針開(kāi)發(fā)等相關(guān)領(lǐng)域的快速發(fā)展,光學(xué)顯微技術(shù)衍射極限問(wèn)題的研究迎來(lái)了新的契機(jī),超分辨顯微成像技術(shù)(super-resolution microscopy,SRM)在近十年內(nèi)取得了令人矚目的巨大成就.本文從空域和頻域角度回顧了衍射極限分辨率的基本原理,并據(jù)此對(duì)目前常見(jiàn)的各種SRM技術(shù)“繞過(guò)”衍射極限提高分辨率的機(jī)理給予了詳解,同時(shí)介紹了各類(lèi)技術(shù)的發(fā)展動(dòng)態(tài)和研究方向;作為SRM的一個(gè)新的重要的發(fā)展趨勢(shì),本文詳細(xì)介紹了超分辨關(guān)聯(lián)顯微技術(shù)的最新研究進(jìn)展,包括SRM與活細(xì)胞實(shí)時(shí)熒光顯微、熒光壽命顯微、光譜測(cè)量和成像、電子顯微、原子力顯微、質(zhì)譜技術(shù)等的關(guān)聯(lián),著重討論了各類(lèi)超分辨關(guān)聯(lián)顯微技術(shù)的作用和意義;最后,對(duì)SRM技術(shù)和超分辨關(guān)聯(lián)顯微技術(shù)的未來(lái)發(fā)展方向進(jìn)行了展望.

衍射極限,超分辨成像,關(guān)聯(lián)顯微技術(shù),超分辨關(guān)聯(lián)顯微技術(shù)

1 引 言

光學(xué)成像系統(tǒng)中客觀(guān)存在的有限孔徑對(duì)光波的衍射使得光學(xué)顯微鏡的分辨率無(wú)法通過(guò)提高放大倍率和消除像差而無(wú)限提高,而是存在一個(gè)理論上限,稱(chēng)為衍射極限.該問(wèn)題由E.K.Abbe于1873年提出顯微鏡的二次成像理論時(shí)指出并成為困擾光學(xué)設(shè)計(jì)界長(zhǎng)達(dá)一個(gè)多世紀(jì)的難題[1],同時(shí)也一直是學(xué)術(shù)界研究的熱點(diǎn)問(wèn)題.近年來(lái),隨著高強(qiáng)度激光、高靈敏探測(cè)器等光電器件研制技術(shù)以及新型熒光探針開(kāi)發(fā)等相關(guān)領(lǐng)域的快速發(fā)展,光學(xué)顯微衍射極限問(wèn)題的研究迎來(lái)了新契機(jī),超分辨顯微成像技術(shù)(super-resolution microscopy,SRM)在近十年內(nèi)取得了令人矚目的巨大成就,為現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究提供了強(qiáng)有力的工具.2014年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予了E.Betzig,S.W.Hell和W.Moerner三位科學(xué)家,以表彰他們發(fā)明和發(fā)展SRM技術(shù)的貢獻(xiàn),其中前兩位分別是單分子定位和受激輻射耗盡兩類(lèi)代表性SRM技術(shù)的發(fā)明人,第三位發(fā)現(xiàn)的熒光蛋白光激活效應(yīng)則是單分子定位SRM技術(shù)的基礎(chǔ).他們的獲獎(jiǎng)肯定了化學(xué)、物理、生物等多學(xué)科交叉在當(dāng)今前沿科學(xué)技術(shù)發(fā)展中的重要作用,同時(shí)也掀起了SRM技術(shù)和應(yīng)用研究的新高潮.如今不僅SRM技術(shù)本身在快速發(fā)展和完善,SRM應(yīng)用領(lǐng)域在迅速拓展和深化,而且SRM與其他技術(shù)還碰撞出了許多火花,例如超分辨關(guān)聯(lián)顯微技術(shù)就是近年來(lái)SRM的一個(gè)新的重要的發(fā)展趨勢(shì).本文介紹和分析各種SRM技術(shù)的基本原理和發(fā)展歷程,并討論將SRM技術(shù)與活細(xì)胞實(shí)時(shí)熒光顯微、熒光壽命顯微、光譜測(cè)量和成像、電子顯微、原子力顯微等技術(shù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)顯微的研究進(jìn)展,同時(shí)對(duì)SRM技術(shù)和超分辨關(guān)聯(lián)顯微技術(shù)的未來(lái)發(fā)展進(jìn)行展望.

2 光學(xué)顯微鏡的衍射極限分辨率

光學(xué)顯微鏡的衍射極限分辨率可從空域和頻域兩個(gè)角度來(lái)理解.

從空域角度,顯微鏡的成像過(guò)程滿(mǎn)足透鏡成像規(guī)律,理想情況下只要系統(tǒng)放大倍率足夠高且很好地消除了各種像差,就能將任何極微小的樣品放大到可被觀(guān)察的程度.然而在19世紀(jì),E.K.Abbe研究顯微鏡制造技術(shù)的改進(jìn)時(shí)卻發(fā)現(xiàn)顯微鏡的分辨率并不能無(wú)限提高,而且一個(gè)小孔徑的消像差物鏡甚至可能比一個(gè)大孔徑的普通物鏡得到更差的分辨率.從空域角度理解,其根本原因在于成像系統(tǒng)的有限通光孔徑使光波發(fā)生衍射,導(dǎo)致物平面上無(wú)限小的物點(diǎn)在像平面變成有限尺寸的衍射斑,因此當(dāng)兩個(gè)物點(diǎn)相距太近導(dǎo)致兩個(gè)衍射斑疊加形成一個(gè)像斑時(shí)就無(wú)法在圖像上對(duì)它們進(jìn)行區(qū)分了.也就是說(shuō),有限孔徑的衍射使得光學(xué)成像系統(tǒng)存在一個(gè)分辨率上限,這就是衍射極限分辨率.顯微鏡中圓形孔徑的衍射形成的像斑稱(chēng)為艾里斑[2],其原理可用圖1(a)的單透鏡成像來(lái)說(shuō)明：物點(diǎn)O發(fā)出的光波經(jīng)透鏡L后在孔徑A處發(fā)生衍射,波前各點(diǎn)發(fā)出的子波在像平面P相干疊加,幾何像點(diǎn)P0處因各子波光程相同發(fā)生相長(zhǎng)干涉而光強(qiáng)最強(qiáng),P1點(diǎn)因光程相差半波長(zhǎng)發(fā)生相消干涉而光強(qiáng)為零,其余則介于兩者之間,故形成如圖所示的艾里斑圖樣,其能量大部分集中在中央亮斑內(nèi),且孔徑A越小、波長(zhǎng)越長(zhǎng),P1離P0就越遠(yuǎn),亮斑半徑r越大.其定量關(guān)系為r=0.61λ/u′[3],其中λ為波長(zhǎng),u′為像方孔徑角.根據(jù)系統(tǒng)觀(guān)點(diǎn),物點(diǎn)通過(guò)成像系統(tǒng)后形成的像斑稱(chēng)為點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)(point spread function, PSF),系統(tǒng)的成像特性由該P(yáng)SF決定.當(dāng)兩個(gè)物點(diǎn)同時(shí)經(jīng)過(guò)系統(tǒng)時(shí),其像斑將疊加,如圖1(b)所示.可見(jiàn),兩個(gè)像斑存在一個(gè)臨界距離,小于該距離時(shí)像斑疊加后將變得無(wú)法區(qū)分.該臨界距離的確定通常采用瑞利判據(jù),即以一個(gè)像斑的中心與另一個(gè)像斑的第一暗環(huán)重合作為區(qū)分標(biāo)準(zhǔn),此時(shí)兩像斑中心距離等于艾里斑半徑.計(jì)算此時(shí)對(duì)應(yīng)的兩個(gè)物點(diǎn)的距離,可得到極限分辨率為d=0.61λ/NA,其中NA=nsinu稱(chēng)為數(shù)值孔徑,n和u分別為物方折射率和孔徑角.

圖1 從空域和頻域理解衍射極限分辨率 (a)系統(tǒng)孔徑衍射形成的艾里斑;(b)區(qū)分兩個(gè)像斑的瑞利判據(jù);(c)頻率分量、光學(xué)傳遞函數(shù)和截止頻率Fig.1.Understanding di ff raction limit resolution from spatial and frequency domain：(a)Airy disk formed by system aperture di ff raction;(b)Rayleigh criterion for distinguishing two image spots;(c)frequency component, optical transfer function and cuto fffrequency.

從頻域角度,顯微鏡的成像過(guò)程可用二次成像理論解釋[1],即物體使光波產(chǎn)生衍射后,各級(jí)衍射波通過(guò)物鏡聚焦到后焦面形成衍射圖樣,圖樣上各點(diǎn)發(fā)出的子波在像平面相干疊加形成像.其中物鏡后焦面也稱(chēng)頻譜面,其上形成的圖樣稱(chēng)為空間頻譜,靠近光軸的頻譜點(diǎn)對(duì)應(yīng)小角度衍射波,距離光軸較遠(yuǎn)的頻譜點(diǎn)對(duì)應(yīng)大角度衍射波,每個(gè)頻譜點(diǎn)的坐標(biāo)對(duì)應(yīng)一組空間頻率.由此可推論,由于光學(xué)系統(tǒng)存在有限孔徑,角度過(guò)大的衍射波將無(wú)法通過(guò),從而頻譜面上將不出現(xiàn)相應(yīng)的頻譜點(diǎn),也沒(méi)有相應(yīng)的子波傳播到像平面.也就是說(shuō),頻譜面上的空間頻譜將由于系統(tǒng)存在孔徑而被限制在一個(gè)有限范圍內(nèi),超出該范圍的空間頻率對(duì)應(yīng)的衍射波將被濾除,可通過(guò)的最高空間頻率稱(chēng)為系統(tǒng)的截止頻率.對(duì)于熒光顯微成像系統(tǒng),只有平行于光軸的零級(jí)衍射波能全部通過(guò),其他方向的衍射波隨角度增大將逐漸被部分濾除.根據(jù)系統(tǒng)觀(guān)點(diǎn),該現(xiàn)象稱(chēng)為系統(tǒng)對(duì)不同頻率成分有不同的傳遞能力,用光學(xué)傳遞函數(shù)(optical transfer function,OTF)表征,如圖1(c)所示.系統(tǒng)的像方截止頻率由孔徑角u′和波長(zhǎng)λ決定,定量關(guān)系為相應(yīng)的物方截止頻率為ξ0=2NA/λ.截止頻率的存在,意味著得到的像缺少了來(lái)自物體的高階衍射波的貢獻(xiàn),而這些高階衍射波對(duì)應(yīng)的正是物體的細(xì)節(jié),系統(tǒng)無(wú)法傳遞這部分信息導(dǎo)致無(wú)法分辨與其對(duì)應(yīng)的細(xì)節(jié),因而分辨率存在上限.圖1(c)模擬了三個(gè)截止頻率不同的系統(tǒng)對(duì)同一物體的成像,其中代表物體光強(qiáng)分布的黑色曲線(xiàn)由圖中藍(lán)、紅、綠三色代表的三個(gè)不同余弦分量疊加而成.可見(jiàn),當(dāng)截止頻率較高、三個(gè)頻率分量均能通過(guò)時(shí),物體結(jié)構(gòu)在像中得到了較好的重現(xiàn);而當(dāng)截止頻率逐漸降低使部分高頻分量不能通過(guò)時(shí),得到的像將逐漸丟失相應(yīng)細(xì)節(jié).因此,截止頻率決定了系統(tǒng)的分辨能力,其倒數(shù)即為極限分辨率,即d=1/ξ0=λ/2NA,這就是E.K.Abbe提出的極限分辨率公式,稱(chēng)為阿貝衍射極限.

3 超分辨顯微成像技術(shù)原理及發(fā)展

3.1 超分辨的含義和實(shí)現(xiàn)途徑

衍射是光波的基本性質(zhì),而顯微成像系統(tǒng)的有限孔徑又是客觀(guān)存在的,因此如前所述的衍射極限分辨率,確實(shí)是一個(gè)客觀(guān)存在、無(wú)法超越的理論極限.既然如此,又何以“超分辨”呢？實(shí)際上,近十幾年來(lái)發(fā)展非常迅速的各種SRM技術(shù),并非真的發(fā)明了不再受該理論極限限制的顯微鏡,而是通過(guò)各種巧妙的辦法在衍射受限的系統(tǒng)中“繞過(guò)”衍射極限對(duì)圖像分辨率的限制,獲得分辨率高于衍射極限分辨率的超分辨顯微圖像.如果非要將從物體到超分辨圖像之間看成一個(gè)系統(tǒng)的話(huà),則該系統(tǒng)不僅包括熒光顯微成像系統(tǒng),還應(yīng)包括獲得超分辨圖像所需的用來(lái)繞過(guò)衍射極限的手段.根據(jù)采取手段的不同,可將目前常見(jiàn)的各種SRM技術(shù)分為以下三類(lèi).

第一類(lèi)是針對(duì)寬場(chǎng)成像系統(tǒng)的空域處理技術(shù),以基于單分子定位的稀疏重構(gòu)技術(shù)為主,代表性技術(shù)包括2006年幾乎同時(shí)報(bào)道的三種技術(shù),即Betzig等[5]發(fā)明的光激活定位顯微(photoactivated localization microscopy,PALM),Rust等[6]提出的隨機(jī)光學(xué)重建顯微(stochastic optical reconstruction microscopy,STORM)和Hess等[7]報(bào)道的熒光激活定位顯微( fl uorescence photoactivated localization microscopy,FPALM),其共同特點(diǎn)是控制熒光分子稀疏發(fā)光,使得一個(gè)衍射極限范圍內(nèi)基本不會(huì)有兩個(gè)分子同時(shí)發(fā)光而導(dǎo)致不可區(qū)分,通過(guò)多次成像和定位獲得各個(gè)熒光分子的位置而重構(gòu)出超分辨圖像.

第二類(lèi)是針對(duì)掃描成像系統(tǒng)的空域處理技術(shù),也稱(chēng)為點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)工程(PSF engineering),以1994年Hell等[8,9]提出并于2000年實(shí)現(xiàn)的受激輻射耗盡(stimulated emission depletion,STED)技術(shù)為代表,其特點(diǎn)是針對(duì)點(diǎn)掃描系統(tǒng)中激光會(huì)聚于樣品時(shí)因物鏡孔徑衍射形成一個(gè)艾里斑樣激發(fā)斑的問(wèn)題,利用套在激發(fā)光周?chē)母邚?qiáng)度環(huán)形光使衍射極限范圍內(nèi)除中心點(diǎn)外的熒光分子發(fā)生受激輻射而不產(chǎn)生熒光,等效于將系統(tǒng)的PSF尺寸大幅縮小以獲取超分辨圖像.

第三類(lèi)是頻域處理技術(shù),主要針對(duì)寬場(chǎng)成像系統(tǒng),以2000年Gustafsson發(fā)明的結(jié)構(gòu)光照明顯微(structured illumination microscopy,SIM)[10]及其2005年在此基礎(chǔ)上提出的飽和SIM(saturated SIM,SSIM)[11]為代表,其特點(diǎn)是從頻域的角度提高分辨率,利用摩爾條紋將不可探測(cè)的高頻信息轉(zhuǎn)化為可探測(cè)的低頻信息,即將超出截止頻率以外的空間頻率分量平移到截止頻率范圍內(nèi),因此也有人形象地稱(chēng)其為“移頻法”.

3.2 針對(duì)寬場(chǎng)成像系統(tǒng)的空域處理技術(shù)

普通熒光顯微( fl uorescence microscopy,FM)作為最簡(jiǎn)單的寬場(chǎng)熒光顯微成像技術(shù)被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域.FM一般采用汞燈、氙燈或激光作為激發(fā)光源,對(duì)樣品中的內(nèi)源性熒光分子或外源性熒光探針進(jìn)行全場(chǎng)激發(fā),所發(fā)熒光由物鏡收集后被面陣探測(cè)器(如電荷耦合器(charge-coupled device,CCD),互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體等)接收形成熒光圖像.如前所述,由于系統(tǒng)孔徑的衍射,樣品中靠近的兩個(gè)熒光分子形成的像斑中心距離若小于艾里斑半徑則無(wú)法分辨.然而這里有個(gè)前提,即兩個(gè)分子的光是同時(shí)被探測(cè)的,才導(dǎo)致兩個(gè)像斑疊加無(wú)法區(qū)分.假如兩個(gè)分子是先后發(fā)光并分別被探測(cè)的,則情況將大不相同.因?yàn)榧词姑看纬上竦玫降娜匀皇前锇叨皇抢硐胂顸c(diǎn),但由于已知每個(gè)像斑僅對(duì)應(yīng)一個(gè)熒光分子,則此時(shí)不管像斑多大均可利用質(zhì)心定位法、高斯擬合法等[12]確定其中心(理想像點(diǎn))位置,從而將系統(tǒng)衍射的影響剔除;由于確定該點(diǎn)的過(guò)程不可能絕對(duì)精確,還原出來(lái)的像點(diǎn)尺寸將由定位精度(與探測(cè)到的光子數(shù)有關(guān)[13])決定.將兩張圖像做相同處理后再疊加在一起,此時(shí)只要還原后兩個(gè)像點(diǎn)的半徑小于其間距,疊加后將不會(huì)互相影響.這樣一來(lái),兩個(gè)原本在分辨率極限內(nèi)的分子就變得可分辨了,這就是基于單分子定位的稀疏重構(gòu)技術(shù)“繞過(guò)”衍射極限實(shí)現(xiàn)超分辨的基本原理,如圖2(a)所示.

然而,FM通常采用有機(jī)染料、量子點(diǎn)或熒光蛋白等作為熒光探針,標(biāo)記或表達(dá)于樣品中的特定分子或結(jié)構(gòu)上,且一般需要足夠高的標(biāo)記密度方可如實(shí)反映被標(biāo)記結(jié)構(gòu)的特征,它們?cè)趯拡?chǎng)激發(fā)情況下將同時(shí)被激發(fā)而發(fā)射熒光,又如何能讓靠近的兩個(gè)熒光分子先后發(fā)光而不被同時(shí)探測(cè)呢？假如熒光分子具有開(kāi)/關(guān)兩個(gè)狀態(tài),即在相同激發(fā)條件下既有可發(fā)熒光的,也有不發(fā)熒光的,那么只要能控制每次探測(cè)時(shí)只有少數(shù)分子處于開(kāi)態(tài),則位于衍射極限內(nèi)的兩個(gè)分子同時(shí)發(fā)光的概率就會(huì)很小,這樣每次探測(cè)得到的像斑對(duì)應(yīng)一批單個(gè)的開(kāi)態(tài)熒光分子,可通過(guò)定位獲得它們的幾何像點(diǎn)位置,然后通過(guò)反復(fù)的開(kāi)關(guān)控制、探測(cè)和定位后將得到的大量像點(diǎn)疊加在一起,便可得到一幅分辨率遠(yuǎn)高于衍射極限的超分辨熒光顯微圖像.這就是1995年Betzig[14]提出的基于單分子信號(hào)實(shí)現(xiàn)超分辨成像的構(gòu)思.該思路除了需要具有開(kāi)關(guān)效應(yīng)的熒光探針外,還需要探測(cè)器的靈敏度足夠高、采集速度足夠快,因此該方法能否實(shí)現(xiàn),不僅依賴(lài)于熒光探針的開(kāi)發(fā)和特性研究,也依賴(lài)于高靈敏探測(cè)器的發(fā)展.

圖2 基于單分子定位的稀疏重構(gòu)技術(shù)原理示意圖 (a)PALM/STORM分辨衍射極限內(nèi)兩個(gè)熒光分子的基本原理;(b)利用柱透鏡實(shí)現(xiàn)三維單分子定位的基本原理Fig.2.Schematic diagram of SRM technology based on single molecule localization and reconstruction：(a)Basic principle of resolving two fl uorescent molecules within the di ff raction limit by PALM/STORM;(b)basic principle of three-dimensional single molecule localization based on cylindrical lens.

2006年,Betzig等[5]利用光激活熒光蛋白(photoactivatable green fl uorescent protein,PAGFP)和高靈敏、低噪聲的電子倍增CCD(electronmultiplying CCD,EMCCD)將其構(gòu)思變成現(xiàn)實(shí),實(shí)現(xiàn)了PALM技術(shù).同時(shí),Zhuang團(tuán)隊(duì)[6]和Hess等[7]也分別提出了基于相同原理的STORM和 FPALM技術(shù),區(qū)別僅在于PALM和FPALM利用熒光蛋白的光激活效應(yīng)[15]實(shí)現(xiàn)開(kāi)關(guān),而STORM則利用花菁染料Cy5的閃爍特性.這種基于單分子定位的稀疏重構(gòu)SRM技術(shù)雖然只有短短十年左右的發(fā)展歷史,但由于對(duì)成像設(shè)備要求不高,成為各類(lèi)SRM技術(shù)中應(yīng)用較廣泛、研究最活躍的一類(lèi),近十年來(lái)發(fā)展非常迅速.以STORM為例,早期技術(shù)基于Cy3-Cy5染料分子對(duì)[6],Cy5的激發(fā)光在一定條件下將其由開(kāi)態(tài)轉(zhuǎn)至關(guān)態(tài)而不再發(fā)光,但采用短波長(zhǎng)激光激活后可使關(guān)態(tài)分子重新轉(zhuǎn)回開(kāi)態(tài)而發(fā)光.這種轉(zhuǎn)換與Cy3-Cy5分子對(duì)間的距離有關(guān)[16],經(jīng)過(guò)巧妙設(shè)計(jì)的染料對(duì)在光漂白之前可被開(kāi)關(guān)幾百次,且每次處于開(kāi)態(tài)時(shí)可探測(cè)到幾千個(gè)熒光光子,定位精度可達(dá)10 nm左右.利用類(lèi)似原理,Zhuang團(tuán)隊(duì)[17]進(jìn)一步設(shè)計(jì)了不同的染料對(duì)并通過(guò)選擇性激活實(shí)現(xiàn)了多色STORM.緊接著, Heilemann等[18]發(fā)現(xiàn)單獨(dú)的Cy5(或Alexa 647)也可以直接用短波長(zhǎng)激光激活實(shí)現(xiàn)開(kāi)關(guān),相應(yīng)技術(shù)稱(chēng)為直接STORM(direct STORM,dSTORM),是目前普遍采用的形式.為提高縱向分辨率,研究者們又進(jìn)一步在STORM等單分子定位SRM系統(tǒng)中引入柱透鏡像散[19,20]或雙螺旋點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)等[21]方法,使軸向不同位置的分子形成不同形狀或取向的像斑而可以區(qū)分和定位(如圖2(b)所示),從而實(shí)現(xiàn)了三維STORM(3D-STORM).

然而,基于單分子定位的SRM也不全是依賴(lài)熒光分子開(kāi)關(guān)特性的.例如,同樣在2006年, Sharonov和Hochstrasser[22]提出利用溶液中自由擴(kuò)散的熒光探針與目標(biāo)間的瞬時(shí)結(jié)合和分離實(shí)現(xiàn)熒光分子稀疏探測(cè)的方法,稱(chēng)為點(diǎn)積累納米成像(points accumulation for imaging in nanoscale topography,PAINT).該技術(shù)可采用普通熒光探針,樣品制備簡(jiǎn)單且標(biāo)記密度不受限制,但缺點(diǎn)是成像速度非常慢,獲得一副超分辨圖像往往需要幾個(gè)小時(shí)甚至幾天.此后發(fā)展的利用配體標(biāo)記的uPAINT[23]和利用DNA標(biāo)記的DNA-PAINT[24]或Exchange-PAINT等[25],對(duì)該技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn),但成像速度相比PALM和STORM等仍然慢得多,因此應(yīng)用相對(duì)較少.2008年,Hell團(tuán)隊(duì)[26]則提出了先將大部分熒光分子激發(fā)至三重態(tài),只探測(cè)剩余的或自發(fā)返回基態(tài)的少數(shù)分子的熒光以實(shí)現(xiàn)稀疏激發(fā)的基態(tài)損耗后返回技術(shù)(ground-state depletion followed by single-molecule return,GSDIM).由于原理相似,PAINT,GSDIM也經(jīng)常與前面的PALM/FPALM,STORM一起被統(tǒng)稱(chēng)為單分子定位顯微(single-molecule localization microscopy, SMLM).

實(shí)際上,要想將衍射極限范圍內(nèi)的多個(gè)熒光分子分開(kāi),除了不讓它們同時(shí)發(fā)光外,只要還有其他手段能將疊加在一起的信號(hào)區(qū)分開(kāi),則即使它們同時(shí)發(fā)光也有可能實(shí)現(xiàn)超分辨.因此針對(duì)寬場(chǎng)成像系統(tǒng)的空域處理技術(shù)除SMLM外還有一些其他方法.例如,對(duì)于能夠閃爍(包括自發(fā)間歇性發(fā)光)的熒光探針,由于每個(gè)熒光分子的閃爍過(guò)程是互不相關(guān)的,因此通過(guò)記錄熒光分子的閃爍過(guò)程并對(duì)其隨時(shí)間漲落的實(shí)時(shí)熒光信號(hào)進(jìn)行高階統(tǒng)計(jì)分析可區(qū)分不同分子信號(hào),實(shí)現(xiàn)超分辨成像,這種技術(shù)稱(chēng)為超分辨光學(xué)漲落成像(super-resolution optical fl uctuation imaging,SOFI)[27].與SMLM不同的是,SOFI通常采用熒光量子效率更高的量子點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)記,且不要求稀疏發(fā)光,成像速度更快.又如,熒光分子一般都是極性分子,當(dāng)利用不同朝向的偏振光激發(fā)時(shí),偏振方向與每個(gè)熒光分子的偶極矩夾角不同將導(dǎo)致熒光強(qiáng)度不同,通過(guò)周期性地改變偏振光方向并記錄熒光強(qiáng)度隨偏振方向的改變過(guò)程,也可以分析變化規(guī)律區(qū)分不同的分子實(shí)現(xiàn)超分辨,這種技術(shù)稱(chēng)為偏振反解調(diào)超分辨(super resolution by polarization demodulation,SPoD)[28].

近年來(lái)我國(guó)在這類(lèi)寬場(chǎng)成像空域處理SRM技術(shù)方面的研究一直緊跟國(guó)際前沿,并取得了許多研究進(jìn)展,例如中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所的徐濤教授和徐平勇教授小組致力于研發(fā)新型光開(kāi)關(guān)蛋白[29],華中科技大學(xué)的黃振立教授小組開(kāi)發(fā)新的定位算法[30],張玉慧教授小組研究活細(xì)胞超分辨標(biāo)記新策略[31],東南大學(xué)崔一平教授小組開(kāi)展SMLM的生物應(yīng)用研究[32],北京大學(xué)的席鵬教授小組報(bào)道了關(guān)于SOFI的工作[33,34],并與清華大學(xué)張奇?zhèn)ソ淌谛〗M等共同提出了一種新的基于SPoD的超分辨偶極子取向解析技術(shù)(superresolution dipole orientation mapping via polarization demodulation,SDOM)[35]等.深圳大學(xué)牛憨笨院士小組則針對(duì)3D-STORM對(duì)軸向漂移敏感的問(wèn)題,設(shè)計(jì)了性能遠(yuǎn)高于市售設(shè)備的軸向防漂移系統(tǒng),并結(jié)合3D-STORM和基于分子信標(biāo)的熒光原位雜交技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)長(zhǎng)度僅2.5 kb的非重復(fù)基因組序列的三維超分辨成像,是目前國(guó)際上的最短記錄[36].

3.3 針對(duì)掃描成像系統(tǒng)的空域處理技術(shù)

共聚焦激光掃描顯微(confocal laser scanning microscopy,CLSM)是最典型的掃描熒光顯微成像技術(shù),它借助一對(duì)“共焦小孔”將焦平面以外的熒光信號(hào)濾除,不僅獲得了遠(yuǎn)比普通FM清晰的圖像,而且提高了縱向分辨率[37],具有光學(xué)層切和三維成像能力,在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛.在掃描成像系統(tǒng)中,激光經(jīng)物鏡聚焦到樣品上逐點(diǎn)掃描,掃描點(diǎn)上熒光分子的熒光由光電倍增管(photomultiplier tube,PMT)等點(diǎn)探測(cè)器收集,經(jīng)數(shù)據(jù)處理形成一幅對(duì)應(yīng)掃描點(diǎn)陣的圖像,圖像分辨率與掃描點(diǎn)陣有關(guān).然而,是否縮小采樣間距就能無(wú)限提高掃描成像系統(tǒng)的分辨率呢？答案是否定的.這是因?yàn)閽呙璩上裣到y(tǒng)同樣受到衍射極限的限制,只是形式與寬場(chǎng)成像略有不同：寬場(chǎng)成像時(shí)衍射極限直觀(guān)地表現(xiàn)為樣品中一個(gè)熒光分子發(fā)出的光到達(dá)面探測(cè)器時(shí)變成了一個(gè)像斑,而在掃描成像系統(tǒng)中則更主要地體現(xiàn)在激光聚焦在樣品上時(shí)不能形成一個(gè)理想的掃描點(diǎn),而是形成一個(gè)艾里斑樣的激發(fā)斑.因此每個(gè)掃描點(diǎn)處PMT收集到的熒光信號(hào)并非只來(lái)自理想掃描點(diǎn),而是激發(fā)斑范圍內(nèi)全部熒光分子信號(hào)的累積,導(dǎo)致靠近的兩個(gè)熒光分子在掃描得到的圖像上同樣無(wú)法區(qū)分.因此,對(duì)于掃描成像系統(tǒng)而言,提高成像分辨率的關(guān)鍵在于縮小激發(fā)斑尺寸,而該尺寸由衍射極限公式?jīng)Q定,無(wú)法無(wú)限縮小.

那么,在激發(fā)斑無(wú)法縮小的前提下,如何才能進(jìn)一步提高成像分辨率呢？實(shí)際上這里的衍射極限限制仍然隱含著一個(gè)前提,即整個(gè)激發(fā)斑內(nèi)的熒光分子同時(shí)發(fā)出熒光并被點(diǎn)探測(cè)器收集.假如可使激發(fā)斑內(nèi)的熒光分子即使全部激發(fā)也只有中心點(diǎn)發(fā)熒光,則探測(cè)信號(hào)就只來(lái)自于理想掃描點(diǎn),等效于將有效激發(fā)斑大幅縮小,提高成像分辨率.這就是Hell等[8,9]于1994年提出并在2000年實(shí)現(xiàn)的STED技術(shù)的基本思路,其令激發(fā)斑內(nèi)中心點(diǎn)外其他分子不發(fā)熒光的辦法,是利用一束與激發(fā)光共軸且波長(zhǎng)與熒光分子發(fā)射波長(zhǎng)匹配的環(huán)形光(稱(chēng)為STED光、損耗光或擦除光),使處于該環(huán)形光范圍內(nèi)的激發(fā)態(tài)分子由于受激輻射而迅速回落到基態(tài),阻止它們發(fā)熒光,如圖3(a)所示.掃描系統(tǒng)的激發(fā)斑也稱(chēng)激發(fā)PSF,與探測(cè)端的PSF共同決定熒光成像系統(tǒng)的PSF;對(duì)于一般的掃描成像系統(tǒng),系統(tǒng)PSF更多地由激發(fā)PSF決定,因此Hell[38]也將其提出的STED技術(shù)稱(chēng)為PSF工程.在該技術(shù)中,環(huán)形STED光的產(chǎn)生和質(zhì)量決定了等效激發(fā)PSF的尺寸,因此成為影響STED分辨率的關(guān)鍵.實(shí)驗(yàn)上產(chǎn)生STED環(huán)形光的方法一般是通過(guò)引入相位調(diào)制,使光束中心由于相消干涉而光強(qiáng)近似為零,例如在Hell最早的實(shí)驗(yàn)報(bào)道中采用的是在玻璃基板中心附近蒸鍍一層光程為STED光半波長(zhǎng)的氟化鎂薄膜的方法,而目前常用的做法則是利用相位從0到2π連續(xù)變化的螺旋相位片來(lái)進(jìn)行調(diào)制[39](圖3(b)),使得調(diào)制后任意角度對(duì)稱(chēng)兩側(cè)的光波前均反相而在中心處相消干涉獲得極小的暗點(diǎn).而環(huán)形STED光能否有效地將激發(fā)態(tài)熒光分子通過(guò)受激輻射途徑迅速耗盡,則與其功率密度密切相關(guān),因此系統(tǒng)最終達(dá)到的分辨率由衍射極限分辨率和STED光功率密度I與飽和功率密度Is的比值共同決定,即d=λ/2NA·(1+I/Is)-1/2,其中Is為STED光將90%的激發(fā)態(tài)分子受激輻射耗盡所需的功率密度.可見(jiàn),STED光功率越高,系統(tǒng)分辨率也越高,因此引入STED光后分辨率可以大幅提高到遠(yuǎn)高于衍射極限分辨率的水平(幾十納米甚至更高).

圖3 STED技術(shù)原理示意圖 (a)激發(fā)光、STED光、相應(yīng)能級(jí)圖和等效激發(fā)PSF;(b)STED光的產(chǎn)生及STED系統(tǒng)示意圖Fig.3.Schematic diagram of STED：(a)Excitation beam,STED beam,corresponding energy level diagram and equivalent excitation PSF;(b)generation of STED beam and schematic diagram of STED system.

然而STED技術(shù)中Is一般為10—103MW/cm2量級(jí),只有這樣才能使激發(fā)態(tài)分子通過(guò)受激輻射返回基態(tài)的速率明顯高于其通過(guò)自發(fā)輻射發(fā)出熒光返回基態(tài)的速率[40].這就意味著STED光必須是高強(qiáng)度脈沖激光,這不僅增加了系統(tǒng)造價(jià),而且對(duì)樣品損傷也較大,影響了STED技術(shù)在活細(xì)胞成像中的應(yīng)用.因此,Hell[41]在提出STED思路后緊接著又提出了另一個(gè)設(shè)想,稱(chēng)為基態(tài)耗盡(ground-state depletion,GSD)技術(shù),基本原理是將激發(fā)斑周邊熒光分子抽運(yùn)到三重態(tài),使得只有掃描點(diǎn)附近的分子具備被激發(fā)至單重激發(fā)態(tài)并發(fā)出熒光的條件.許多熒光染料分子的激發(fā)過(guò)程本來(lái)就常常伴隨這種從單重態(tài)到三重態(tài)的系間竄越過(guò)程(概率約為5%—20%),且三重態(tài)的亞穩(wěn)態(tài)性質(zhì)使得該過(guò)程更容易飽和,因此理論上利用該過(guò)程所需的飽和功率密度相比STED技術(shù)可低2—4個(gè)數(shù)量級(jí),這一方面可使系統(tǒng)更容易獲得更高的分辨率,另一方面可將損耗光強(qiáng)度大幅降低而使該技術(shù)更適合活細(xì)胞成像[40].Hell研究小組還進(jìn)一步從理論上對(duì)STED和GSD技術(shù)進(jìn)行分析,并將類(lèi)似的抑制一部分熒光分子發(fā)光的途徑歸納為可逆飽和線(xiàn)性熒光躍遷(reversible saturable optical fl uorescence transitions,RESOLFT)[40].2005年,他們利用具有開(kāi)關(guān)效應(yīng)的熒光探針在實(shí)驗(yàn)上實(shí)現(xiàn)了RESOLFT技術(shù),并成功將損耗光功率密度降低了8個(gè)數(shù)量級(jí)[42].

目前國(guó)際上研究STED技術(shù)和應(yīng)用的團(tuán)隊(duì)很多,而發(fā)明STED的Hell研究團(tuán)隊(duì)也在不斷改進(jìn)STED技術(shù)使其更適用于生物研究：GSD和RESOLFT等概念的提出和實(shí)現(xiàn)在降低對(duì)激光器要求的同時(shí)提高了該技術(shù)與生物樣品的兼容性[43],雙色STED技術(shù)的實(shí)現(xiàn)擴(kuò)展了其應(yīng)用范圍[44],連續(xù)光激光器的采用降低了使用成本[45],快速STED技術(shù)實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞囊泡運(yùn)動(dòng)、神經(jīng)突觸生長(zhǎng)等活細(xì)胞動(dòng)態(tài)過(guò)程的實(shí)時(shí)超分辨研究[46,47]等.在我國(guó),北京大學(xué)的席鵬教授研究組[48]2012年首次在國(guó)內(nèi)實(shí)現(xiàn)了STED技術(shù),隨后浙江大學(xué)的劉旭教授研究組[49]、中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所的方曉紅教授研究組[50]、北京大學(xué)的施可彬教授研究組等[51]也報(bào)道了STED方面的研究進(jìn)展.針對(duì)光學(xué)系統(tǒng)像差和生物樣品光學(xué)性質(zhì)不均勻等導(dǎo)致STED對(duì)厚樣品進(jìn)行超分辨成像時(shí)分辨率急劇降低的問(wèn)題,我們團(tuán)隊(duì)開(kāi)展了利用相干光學(xué)自適應(yīng)技術(shù)(coherent optical adaptive technique,COAT)改善STED光質(zhì)量從而提高STED成像深度的研究工作,并取得很好效

果[52].

3.4 頻域處理技術(shù)

如前所述,從頻域角度,顯微成像技術(shù)的衍射極限分辨率來(lái)源于系統(tǒng)OTF的截止頻率,高于截止頻率的成分被濾除,樣品中周期小于截止頻率倒數(shù)的余弦分量丟失.針對(duì)這一問(wèn)題,Gustafsson[10]于2000年提出了SIM技術(shù),基本原理是利用摩爾條紋把原本不能通過(guò)系統(tǒng)的高頻信息平移到可觀(guān)察的頻率范圍內(nèi)來(lái)實(shí)現(xiàn)超分辨(圖4(a)).具體地,是利用周期性結(jié)構(gòu)照明光激發(fā)樣品,使頻域上由于結(jié)構(gòu)光頻譜與物頻譜的卷積而產(chǎn)生攜帶物體信息的多級(jí)頻譜.例如,采用正弦結(jié)構(gòu)光可產(chǎn)生0級(jí)和±1級(jí)頻譜,兩兩間距離ξ1為結(jié)構(gòu)光周期的倒數(shù),其中±1級(jí)頻譜將攜帶物體細(xì)節(jié)信息的高頻部分平移至截止頻率范圍內(nèi)而被探測(cè).但這些高頻信息與0級(jí)頻譜的低頻信息疊加在一起(圖4(b)),需要后期數(shù)據(jù)處理將三級(jí)頻譜分開(kāi)才能有效獲得樣品的高頻信息.這種思路在信號(hào)處理或其他光學(xué)成像領(lǐng)域(如光學(xué)三維成像[53],X射線(xiàn)相襯成像等[54])也有廣泛應(yīng)用,且發(fā)展了較成熟的圖像處理方法.SIM技術(shù)中通常采用相移法,基本思路是令結(jié)構(gòu)光在一個(gè)周期內(nèi)等間距平移若干次(≥3)并利用獲得的多個(gè)疊加光強(qiáng)來(lái)求解.處理的結(jié)果使頻譜范圍從原來(lái)的(-ξ0,ξ0)拓展到(-ξ0-ξ1,ξ0+ξ1),因此ξ1越大(結(jié)構(gòu)光周期越小)等效截止頻率越高,分辨率越高.將結(jié)構(gòu)光的取向進(jìn)行旋轉(zhuǎn)(圖4(c))可實(shí)現(xiàn)二維平面的頻率拓展.然而由于結(jié)構(gòu)光條紋照射在樣品上也受到系統(tǒng)衍射限制(ξ1≤ξ0),因此等效截止頻率最多可拓展到2ξ0,即SIM的分辨率最多能在衍射極限基礎(chǔ)上提高一倍.然而即便SIM的分辨率不如前兩類(lèi)SRM技術(shù)的高,由于不需要掃描且獲取一幅超分辨圖像需要的原始圖像數(shù)量少,成像速度快,加上對(duì)樣品制備和熒光探針沒(méi)有任何特殊要求,對(duì)激發(fā)光功率要求也不高,光漂白和光損傷程度小,SIM在活細(xì)胞成像方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì).

圖4 SIM技術(shù)原理示意圖 (a)摩爾條紋的形成;(b)正弦結(jié)構(gòu)光產(chǎn)生的移頻效應(yīng);(c)二維空間頻率拓展的實(shí)現(xiàn)Fig.4.Schematic diagram of SIM：(a)Formation of moiré fringes;(b)frequency shift produced by sinusoidal structured illumination;(c)realization of two-dimensional spatial frequency expansion.

光柵衍射告訴我們,正弦光柵只有0級(jí)和±1級(jí)頻譜,而矩形光柵的頻譜則要豐富得多,根據(jù)占空比的不同,除0級(jí)和±1級(jí)外,還可能出現(xiàn)±2級(jí)、±3級(jí)等其他高階頻譜.因此,假如能夠產(chǎn)生一個(gè)占空比較小的矩形條紋作為結(jié)構(gòu)光,則可以產(chǎn)生多級(jí)頻譜,使等效截止頻率得到多次拓展而大幅提高分辨率.但由于結(jié)構(gòu)光的產(chǎn)生也受到光學(xué)系統(tǒng)衍射的限制,直接在物平面上形成一個(gè)周期接近衍射極限分辨率的矩形條紋并不現(xiàn)實(shí).2005年, Gustafsson[11]在SIM的基礎(chǔ)上提出了SSIM技術(shù),巧妙地利用熒光分子的飽和激發(fā)使樣品在正弦光波激發(fā)下發(fā)出具有高階頻率分量的非正弦分布結(jié)構(gòu)熒光,從而實(shí)現(xiàn)多級(jí)頻譜拓展,將分辨率提高到了幾十納米的水平.然而由于需要較高能量才能實(shí)現(xiàn)熒光分子的飽和激發(fā),這種方法并不適合活細(xì)胞成像,無(wú)法發(fā)揮SIM的優(yōu)勢(shì),因此并未被廣泛應(yīng)用. Heintzmann等[55]于2002年提出的飽和圖案激發(fā)顯微(saturated patterned excitation microscopy, SPEM)概念,也是基于類(lèi)似的基本原理.

早期SIM系統(tǒng)采用置于顯微鏡管鏡前焦面的透射式相位光柵來(lái)產(chǎn)生結(jié)構(gòu)光照明[10],即令光柵產(chǎn)生的±1級(jí)衍射光分別會(huì)聚于物鏡后焦面上對(duì)稱(chēng)的兩點(diǎn),從而在物平面上產(chǎn)生兩束互成一定角度的光干涉形成結(jié)構(gòu)光照明樣品.通過(guò)調(diào)整物鏡后焦面上兩個(gè)會(huì)聚光斑的相對(duì)距離可改變結(jié)構(gòu)光的周期,當(dāng)兩個(gè)會(huì)聚斑盡量靠近孔徑邊緣時(shí)得到頻率最高(ξ1≈ξ0)的結(jié)構(gòu)光.根據(jù)類(lèi)似原理,Gustafsson團(tuán)隊(duì)[56]進(jìn)一步通過(guò)改變光柵參數(shù)使物平面上產(chǎn)生三維結(jié)構(gòu)光,將三維OTF的截止頻率在橫向和軸向上同時(shí)進(jìn)行拓展,實(shí)現(xiàn)了三維SIM(3D-SIM).為克服原始圖像獲取過(guò)程中相位光柵平移和旋轉(zhuǎn)對(duì)成像速度的限制,他們又引入空間光調(diào)制器(spatial light modulator,SLM)代替光柵,先后實(shí)現(xiàn)了二維和三維活細(xì)胞實(shí)時(shí)超分辨成像[57,58],并采用全內(nèi)反射熒光(total internal re fl ection fl uorescence, TIRF)照明進(jìn)一步提高成像質(zhì)量.此后,他們又在光路中引入可調(diào)液晶相位延遲器實(shí)現(xiàn)了雙色3D-SIM并用于活細(xì)胞研究[59].

不幸的是Gustafsson罹患癌癥于2011年英年早逝,與其同在美國(guó)霍華德·休斯醫(yī)學(xué)研究所Janelia研究園的PALM發(fā)明人Betzig承接了他的SIM實(shí)驗(yàn)室和研究小組并繼續(xù)將SIM技術(shù)發(fā)揚(yáng)光大.近幾年來(lái),Betzig團(tuán)隊(duì)致力于發(fā)展適合活細(xì)胞三維快速成像的光片顯微(light sheet microscopy,LSM),先后發(fā)展了貝塞爾(Bessel)光[60]和格子(lattice)光片照明技術(shù)[61],并將其與SIM和PAINT等技術(shù)結(jié)合,實(shí)現(xiàn)了對(duì)厚樣品的三維超分辨成像[62].2015年,Betzig等[63]將lattice-LSM和采用光控開(kāi)關(guān)熒光探針的非線(xiàn)性SIM(nonlinear SIM,NL-SIM)結(jié)合在一起,不僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)活細(xì)胞的雙色三維快速成像,且空間分辨率最高可達(dá)45 nm,突破了SIM只能將分辨率提高一倍的限制,同時(shí)又避免了早期提出的SSIM中高功率激光對(duì)細(xì)胞的光毒性等問(wèn)題,具有很好的發(fā)展前景.在我國(guó),中國(guó)科學(xué)院西安光學(xué)精密機(jī)械研究所姚保利課題組[64]報(bào)道了基于DMD光調(diào)制的SIM技術(shù).

3.5 三類(lèi)方法的優(yōu)缺點(diǎn)和發(fā)展趨勢(shì)比較

綜上所述,可以看出各類(lèi)SRM技術(shù)雖然原理各不相同,但由于均是面向生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用發(fā)明和發(fā)展起來(lái)的,因此不管對(duì)于哪種技術(shù),提高分辨率均已不是惟一的追求,如何滿(mǎn)足生物醫(yī)學(xué)需要的多色、三維、活體等成像需求,一直以來(lái)也是各類(lèi)SRM技術(shù)發(fā)展的目標(biāo).而由于三類(lèi)方法各有優(yōu)缺點(diǎn),它們所面臨的挑戰(zhàn)也各不相同.

以活細(xì)胞成像為例：STORM和PALM等寬場(chǎng)成像空域處理技術(shù),其分辨率取決于定位精度,可達(dá)到橫向高于20 nm、軸向高于50 nm的水平,但由于重構(gòu)一幅超分辨圖像需要采集平均數(shù)萬(wàn)張?jiān)紙D像,成像速度受限,通常只能用于固定細(xì)胞,盡管也有一些活細(xì)胞成像的報(bào)道[65],但到目前為止距離實(shí)際應(yīng)用仍較遠(yuǎn),這是因?yàn)榛罴?xì)胞應(yīng)用的高幀頻要求和單分子定位精度對(duì)光子數(shù)的要求是矛盾的,提高激光功率密度雖可一定程度上同時(shí)得到較高的幀頻和光子數(shù),但由此帶來(lái)的光漂白問(wèn)題限制了活細(xì)胞實(shí)時(shí)觀(guān)察的時(shí)長(zhǎng)(幾十秒).因此,如何在較低功率密度和不降低光子數(shù)的同時(shí)提高幀頻以適應(yīng)活細(xì)胞實(shí)時(shí)超分辨成像的需求,還有賴(lài)于熒光探針閃爍特性的改善(包括探針結(jié)構(gòu)的改進(jìn)和化學(xué)環(huán)境的優(yōu)化等)和活體標(biāo)記技術(shù)的研究[66].

STED和RESOLFT等針對(duì)掃描系統(tǒng)的技術(shù),其分辨率由擦除光功率密度與飽和光功率密度的比值決定,也可以達(dá)到幾十納米的水平,成像速度取決于掃描速度,與普通CLSM的成像速度基本一致,可以適應(yīng)活細(xì)胞成像的需求,然而由于STED光功率密度相比STORM光功率密度要高4—6個(gè)數(shù)量級(jí),因此對(duì)活細(xì)胞的光毒性和光損傷不能忽略,且高功率STED光在實(shí)現(xiàn)熒光擦除的同時(shí)也加劇了熒光分子的光漂白,這些都限制了STED在活細(xì)胞成像中的應(yīng)用.采用光控開(kāi)關(guān)熒光探針的RESOLFT技術(shù)一定程度上克服了這些問(wèn)題,在活細(xì)胞成像方面具有一些優(yōu)勢(shì);但由于原理不同,RESOLFT需要的光控開(kāi)關(guān)熒光探針與現(xiàn)有的STORM探針不同,因?yàn)镾TORM需要探針單次閃爍期間光子數(shù)足夠多,而RESOLFT則要求其在光漂白之前閃爍次數(shù)要足夠多,因此,RESOLFT的進(jìn)一步發(fā)展和應(yīng)用,也與熒光探針的研發(fā)和閃爍機(jī)理研究有著密切關(guān)系.

頻域處理的SIM技術(shù)由于僅需要采集九幅寬場(chǎng)圖像便能恢復(fù)出一幅超分辨圖像,因此不管是相比需要采集幾萬(wàn)張?jiān)紙D像的STORM/PALM技術(shù)還是相比需要點(diǎn)掃描的STED/RESOLFT技術(shù),其成像速度都要快得多;而其激光功率密度比STORM/PALM技術(shù)還要低2—3個(gè)數(shù)量級(jí),對(duì)樣品的光漂白和光損傷等問(wèn)題幾乎可以忽略,因此在活細(xì)胞實(shí)時(shí)成像方面具有絕對(duì)的優(yōu)勢(shì).然而由于成像原理的限制SIM只能將分辨率提高一倍,即最高100 nm左右;SSIM技術(shù)可以將分辨率提高到可與STORM/PALM或STED/RESOLFT相比擬的幾十納米水平,但飽和激發(fā)所需的高功率密度卻使其失去了活細(xì)胞成像的優(yōu)勢(shì);采用光控開(kāi)光熒光探針的NL-SIM同時(shí)克服了這兩方面的問(wèn)題,在活細(xì)胞實(shí)時(shí)超分辨成像方面具有非常好的應(yīng)用前景.

4 超分辨關(guān)聯(lián)顯微技術(shù)研究進(jìn)展

超分辨關(guān)聯(lián)顯微技術(shù)是近年來(lái)SRM的一個(gè)新的發(fā)展趨勢(shì).關(guān)聯(lián)顯微的概念原指光學(xué)-電子關(guān)聯(lián)顯微(correlative light-electron microscopy, CLEM)[67],即將具有納米分辨能力但特異性差的電子顯微(electron microscopy,EM)和具有分子特異性識(shí)別能力但由于衍射限制只能分辨幾百納米的光學(xué)顯微技術(shù),尤其是FM相結(jié)合,從而架起微觀(guān)世界和納米世界之間的橋梁.廣義地,關(guān)聯(lián)顯微也指利用具有不同特點(diǎn)的兩種或多種顯微成像技術(shù)同時(shí)或先后對(duì)同一樣品的同一區(qū)域進(jìn)行成像,并將獲得的結(jié)果進(jìn)行融合、對(duì)比和/或相關(guān)性分析,從而實(shí)現(xiàn)不同技術(shù)間的優(yōu)勢(shì)互補(bǔ).

實(shí)際上,就像我們需要綜合運(yùn)用視覺(jué)、嗅覺(jué)、觸覺(jué)等對(duì)一個(gè)物體的形狀、顏色、氣味、質(zhì)地等做出判斷方可對(duì)其全面認(rèn)知一樣,任何一種先進(jìn)的顯微成像技術(shù)都不可能單獨(dú)提供研究一個(gè)問(wèn)題的全面數(shù)據(jù),甚至無(wú)法完備地描述一個(gè)體系的結(jié)構(gòu),因此這種優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)在任何時(shí)候都是有益的.關(guān)聯(lián)顯微綜合運(yùn)用兩種或多種先進(jìn)顯微成像技術(shù),可以實(shí)現(xiàn)多維度、多尺度、多模態(tài)信息獲取,從而綜合得到生物樣品在形態(tài)、功能、動(dòng)力學(xué)、微環(huán)境和化學(xué)成分等多方面的信息[68].

近年來(lái)快速崛起的SRM技術(shù)為關(guān)聯(lián)顯微的發(fā)展帶來(lái)了新的挑戰(zhàn)和機(jī)遇.目前已有許多SRM與其他顯微技術(shù)關(guān)聯(lián)的報(bào)道.例如,2011年《Nature Methods》就報(bào)道了聯(lián)用多種SRM技術(shù)和EM對(duì)多種蛋白在亞細(xì)胞水平進(jìn)行定位的研究,獲得了組蛋白H2B在細(xì)胞核中的高分辨定位和TOM20蛋白在線(xiàn)粒體中的定位[69].SRM縮小了普通FM與EM之間的分辨率差距,因此這種關(guān)聯(lián)有助于提高結(jié)果相關(guān)性分析的準(zhǔn)確性,使關(guān)聯(lián)顯微獲得的結(jié)果更有意義.與此同時(shí),SRM作為一種新興技術(shù),其與分辨率更高、技術(shù)相對(duì)成熟的EM技術(shù)的關(guān)聯(lián)反過(guò)來(lái)也有助于對(duì)其所取得的新結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證.除了SRM-EM關(guān)聯(lián)顯微,目前報(bào)道的基于SRM的關(guān)聯(lián)顯微技術(shù)還有很多,這些超分辨關(guān)聯(lián)顯微技術(shù)可以大致分為幾類(lèi)：SRM與其他衍射受限光學(xué)顯微技術(shù)的關(guān)聯(lián),SRM與光譜測(cè)量技術(shù)的關(guān)聯(lián),以及SRM與非光學(xué)顯微技術(shù)的關(guān)聯(lián).這些關(guān)聯(lián)往往都能為同一個(gè)生物學(xué)問(wèn)題提供不同尺度、不同維度或不同角度的信息互相印證,從而可使研究更加深入.

4.1 超分辨成像與其他衍射受限光學(xué)顯微技術(shù)的關(guān)聯(lián)

這一類(lèi)型的關(guān)聯(lián)是最直接的,因?yàn)閮烧哂锌赡懿捎孟嗤臉悠分苽淞鞒毯托再|(zhì)相似的熒光探針,也有可能基于相同或相似的光學(xué)系統(tǒng)進(jìn)行成像,因而為關(guān)聯(lián)帶來(lái)了極大便利.這種關(guān)聯(lián)的主要作用是彌補(bǔ)SRM目前的一些弱點(diǎn),以便最大程度地發(fā)揮其在分辨率方面的優(yōu)勢(shì),作用包括：識(shí)別和區(qū)分特定目標(biāo)、提供多層次背景結(jié)構(gòu)信息、提高時(shí)間分辨能力、豐富功能成像信息、實(shí)現(xiàn)多色超分辨等.

4.1.1 超分辨-普通熒光關(guān)聯(lián)顯微

圖5 SRM-FM關(guān)聯(lián)顯微應(yīng)用實(shí)例：識(shí)別和區(qū)分特定目標(biāo)[70]Fig.5.Correlative SRM-FM applications：Identifying and distinguishing speci fi c targets[70].

SRM通常采用高倍物鏡進(jìn)行成像,其視場(chǎng)一般僅有幾十微米,直接在SRM成像模式下尋找特定目標(biāo)往往比較困難.而傳統(tǒng)FM作為最簡(jiǎn)單、應(yīng)用最廣泛的熒光顯微成像技術(shù),在特定細(xì)胞或結(jié)構(gòu)的標(biāo)記和判別方面已形成了一套比較完整的體系.因此,將SRM與普通FM進(jìn)行關(guān)聯(lián),可以先利用FM在較低分辨率下快速尋找到感興趣區(qū)域后再切換到SRM模式進(jìn)行超分辨成像,還可以采用與SRM成像所用熒光探針具有不同光譜性質(zhì)的其他探針對(duì)特定細(xì)胞或結(jié)構(gòu)進(jìn)行特異性標(biāo)記,以更好地識(shí)別和區(qū)分感興趣的目標(biāo).例如,Xu等[70]利用3D-STORM技術(shù)對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞骨架進(jìn)行超分辨成像研究的工作中就采用了這種SRM-FM關(guān)聯(lián)技術(shù)來(lái)區(qū)分神經(jīng)元中的樹(shù)突和軸突兩種不同的突觸結(jié)構(gòu).如圖5所示,他們除了使用聯(lián)接有熒光分子Alexa 647的鬼筆環(huán)肽標(biāo)記肌動(dòng)蛋白微絲外,還利用另一種熒光探針Alexa 555免疫標(biāo)記了樹(shù)突中的特異性蛋白MAP2(圖5(a)和圖5(d))和軸突起始段中的特異性蛋白NrCAM(圖5(f)),首先利用傳統(tǒng)FM成像區(qū)分樹(shù)突和軸突,再利用3D-STORM對(duì)兩者的微絲結(jié)構(gòu)進(jìn)行SRM成像(圖5(b),(e)和(g)),從而發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元兩種突觸中的微絲具有完全不同的超分辨結(jié)構(gòu),其中軸突的微絲具有明顯的周期性結(jié)構(gòu).

4.1.2 超分辨-共聚焦關(guān)聯(lián)顯微

目前,雖然如前所述各種SRM都在努力實(shí)現(xiàn)多色成像,但多數(shù)SRM技術(shù)由于對(duì)熒光探針或光學(xué)系統(tǒng)有特殊要求,還不能方便地實(shí)現(xiàn)很好的多色成像.而CLSM作為另一種在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛的熒光顯微成像技術(shù),其多通道成像功能可以很好地彌補(bǔ)SRM這方面的不足：在利用SRM對(duì)一些細(xì)微結(jié)構(gòu)進(jìn)行超分辨成像之前,可先通過(guò)CLSM獲取多色標(biāo)記樣品的背景結(jié)構(gòu)信息,這樣一方面起到與SRM-FM關(guān)聯(lián)顯微相同的識(shí)別和區(qū)分特定目標(biāo)的作用,另一方面由于CLSM可以提供比普通FM更清晰的不同尺度的圖像,尤其是提供組織、細(xì)胞、亞細(xì)胞等不同層次的結(jié)構(gòu)信息作為分析超分辨結(jié)構(gòu)的背景,從而有助于分析超分辨圖像的生物學(xué)意義.例如,Crossman等[71]報(bào)道了一種用于多尺度組織成像的dSTORM-CLSM關(guān)聯(lián)顯微技術(shù),他們首先對(duì)人心臟組織中含有心肌親聯(lián)蛋白JPH(Alexa 680標(biāo)記)和蘭尼堿體RyR(Alexa 750標(biāo)記)的大分子膜復(fù)合體進(jìn)行超分辨成像(圖6A(c)),接著利用CLSM對(duì)這兩種蛋白以及標(biāo)記了麥胚凝集素WGA(Alexa 594標(biāo)記)的細(xì)胞膜進(jìn)行成像(圖6A(a)和(b)),通過(guò)融合分析兩種方法獲得的圖像,將dSTORM結(jié)果分割到細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)兩種不同區(qū)域進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(圖6A(c),(d)和(e)),從而發(fā)現(xiàn)RyR與JPH在質(zhì)膜上有更高的共定位水平.Barna等[72]采用類(lèi)似的方法對(duì)固定的心臟和腎臟組織切片等進(jìn)行了STORM-CLSM關(guān)聯(lián)顯微成像(圖6B),并詳細(xì)報(bào)道了利用開(kāi)源軟件VividSTORM對(duì)該類(lèi)型關(guān)聯(lián)顯微圖像進(jìn)行分析以獲取特定細(xì)胞或亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)內(nèi)某種分子的含量、密度、間距等定量信息的流程.

4.1.3 超分辨-實(shí)時(shí)熒光關(guān)聯(lián)顯微

雖然目前各種SRM技術(shù)都有不少關(guān)于提高成像速度的報(bào)道,其中甚至不乏幀頻達(dá)到視頻級(jí)別的結(jié)果[46,73],然而在實(shí)際應(yīng)用中多數(shù)SRM技術(shù)要想將獲得單幅超分辨圖像的時(shí)間控制在10 s以?xún)?nèi)仍然是比較困難的,尤其是對(duì)分辨率和圖像質(zhì)量要求較高時(shí),而這對(duì)于活細(xì)胞中的一些動(dòng)態(tài)過(guò)程而言顯然還是太慢.因此將具有高空間分辨能力的SRM和空間分辨率相對(duì)較低但時(shí)間分辨率可以很高的活細(xì)胞實(shí)時(shí)熒光顯微成像(live-cell timelapse fl uorescence microscopy,LTFM)[74]相關(guān)聯(lián),是目前提高SRM時(shí)間分辨能力的一個(gè)有效途徑. Bálint等[75]將用于活細(xì)胞的LTFM與用于固定細(xì)胞的3D-STORM相關(guān)聯(lián),結(jié)合單粒子追蹤(single particle tracking,SPT)技術(shù),通過(guò)追蹤活細(xì)胞中單個(gè)溶酶體的運(yùn)輸路徑并與微管的超分辨結(jié)構(gòu)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析(圖7),研究了溶酶體在微管交接處的行為特征,從而為馬達(dá)蛋白驅(qū)動(dòng)的囊泡運(yùn)輸機(jī)理研究提供了豐富的數(shù)據(jù)和新的視角.這種關(guān)聯(lián)的難點(diǎn)之一是要確保超分辨成像時(shí)固定細(xì)胞的骨架結(jié)構(gòu)與活細(xì)胞成像階段的骨架結(jié)構(gòu)一樣,而該工作的巧妙之處就是在活細(xì)胞成像階段對(duì)細(xì)胞采用藥物處理使細(xì)胞既能保持活性又能使骨架保持基本不變, LTFM成像結(jié)束時(shí)再原位對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定和免疫熒光標(biāo)記等一系列超分辨樣品處理流程并進(jìn)行超分辨成像,為此該研究小組還發(fā)明了一種能夠原位實(shí)現(xiàn)細(xì)胞固定和超分辨標(biāo)記的裝置[76],采用計(jì)算機(jī)控制樣品處理過(guò)程中所需的各種不同試劑的自動(dòng)注入.

圖6 SRM-CLSM關(guān)聯(lián)顯微應(yīng)用實(shí)例：提供多層次背景結(jié)構(gòu)信息[71,72]Fig.6.Correlative SRM-CLSM applications：providing multi-level background structural information[71,72].

圖7 SRM-LTFM關(guān)聯(lián)顯微應(yīng)用實(shí)例：提高時(shí)間分辨能力[75]Fig.7.Correlative SRM-LTFM applications：improving time resolution[75].

4.1.4 超分辨-熒光壽命關(guān)聯(lián)顯微

熒光壽命顯微成像( fl uorescence lifetime imaging microscopy,FLIM)技術(shù)通過(guò)探測(cè)樣品中熒光探針的熒光衰減速率來(lái)反映其與微環(huán)境的相互作用,已被廣泛應(yīng)用于定量檢測(cè)細(xì)胞中的離子濃度、pH值、氧含量、黏滯度、折射率等多種生物化學(xué)或生物物理參數(shù),是一種典型的功能成像技術(shù).而目前多數(shù)SRM技術(shù)主要是針對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行成像,因此SRM-FLIM關(guān)聯(lián)顯微可為SRM技術(shù)提供一個(gè)正交維度,豐富其功能成像信息.例如,Auksorius等[77]報(bào)道的STED-FLIM技術(shù),首次獲得了高于衍射極限分辨率的FLIM圖像.另一方面,利用不同熒光分子熒光壽命的不同,可以區(qū)分光譜性質(zhì)相似的熒光探針,將這一性質(zhì)應(yīng)用于SRM技術(shù)還有助于實(shí)現(xiàn)多色SRM.例如,Hell研究團(tuán)隊(duì)[78]利用STED-FLIM關(guān)聯(lián)實(shí)現(xiàn)了雙色STED技術(shù),他們利用熒光探針ATTO 647N和KK 114分別標(biāo)記了固定細(xì)胞中的微管蛋白和核纖層蛋白并進(jìn)行STED成像,同時(shí)在掃描過(guò)程中利用時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)技術(shù)(time-correlated single-photon counting,TCSPC)對(duì)熒光分子的壽命進(jìn)行測(cè)量,由于兩種熒光分子的吸收光譜和發(fā)射光譜均很相似,系統(tǒng)只需采用一束激發(fā)光和一束STED光,而獲得的熒光強(qiáng)度圖像中兩種分子的熒光信號(hào)將重疊在一起(圖8(a)),但由于兩種分子的熒光壽命明顯不同,因而可利用壽命信息將兩個(gè)通道分開(kāi)(圖8(b)),從而實(shí)現(xiàn)了單激發(fā)波長(zhǎng)的雙色STED.此外,我們團(tuán)隊(duì)還將SMLM與FLIM進(jìn)行關(guān)聯(lián),利用單分子定位算法和反饋控制發(fā)展一種能夠?qū)罴?xì)胞中的運(yùn)動(dòng)目標(biāo)進(jìn)行熒光壽命追蹤的方法[79],進(jìn)一步與SMLM獲取的超分辨結(jié)構(gòu)結(jié)合將有助于揭示細(xì)胞中微環(huán)境變化或相互作用與超分辨結(jié)構(gòu)間的關(guān)系.

圖8 SRM-FLIM關(guān)聯(lián)顯微應(yīng)用實(shí)例：實(shí)現(xiàn)多色超分辨[78]Fig.8.Correlative SRM-FLIM applications：Realizing multi-color super-resolution[78].

4.2 超分辨成像與光譜測(cè)量技術(shù)的關(guān)聯(lián)

光譜測(cè)量可以提供樣品的化學(xué)成分或分子結(jié)構(gòu)信息.然而多數(shù)光譜測(cè)量技術(shù)是針對(duì)溶液、粉末等樣品的,獲得的往往是樣品中分子的統(tǒng)計(jì)信息,而不包含樣品的空間分布信息,也不能直接對(duì)單個(gè)分子的光譜進(jìn)行測(cè)量.基于光譜測(cè)量的光譜成像技術(shù)雖可利用樣品不同位置的光譜信息進(jìn)行成像,但分辨率一般較低.將SRM技術(shù)與光譜測(cè)量技術(shù)相關(guān)聯(lián),可大幅提高光譜成像技術(shù)的空間分辨率,同時(shí)也為SRM增加額外的信息維度.

4.2.1 超分辨-熒光光譜關(guān)聯(lián)顯微

由于SRM技術(shù)本身就是基于探測(cè)熒光的,因此將其與探測(cè)熒光發(fā)射光譜的熒光光譜測(cè)量技術(shù)( fl uorescence spectrometry,FS)進(jìn)行關(guān)聯(lián)是比較直接的一種關(guān)聯(lián)方式.這種SRM-FS關(guān)聯(lián)顯微一方面便于實(shí)現(xiàn)單分子FS測(cè)量和成像,另一方面還可為SRM技術(shù)提供實(shí)現(xiàn)多色成像的另一個(gè)途徑.Zhang等[80]利用STORM-FS關(guān)聯(lián)同時(shí)實(shí)現(xiàn)了高通量單分子FS測(cè)量和光譜分辨的多色STORM技術(shù).如圖9A所示,他們搭建了一套雙物鏡系統(tǒng)(圖9A(a)),其中一個(gè)物鏡用于獲取單個(gè)熒光分子的位置信息(圖9A(b)),另一個(gè)物鏡采集的單分子熒光信號(hào)經(jīng)過(guò)一個(gè)棱鏡后產(chǎn)生的色散被同時(shí)記錄下來(lái)(圖9A(c)和(d)),這樣單次曝光即可同時(shí)獲得上百個(gè)單分子熒光光譜,并且由于STORM中熒光分子的稀疏激發(fā),這些單分子熒光光譜大多不會(huì)互相重疊,從而實(shí)現(xiàn)了每分鐘106個(gè)的高通量單分子FS測(cè)量.通過(guò)對(duì)STORM圖像中每個(gè)熒光分子的光譜進(jìn)行分析,還可以獲得每個(gè)分子的發(fā)射峰值波長(zhǎng)并據(jù)此賦予相應(yīng)的顏色,從而形成一幅具有“真彩色”的超分辨圖像,實(shí)現(xiàn)光譜分辨的多色STORM技術(shù).如圖9B所示,他們采用了四種發(fā)射中心波長(zhǎng)彼此僅相差10 nm左右的熒光分子對(duì)細(xì)胞中四種不同結(jié)構(gòu)同時(shí)進(jìn)行標(biāo)記,利用這種光譜分辨STORM技術(shù)可以很好地區(qū)分四個(gè)通道,串?dāng)_率小于1%.隨后,Hess研究團(tuán)隊(duì)[81]又報(bào)道了一種基于單物鏡的FPALM-FS關(guān)聯(lián)技術(shù),他們采用分束器將物鏡收集的熒光分為兩部分,分別用于單分子定位和單分子FS測(cè)量,雖然這樣一來(lái)不可避免地減少了各光路中的光子數(shù),但系統(tǒng)設(shè)計(jì)相對(duì)簡(jiǎn)單,且單物鏡系統(tǒng)對(duì)樣品的要求比雙物鏡系統(tǒng)要低很多,更適合細(xì)胞成像.

4.2.2 超分辨-紅外光譜關(guān)聯(lián)顯微

相比FS測(cè)量和FM成像,紅外光譜技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于無(wú)需標(biāo)記,可提供樣品的化學(xué)信息.近年來(lái),同步輻射傅里葉變換紅外(synchrotron radiation-based Fourier transform infrared spectromicroscopy,SR-FTIR)光譜顯微的最新研究進(jìn)展已揭示了細(xì)胞中一些很有價(jià)值的化學(xué)信息[82],然而其空間分辨率僅為5μm左右.Whelan等[83]報(bào)道了將SR-FTIR光譜測(cè)量技術(shù)和SMLM進(jìn)行關(guān)聯(lián)并用于單細(xì)胞研究的工作,他們對(duì)固定前后的細(xì)胞進(jìn)行SR-FTIR光譜分析(圖10(a)—(c)),然后再對(duì)免疫熒光標(biāo)記后的同一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞骨架微管蛋白進(jìn)行超分辨成像(圖10(d)—(k)),通過(guò)對(duì)兩種結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析,觀(guān)察到采用不同固定方法造成的細(xì)胞不同程度的成分和結(jié)構(gòu)變化,從而為優(yōu)化超分辨樣品制備流程提供了一種新的手段.

4.3 超分辨成像與非光學(xué)顯微技術(shù)的關(guān)聯(lián)

由于圖像襯度形成機(jī)理的不同,SRM與EM等非光學(xué)顯微技術(shù)對(duì)樣品制備的要求往往很不相同,甚至有可能互相沖突,這給兩者關(guān)聯(lián)帶來(lái)了極大的挑戰(zhàn),成為實(shí)現(xiàn)這類(lèi)關(guān)聯(lián)必須解決的關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題.近20年來(lái),關(guān)聯(lián)了普通FM與EM的CLEM技術(shù)已取得了豐碩的研究成果[84-86],關(guān)聯(lián)樣品制備技術(shù)也日趨成熟.因此在普通FM基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的SRM技術(shù)與EM的關(guān)聯(lián)相比SRM與其他非光學(xué)顯微技術(shù)的關(guān)聯(lián)具有更堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ),其成果也更豐富.

4.3.1 超分辨-電子關(guān)聯(lián)顯微

圖9 SRM-FS關(guān)聯(lián)顯微應(yīng)用實(shí)例：實(shí)現(xiàn)高通量單分子FS測(cè)量和光譜分辨多色超分辨[80]Fig.9.Correlative SRM-FS applications：Realizing high throughput single molecule FS measurements and spectrally resolved multi-color super-resolution[80].

圖10 SRM-IR關(guān)聯(lián)顯微應(yīng)用實(shí)例：架起結(jié)構(gòu)變化和化學(xué)成分變化之間的橋梁[83]Fig.10.Correlative SRM-IR applications：Bridging between structural changes and chemical composition variations[83].

EM技術(shù)包括掃描電子顯微(scanning electron microscopy,SEM)和透射電子顯微(transmission electron microscopy,TEM)兩類(lèi),前者對(duì)樣品表面成像,分辨率高于10 nm;后者對(duì)超薄切片(約50—100 nm)成像,分辨率可達(dá)亞納米.EM成像過(guò)程需要在真空環(huán)境下進(jìn)行,對(duì)樣品制備有嚴(yán)格要求,對(duì)生物樣品而言通常需要固定、脫水、干燥、包埋、切片等環(huán)節(jié),此外SEM還需要導(dǎo)電處理,TEM一般還需要染色.其中染色是因?yàn)樯飿悠分兄饕獮檩p元素原子,要形成較強(qiáng)的圖像襯度需要利用重金屬對(duì)脂類(lèi)或蛋白質(zhì)進(jìn)行染色,但這種染色并非特異性標(biāo)記,因此EM的分子特異性識(shí)別功能很差.利用聯(lián)接有金納米顆粒的抗體對(duì)樣品進(jìn)行免疫標(biāo)記可提供較好的分子特異性,但目前其應(yīng)用還受到標(biāo)記密度低、可標(biāo)記目標(biāo)分子少等限制.將SRM與EM進(jìn)行關(guān)聯(lián)可彌補(bǔ)EM在分子特異性識(shí)別方面的缺點(diǎn),實(shí)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)互補(bǔ);但EM樣品制備流程中脫水、干燥等環(huán)節(jié)對(duì)于SRM樣品中的熒光探針有著致命的影響,因此SRM和EM不僅不能同時(shí)成像,而且樣品制備和成像流程都必須經(jīng)過(guò)優(yōu)化設(shè)計(jì)才有可能實(shí)現(xiàn)二者的有效關(guān)聯(lián).SRM-EM關(guān)聯(lián)最早在Betzig等[5]提出PALM技術(shù)的同時(shí)就開(kāi)始了,他們采用CLEM中應(yīng)用較多的冷凍切片TEM樣品制備技術(shù),利用PALM-TEM關(guān)聯(lián)結(jié)果的高度相關(guān)性證明了利用PALM技術(shù)直接對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)進(jìn)行超分辨成像的有效性和準(zhǔn)確性(圖11).隨后其他SRM-EM關(guān)聯(lián)技術(shù)也陸續(xù)發(fā)展起來(lái),關(guān)聯(lián)樣品除冷凍切片還有樹(shù)脂包埋切片、非切片等,而針對(duì)不同樣品需要不同的處理和不同的成像流程[87].以SRM-SEM關(guān)聯(lián)為例,L?schberger等[88]利用dSTORM-SEM關(guān)聯(lián)研究了非洲爪蟾卵母細(xì)胞核膜中的核孔復(fù)合物,他們首先對(duì)分離出來(lái)的核膜進(jìn)行常規(guī)的dSTORM樣品制備并進(jìn)行超分辨成像,接著用較高濃度的戊二醛進(jìn)行后固定并依次進(jìn)行四氧化鋨固定、丙酮脫水、臨界點(diǎn)干燥等處理,最后覆蓋一層碳以提高樣品導(dǎo)電性用于SEM成像.通過(guò)分析dSTORM-SEM關(guān)聯(lián)結(jié)果,他們發(fā)現(xiàn)大多數(shù)NPC由8個(gè)核膜糖蛋白gp210的同源二聚體(圖12(e)—(h))組成(少數(shù)含有9個(gè)).最近,Wojcik等[89]提出了利用石墨烯直接對(duì)濕樣品進(jìn)行STORM-SEM關(guān)聯(lián)顯微的新方法.厚度極薄(單原子層)的石墨烯膜具有可穿透光和電子、可完全隔絕氣體和液體、可導(dǎo)電和不易發(fā)生化學(xué)反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn),因此在細(xì)胞樣品表面覆蓋一層石墨烯膜則無(wú)需對(duì)細(xì)胞進(jìn)行后固定、脫水、干燥、鍍導(dǎo)電膜等處理,不僅大幅簡(jiǎn)化了樣品制備流程,而且降低了對(duì)細(xì)胞固定和熒光標(biāo)記的要求,將使SRM-EM的發(fā)展前景更加光明.

圖11 SRM-TEM關(guān)聯(lián)顯微應(yīng)用實(shí)例：驗(yàn)證超分辨成像結(jié)果[5]Fig.11.Correlative SRM-TEM applications：Validating super-resolution imaging results[5].

圖12 SRM-SEM關(guān)聯(lián)顯微應(yīng)用實(shí)例：實(shí)現(xiàn)分子特異性超分辨[88]Fig.12.Correlative SRM-SEM applications：Realizing molecular speci fi city in super-resolution imaging[88].

4.3.2 超分辨-原子力關(guān)聯(lián)顯微

原子力顯微(atomic force microscopy,AFM)作為另一種常用的表面成像技術(shù),廣泛用于納米技術(shù)和材料領(lǐng)域,通過(guò)測(cè)量探針與樣品表面的相互作用實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品表面形貌的三維成像,橫向分辨率為10 nm左右,縱向分辨率可達(dá)亞納米量級(jí).此外,利用AFM還可以進(jìn)行作用力和彈性模量等力學(xué)參數(shù)的測(cè)量;換上專(zhuān)用的金屬涂層光纖探針則可實(shí)現(xiàn)近場(chǎng)掃描光學(xué)顯微(near- field scanning optical microscopy,NSOM)功能,即早期 Betzig和Trautman[90]提出的近場(chǎng)超分辨技術(shù).由于AFM成像無(wú)需真空環(huán)境,對(duì)樣品制備要求不高,因此近幾年也越來(lái)越多地被用于生物樣品成像,甚至可對(duì)活細(xì)胞或組織直接進(jìn)行成像[91,92].因此SRMAFM關(guān)聯(lián)相比SRM-EM要簡(jiǎn)單得多.例如,Harke等[93]利用可安裝在倒置顯微鏡上的AFM掃描裝置實(shí)現(xiàn)了STED-AFM關(guān)聯(lián),并通過(guò)熒光珠進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證.此后這種關(guān)聯(lián)方式也被廣泛應(yīng)用于其他SRM與AFM的關(guān)聯(lián)[94,95].不過(guò),由于SRM采用的油浸物鏡會(huì)受到AFM懸臂振動(dòng)的影響,且兩者采用的激光會(huì)彼此干擾,所以即使是集成于一套系統(tǒng),這兩種技術(shù)通常還是通過(guò)先后成像來(lái)實(shí)現(xiàn)關(guān)聯(lián)的,但這種設(shè)計(jì)由于可確保方便地對(duì)樣品中的同一個(gè)感興趣區(qū)域進(jìn)行成像,大幅降低了關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)采集和分析的難度,為兩者關(guān)聯(lián)提供了便利條件.SRM-AFM關(guān)聯(lián)最重要的作用是可以從樣品表面和內(nèi)部?jī)煞矫嫣峁┨囟繕?biāo)的多重信息.例如, Odermatt等[94]將PALM-AFM關(guān)聯(lián)應(yīng)用于活細(xì)胞成像,先利用AFM監(jiān)測(cè)活細(xì)胞前緣形貌隨時(shí)間的變化(圖13(b)),再利用PALM對(duì)同一部位進(jìn)行超分辨成像,利用細(xì)胞中聯(lián)接有光激活蛋白mEos2的樁蛋白實(shí)時(shí)成像結(jié)果(圖13(c)—(g))在納米尺度顯示了細(xì)胞移動(dòng)過(guò)程中其前緣黏著斑的動(dòng)態(tài)變化.與SRM-EM關(guān)聯(lián)類(lèi)似,SRM-AFM關(guān)聯(lián)也可用于對(duì)超分辨結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,例如Monserrate等[96]利用SMLM-AFM關(guān)聯(lián)對(duì)熒光標(biāo)記的離體λDNA進(jìn)行成像,通過(guò)對(duì)比SMLM和AFM的成像結(jié)果,發(fā)現(xiàn)AFM圖像中連續(xù)的結(jié)構(gòu)在超分辨圖像中存在間隙,從而反映超分辨樣品標(biāo)記和圖像重構(gòu)過(guò)程可能導(dǎo)致的偽影.此外,SRM-AFM關(guān)聯(lián)還有另一種功能,即利用AFM對(duì)樣品進(jìn)行納米操作并利用SRM技術(shù)進(jìn)行成像甚至為納米操作提供反饋信息[97].

圖13 SRM-AFM關(guān)聯(lián)顯微應(yīng)用實(shí)例：提供內(nèi)外結(jié)構(gòu)信息[94]Fig.13.Correlative SRM-AFM applications：Providing both internal and external structural information[94].

4.3.3 超分辨-質(zhì)譜關(guān)聯(lián)顯微

圖14 SRM-SIMS關(guān)聯(lián)顯微應(yīng)用實(shí)例：提供新的信息維度[99]Fig.14.Correlative SRM-SIMS applications：Providing additional information dimension[99].

質(zhì)譜在同位素、原子團(tuán)簇和分子的鑒別方面一直以來(lái)都扮演著非常重要的角色,而近幾年利用二次離子質(zhì)譜進(jìn)行成像的二次離子質(zhì)譜技術(shù)(secondary ion mass spectrometry,SIMS)則為生物樣品的化學(xué)分析提供了一種新的方法,目前空間分辨率已達(dá)100 nm左右,與SRM技術(shù)基本相當(dāng)[98].SIMS成像也需要在真空環(huán)境進(jìn)行,因此SRM-SIMS關(guān)聯(lián)面臨著與SRM-EM關(guān)聯(lián)同樣的問(wèn)題,即只有解決關(guān)聯(lián)樣品的制備問(wèn)題才能實(shí)現(xiàn)有效的關(guān)聯(lián).例如,Saka等[99]利用STED-SIMS關(guān)聯(lián)研究了體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元中的蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn),他們將含有同位素15N的標(biāo)記物添加在神經(jīng)元的培養(yǎng)液中,利用其代謝狀態(tài)作為后期蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)速率的量化表征,接著他們對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定、免疫熒光標(biāo)記、脫水、樹(shù)脂包埋、切片等處理,并對(duì)處理后的樣品先后進(jìn)行CLSM,STED和SIMS成像,通過(guò)分析CLSM和STED獲得的細(xì)胞結(jié)構(gòu)圖像(圖14(a))和SIMS獲得的15N/14N密度比分布(圖14(b))在超分辨細(xì)胞結(jié)構(gòu)背景下對(duì)比了不同細(xì)胞器中蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)速率的不同(圖14(c)).

5 總結(jié)和展望

光學(xué)顯微成像由于系統(tǒng)孔徑的衍射存在著分辨率極限,而近十幾年來(lái)迅速發(fā)展的SRM技術(shù)采用各種巧妙的辦法卻可以“繞過(guò)”該限制獲得遠(yuǎn)高于衍射極限分辨率的超分辨圖像.其中,STORM, PALM等技術(shù)針對(duì)寬場(chǎng)成像系統(tǒng)進(jìn)行空域處理,通過(guò)衍射極限范圍內(nèi)熒光分子先后發(fā)光和分時(shí)探測(cè),實(shí)現(xiàn)單分子定位并重構(gòu)超分辨圖像;STED, RESOLFT等技術(shù)針對(duì)掃描成像系統(tǒng)進(jìn)行空域處理,通過(guò)抑制激發(fā)斑中心點(diǎn)以外熒光分子發(fā)光,避免了激發(fā)斑尺寸對(duì)分辨率的影響而獲得超分辨圖像;SIM,SSIM等技術(shù)則從頻域角度進(jìn)行處理,利用摩爾條紋將樣品的高頻信息平移到系統(tǒng)OTF的截止頻率范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)超分辨成像.

SRM技術(shù)將熒光顯微成像的分辨率提高了近一個(gè)數(shù)量級(jí),其取得的巨大發(fā)展為生物醫(yī)學(xué)研究提供了強(qiáng)有力的工具;然而作為一種新興技術(shù),SRM技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究時(shí)仍面臨著許多亟待解決的問(wèn)題,尤其是當(dāng)研究對(duì)象是活的、具有一定厚度的、成分和結(jié)構(gòu)復(fù)雜的細(xì)胞、組織等生物樣品時(shí).因此,除了進(jìn)一步提高分辨率,如何實(shí)現(xiàn)SRM的多色成像、厚樣品三維成像、活細(xì)胞快速成像等也是目前SRM領(lǐng)域的研究重點(diǎn),這些問(wèn)題的研究和解決將使SRM技術(shù)未來(lái)有可能為生物醫(yī)學(xué)研究提供更有意義的活細(xì)胞實(shí)時(shí)超分辨圖像和數(shù)據(jù).

在SRM技術(shù)尚未十分完善的今天,將SRM與其他技術(shù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)的超分辨關(guān)聯(lián)顯微是實(shí)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)的最佳途徑,成為近年來(lái)SRM的一個(gè)重要發(fā)展趨勢(shì).SRM技術(shù)與FM,CLSM,LTFM,FLIM等衍射受限光學(xué)顯微技術(shù)的關(guān)聯(lián)可彌補(bǔ)SRM目前的一些弱點(diǎn),起到識(shí)別和區(qū)分特定目標(biāo)、提供多層次背景結(jié)構(gòu)信息、提高時(shí)間分辨能力、豐富功能成像信息、實(shí)現(xiàn)多色超分辨等作用,最大程度地發(fā)揮SRM在分辨率方面的優(yōu)勢(shì);SRM與FS,SR-FTIR等光譜測(cè)量和成像技術(shù)的關(guān)聯(lián)可大幅提高光譜成像技術(shù)的空間分辨率,同時(shí)為SRM增加額外的信息維度;SRM與EM,AFM,SIMS等非光學(xué)顯微技術(shù)的關(guān)聯(lián),一方面能為同一個(gè)生物學(xué)問(wèn)題提供不同尺度、不同維度或不同角度的信息互相印證,使研究更加深入,另一方面還能為驗(yàn)證SRM結(jié)果的正確性提供直接的證據(jù).

然而,由于成像原理的不同,進(jìn)行關(guān)聯(lián)的兩種顯微成像技術(shù)對(duì)成像環(huán)境和樣品制備的要求有可能大相徑庭,尤其是SRM與EM等非光學(xué)顯微技術(shù)的關(guān)聯(lián),盡管目前已經(jīng)發(fā)展了許多關(guān)聯(lián)樣品制備方法和關(guān)聯(lián)顯微成像流程,但這一類(lèi)關(guān)聯(lián)顯微的實(shí)際應(yīng)用到目前為止仍然難度較大.同時(shí),對(duì)于分辨率同樣達(dá)到幾十納米甚至更高水平的兩種或多種技術(shù)之間的關(guān)聯(lián),圖像的對(duì)準(zhǔn)和融合要求也非常高,因?yàn)椴煌椒ǐ@得的圖像之間對(duì)準(zhǔn)的精度必須控制在10 nm以?xún)?nèi),否則由于沒(méi)有精確對(duì)準(zhǔn)而造成的偽影或分辨率降低等問(wèn)題也會(huì)大幅削弱關(guān)聯(lián)顯微的意義.因此,只有深入地研究和解決這些問(wèn)題,才能實(shí)現(xiàn)真正有效的超分辨關(guān)聯(lián)顯微并應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究.

需要補(bǔ)充的是,除了SRM技術(shù)與其他技術(shù)的關(guān)聯(lián),目前不同的SRM技術(shù)之間也在嘗試進(jìn)行關(guān)聯(lián)顯微,如SIM-SMLM等[100,101].而所有關(guān)聯(lián)顯微研究的目的都只有一個(gè),即更好地發(fā)揮這些先進(jìn)技術(shù)的優(yōu)勢(shì),通過(guò)優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域提供更好的研究方法和手段.相信隨著各種技術(shù)自身的進(jìn)步,以及關(guān)聯(lián)所涉及的樣品制備、圖像處理等相關(guān)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展完善,超分辨成像技術(shù)和超分辨關(guān)聯(lián)顯微技術(shù)將為生物醫(yī)學(xué)研究提供越來(lái)越多的更有意義的數(shù)據(jù),幫助人們更深入、更全面地理解生命和疾病,為科學(xué)技術(shù)和人類(lèi)社會(huì)的發(fā)展提供幫助.

感謝深圳大學(xué)于斌教授關(guān)于衍射極限分辨率的討論,感謝美國(guó)華盛頓大學(xué)化學(xué)系Joshua C.Vaughan教授和研究生Marco Howard,Lauren Gagnon關(guān)于各種超分辨成像技術(shù)的討論.

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PACS:87.64.M—,42.40.Lx,42.30.Va,42.25.—p DOI:10.7498/aps.66.148703

Recent progress on super-resolution imaging and correlative super-resolution microscopy?

Lin Dan-Ying Qu Jun-Le?
(Key Laboratory of Optoelectronic Devices and Systems of Ministry of Education and Guangdong Province,College of Optoelectronic Engineering,Shenzhen University,Shenzhen 518060,China)

19 April 2017;revised manuscript

21 June 2017)

The di ff raction of the fi nite aperture in the optical imaging system restricts further improvement of the resolution of optical microscopy,which is called the“di ff raction limit”.Since raised by Ernst Abbe in 1873,the problem of di ff raction limit has been one of the foci of academic research.In recent years,with the rapid development of related f i elds such as the development of optoelectronic devices including high energy lasers and high sensitivity detectors and the development of new fl uorescent probes,the problem of di ff raction limit in optical microscopy ushered in a new opportunity,and super-resolution microscopy(SRM)has made remarkable achievements in the past decade.The basic principles of di ff raction limited resolution in both space and frequency domains are reviewed,and on this basis, the mechanisms for the various SRM technologies to circumvent the di ff raction limit and improve the resolution are explained in detail.The development trends and research directions of various SRM techniques are also introduced. As a new and important development trend of SRM,correlative super-resolution microscopy and its recent progress are reviewed,including correlative studies on SRM and time-lapse live cell fl uorescence microscopy, fl uorescence lifetime imaging microscopy,spectrometry and spectroscopy,electron microscopy,atomic force microscopy,etc.The role and signi fi cance of various correlative super-resolution microscopy are discussed.The future development of super-resolution microscopy and correlative super-resolution microscopy is also prospected.

di ff raction limit,super-resolution imaging,correlative microscopy,correlative superresolution microscopy

:87.64.M—,42.40.Lx,42.30.Va,42.25.—p

10.7498/aps.66.148703

?國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(批準(zhǔn)號(hào)：2015CB352005)、國(guó)家自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號(hào)：61525503,61378091,61620106016)和廣東省自然科學(xué)基金創(chuàng)新研究團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(批準(zhǔn)號(hào)：2014A030312008)資助的課題.

?通信作者.E-mail：jlqu@szu.edu.cn

?2017中國(guó)物理學(xué)會(huì)Chinese Physical Society

http://wulixb.iphy.ac.cn

*Project supported by the National Basic Research Program of China(Grant No.2015CB352005),the National Natural Science Foundation of China(Grant Nos.61525503,61378091,61620106016),and the Natural Science Foundation of Guangdong Province for Innovation Research Team,China(Grant No.2014A030312008).

?Corresponding author.E-mail：jlqu@szu.edu.cn