吳 丹 陽， 錢 方， 牟 光 慶

( 大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

酶-超聲法提取藍(lán)莓花青素

吳 丹 陽， 錢 方， 牟 光 慶

( 大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

用酶-超聲波輔助法提取藍(lán)莓花青素，得到最優(yōu)提取條件為藍(lán)莓粉與水按質(zhì)量比1∶40混合，體系pH 1.0，超聲功率200 W，纖維素酶用量3.0 mg/g，溫度45 ℃，反應(yīng)時(shí)間20 min。比較了AB-8、H103、D001×7和D201×1 4種大孔樹脂和乙醇、丙酮和乙酸乙酯3種洗脫液對(duì)藍(lán)莓花青素的吸附與解吸效果。結(jié)果表明，AB-8型大孔樹脂的分離效果最好，在pH 3.0、30 ℃條件下吸附180 min，70%乙醇解吸90 min，藍(lán)莓花青素色價(jià)由12.7提高到67.8，提高了5.3倍。

藍(lán)莓；花青素；酶-超聲法

0 引 言

藍(lán)莓花青素屬類黃酮類物質(zhì)，主要集中在果皮中，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.00～6.98 mg/g，因藍(lán)莓品種不同而存在差異[1]。具有抗炎癥、提高免疫力、抗心血管疾病、抗衰老、抗癌等生理功效[2]。

目前，花青素的提取方法主要包括溶劑萃取法、超臨界流體萃取法、微波法、超聲波輔助提取法和酶法[3]。其中，溶劑萃取法最常用，簡(jiǎn)單易行，但能耗較大；超臨界流體萃取法主要適于脂溶性色素提取，藍(lán)莓花青素為水溶性，此法并不適用[4]；微波法選擇性強(qiáng)，能耗小，但加熱溫度高，易破壞花青素結(jié)構(gòu)[5]。超聲波輔助提取法通過超聲波空化等效應(yīng)加速花青素的溶出，提取周期短，效率高[6]；酶法提取可較溫和的將細(xì)胞壁分解，提高提取率[7]。張學(xué)寧等[8]比較了水浴法、超聲波法和微波法提取藍(lán)莓花色苷，并確定最佳工藝條件。本研究擬將對(duì)花青素影響較小的酶法和超聲波輔助提取法相結(jié)合提取藍(lán)莓花青素，并用樹脂進(jìn)一步分離，確定其最優(yōu)條件，以提高花青素產(chǎn)率。

1 材料與方法

1.1 材 料

藍(lán)莓，購自莊河市大營(yíng)鎮(zhèn)大連藍(lán)莓基地，-18 ℃ 冷凍保存。

纖維素酶，1 800 U/mg，上海源葉生物科技有限公司；大孔樹脂AB-8、H103、D001×7、D201×1，上海華羚樹脂有限公司。

1.2 藍(lán)莓花青素的制備工藝

原料預(yù)處理→藍(lán)莓粉→酶-超聲法輔助提取→離心除雜→樹脂分離→干燥→藍(lán)莓花青素[6,8]。

1.2.1 原料預(yù)處理

藍(lán)莓凍果在室溫下解凍，清洗后在勻漿機(jī)中勻漿，倒盤后放入鼓風(fēng)干燥箱中，55 ℃干燥15 h。將干燥后的藍(lán)莓用中藥粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，過80目篩，制成藍(lán)莓干粉，避光保存[5]。

1.2.2 酶-超聲波輔助法提取藍(lán)莓花青素

藍(lán)莓粉以水提取，加入1%纖維素酶液，分別在不同料液比、酶用量、pH、超聲功率、溫度、時(shí)間條件下進(jìn)行提取。4 000 r/min離心10 min，上清液即為藍(lán)莓花青素粗提液。測(cè)定A530優(yōu)化藍(lán)莓花青素提取的工藝條件[9-10]。

1.2.3 藍(lán)莓花青素的分離

采用樹脂靜態(tài)吸附法分離藍(lán)莓花青素[11-12]。將藍(lán)莓花青素粗提液適當(dāng)稀釋測(cè)定A0。取25 mL 花青素稀釋液加入裝有1.0 g樹脂的三角瓶中，150 r/min振蕩一段時(shí)間后抽濾，測(cè)定濾液吸光度，收集濾后樹脂于三角瓶中，加入25 mL洗脫液，150 r/min振蕩解吸后抽濾，測(cè)定濾液吸光度，濾液即為純化后的藍(lán)莓花青素[13-14]。吸附率和解吸率按下式計(jì)算[15]：

吸附率=(A0-A1)/A0×100%

解吸率=A2/(A0-A1)×100%

式中：A0為粗提液的吸光度，A1為吸附后溶液的吸光度，A2為解吸后溶液的吸光度。

1.2.4 藍(lán)莓花青素的測(cè)定

分別將藍(lán)莓花青素粗提液和純化后的藍(lán)莓花青素冷凍干燥制成花青素粉。取花青素粉0.100 g，用pH 3.0 HCl定容至100 mL，適當(dāng)稀釋后，用1 cm比色皿在530 nm處測(cè)定其吸光度，計(jì)算花青素含量。記粗提花青素的色價(jià)為E0，純化后花青素色價(jià)為E1。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)莓花青素提取條件的優(yōu)化

2.1.1 酶用量對(duì)藍(lán)莓花青素提取的影響

由圖1可知，纖維素酶用量在0～3.0 mg/g時(shí)，花青素提取量隨著酶量的增加而增大，3.0 mg/g 時(shí)達(dá)到最大，為0.420。增大酶用量，提取量不會(huì)增加，反而略有降低。因此，纖維素酶最佳用量為3.0 mg/g。

圖1 酶用量對(duì)藍(lán)莓花青素提取的影響(P<0.05)

2.1.2 pH對(duì)藍(lán)莓花青素提取的影響

pH對(duì)花青素的色調(diào)影響較大。水溶液中，花青素以黃洋鹽陽離子(AH+)、醌式堿(A)、甲醇假堿和查爾酮4種形式存在。這4種結(jié)構(gòu)可以相互轉(zhuǎn)換，pH<2時(shí)，花青素以AH+(紅色)形式存在，隨著堿性增強(qiáng)，AH+轉(zhuǎn)變成A(藍(lán)色)。pH逐漸升高至4～5，兩種有色物質(zhì)濃度降低，無色甲醇假堿濃度升高而緩慢生成無色查爾酮，導(dǎo)致吸光度下降[10]。由圖2可知，花青素提取量在pH 1.0時(shí)最大，A530達(dá)到了1.151，因此，最佳提取pH為1.0。

圖2 pH對(duì)藍(lán)莓花青素提取的影響(P<0.05)

2.1.3 料液比對(duì)藍(lán)莓花青素提取的影響

由圖3可知，料液比在1∶30～1∶40，花青素的提取量隨料液比增大而增加，1∶40時(shí)最大，A530為1.638。料液比再增加，提取量反而減少。因此，最佳料液比應(yīng)為1∶40。

圖3 料液比對(duì)藍(lán)莓花青素提取的影響(P<0.05)

2.1.4 超聲功率對(duì)藍(lán)莓花青素提取的影響

由圖4可知，功率為0～120 W時(shí)，花青素提取量差異并不顯著。隨著功率增大，花青素提取量逐漸增加，200 W時(shí)最大。增大功率，花青素提取量明顯增大?？紤]到過高的超聲功率會(huì)破壞花青素結(jié)構(gòu)，將最佳提取功率設(shè)定為200 W。

圖4 超聲功率對(duì)藍(lán)莓花青素提取的影響(P<0.05)

2.1.5 溫度對(duì)藍(lán)莓花青素提取的影響

由圖5可知，溫度對(duì)花青素提取量的影響差異較顯著，隨溫度的升高呈先增大后減小的趨勢(shì)，45 ℃時(shí)達(dá)到最大值，A530為1.492，表明纖維素酶活性隨著溫度升高而逐漸增大，并在45 ℃時(shí)花青素的提取量最大。升溫會(huì)使平衡向生成無色查爾酮方向移動(dòng)，而有色物質(zhì)的含量降低[11]。因此，最佳提取溫度應(yīng)選為45 ℃。與文獻(xiàn)[8]中從藍(lán)莓果中提取花青素的溫度基本一致。

圖5 溫度對(duì)藍(lán)莓花青素提取的影響(P<0.05)

2.1.6 提取時(shí)間對(duì)藍(lán)莓花青素提取的影響

由圖6可以看出，提取量隨時(shí)間變化并不顯著。延長(zhǎng)時(shí)間提取量略有降低，可能是過長(zhǎng)時(shí)間會(huì)導(dǎo)致花青素氧化分解[10]，而且時(shí)間長(zhǎng)也會(huì)增加能源消耗。因此，最佳提取時(shí)間為20 min。

圖6 提取時(shí)間對(duì)藍(lán)莓花青素提取的影響(P<0.05)

2.2 藍(lán)莓花青素分離純化條件的優(yōu)化

2.2.1 樹脂的選擇

通過吸附4 h、解吸2 h來觀察不同樹脂的吸附與解吸效果。由圖7可知，不同類型樹脂對(duì)藍(lán)莓花青素分離效果影響顯著。AB-8的吸附與解吸效果最好。這是因?yàn)樗{(lán)莓花青素屬弱極性化合物，吸附藍(lán)莓花青素的最佳樹脂應(yīng)為弱極性或非極性。從解吸效果來看，雖然D201和D001對(duì)藍(lán)莓花青素有一定的吸附作用，但解吸效果并不好，可能是D201和D001的極性很大，與色素物質(zhì)共價(jià)鍵結(jié)合能力太強(qiáng)，導(dǎo)致色素?zé)o法洗脫下來。因此選擇AB-8為吸附樹脂。

2.2.2 pH對(duì)AB-8樹脂吸附效果的影響

由圖8可知，隨著pH的增大，AB-8樹脂對(duì)色素的吸附率逐漸下降。但pH在1.0～3.0時(shí)吸附率的差異不顯著，考慮到實(shí)驗(yàn)操作性，選擇pH為3.0。

圖7 樹脂類型對(duì)藍(lán)莓花青素吸附率和解吸率的影響(P<0.05)

Fig.7 Effect of resin type on blueberry anthocyanins in adsorption and desorption (P<0.05)

圖8 pH對(duì)AB-8樹脂吸附效果的影響(P<0.05)

2.2.3 溫度對(duì)AB-8樹脂吸附效果的影響

由圖9可知，溫度對(duì)AB-8樹脂吸附效果影響不顯著。溫度過高有利于平衡向生成無色查爾酮方向移動(dòng)，色素分解[10]。考慮到實(shí)驗(yàn)操作性，樹脂吸附溫度30 ℃較為合適。

圖9 溫度對(duì)AB-8樹脂吸附效果的影響(P<0.05)

2.2.4 吸附時(shí)間對(duì)AB-8樹脂吸附效果的影響

由圖10可知，吸附時(shí)間在180 min后，吸附率的變化差異不顯著。隨著吸附時(shí)間的延長(zhǎng)，樹脂吸附逐漸達(dá)到飽和，但再延長(zhǎng)時(shí)間，吸附效果不會(huì)增強(qiáng)，甚至?xí)霈F(xiàn)解吸附現(xiàn)象。為使樹脂飽和吸附且防止時(shí)間過長(zhǎng)出現(xiàn)解吸附現(xiàn)象，選擇吸附時(shí)間為180 min。

圖10 吸附時(shí)間對(duì)AB-8樹脂吸附效果的影響(P<0.05)

Fig.10 Effect of adsorption time on resin AB-8 adsorption (P<0.05)

2.2.5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)樹脂解吸效果的影響

由圖11可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)花青素洗脫效果影響顯著。考慮到乙醇體積分?jǐn)?shù)過大可能造成藍(lán)莓花青素結(jié)構(gòu)的破壞，確定乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

圖11 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)AB-8樹脂解吸效果的影響(P<0.05)

Fig.11 Effect of ethanol concentration on resin AB-8 desorption (P<0.05)

2.2.6 解吸時(shí)間對(duì)樹脂解吸效果的影響

由圖12可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，樹脂的解吸程度逐漸增大，在90 min時(shí)，解吸率最大，隨后逐漸降低?？赡苁墙馕鼤r(shí)間過長(zhǎng)，色素出現(xiàn)了重新吸附現(xiàn)象。因此，解吸時(shí)間選為90 min。

3 結(jié) 論

用酶-超聲波輔助提取藍(lán)莓花青素，確定最佳工藝條件為：藍(lán)莓粉與水按質(zhì)量比1∶40混合，體系pH 1.0，超聲功率200 W，纖維素酶用量3.0 mg/g，溫度45 ℃，提取時(shí)間20 min。

圖12 解吸時(shí)間對(duì)AB-8樹脂解吸效果的影響(P<0.05)

Fig.12 Effect of desorption time on resin AB-8 desorption (P<0.05)

藍(lán)莓花青素粗提物選用AB-8型樹脂在pH 3.0、30 ℃條件下吸附180 min，再用70%乙醇解吸90 min。粗提花青素色價(jià)E0為12.7，純化后花青素色價(jià)E1為67.8，與文獻(xiàn)[11]中報(bào)道的色價(jià)相一致，提取倍數(shù)為5.3。

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Extraction of blueberry anthocyanins by enzyme-ultrasonic method

WU Danyang, QIAN Fang, MU Guangqing

( School of Food Science and Technology, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China )

Enzyme-ultrasonic assisted extraction method was used to extract blueberry anthocyanins. The optimum extraction conditions were as follow: the mass ratio of blueberry powder and water of 1∶40, system pH 1.0, ultrasonic power 200 W, cellulase enzyme dosage 3.0 mg/g, temperature 45 ℃, reaction time 20 min. The effect of four macroporous resins of AB-8、H103、D001×7、D201×1 on blueberry anthocyanins adsorption and three eluents of ethanol, acetone, acetic ester on the blueberry anthocyanins desorption were compared respectively. The results showed that the best macroporous resin for purifying blueberry anthocyanins was AB-8, and its optimal separation condition was pH 3.0 adsorbed at 30 ℃ for 180 min and then 70% ethanol desorbed for 90 min. The color value of blueberry anthocyanin increased from 12.7 to 67.8, and the extraction times increased of 5.3.

blueberry; anthocyanin; enzyme-ultrasonic method

2015-12-24.

遼寧省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014026018).

吳丹陽(1990-)，女，碩士研究生;通信作者：錢 方(1966-)，女，教授.

TS202.3

A

1674-1404(2017)04-0260-05

吳丹陽,錢方,牟光慶.酶-超聲法提取藍(lán)莓花青素[J].大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2017,36(4):260-264.

WU Danyang, QIAN Fang, MU Guangqing. Extraction of blueberry anthocyanins by enzyme-ultrasonic method[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2017, 36(4): 260-264.