魯豫，田小軍，史莉瑾，蘇洲，郭雙喜，王玉梅

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MiR-137在缺血性卒中后抑郁患者外周血中的表達(dá)及其臨床意義

魯豫，田小軍，史莉瑾，蘇洲，郭雙喜，王玉梅

目的 探討缺血性卒中后抑郁患者miR-137的變化及臨床意義。方法 采用中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南 2014急性腦梗死診斷標(biāo)準(zhǔn)、漢密爾頓抑郁量表(HAMD-24項(xiàng))、精神障礙診斷及統(tǒng)計(jì)手冊(cè)第五版(DSM-5)將研究對(duì)象分為正常對(duì)照組、抑郁癥組各20例，并發(fā)抑郁組、未并發(fā)抑郁組各37例。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法(qRT-PCR)檢測(cè)各組microRNA(miRNA)-137的表達(dá)水平，并對(duì)相關(guān)結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果四組樣本的性別、年齡、合并高血壓病、合并糖尿病、合并心臟病、NIHSS評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。與未并發(fā)抑郁組相比,并發(fā)抑郁組左側(cè)腦梗死例數(shù)明顯增高(P<0.05)。與正常對(duì)照組相比,未并發(fā)抑郁組、并發(fā)抑郁組miR-137水平明顯降低(均P<0.05)；與未并發(fā)抑郁組相比，并發(fā)抑郁組miR-137水平明顯降低(P<0.05)；并發(fā)抑郁組、抑郁癥組miR-137水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 缺血性腦卒中會(huì)引起miR-137表達(dá)水平的下降，并且miR-137表達(dá)水平的下降參與缺血性卒中后抑郁的形成。miR-137可以作為缺血性卒中后抑郁的預(yù)測(cè)、診斷及治療指標(biāo)。

腦卒中；卒中后抑郁；miR-137

卒中后抑郁(PSD)是腦卒中后最常見的心理行為障礙并發(fā)癥，主要表現(xiàn)為認(rèn)知功能障礙、情緒低落或興趣的缺失[1]，對(duì)腦卒中患者神經(jīng)功能的康復(fù)具有明顯的負(fù)面影響。腦卒中后1個(gè)月內(nèi)其發(fā)病率為17%～52%[2]，而作為占全部腦卒中約60%～80%的缺血性腦卒中，其PSD的發(fā)病率更高。原發(fā)性抑郁癥的治療主要包括單胺氧化酶抑制劑、三環(huán)類抗抑郁藥、選擇性5-羥色胺再攝入抑制劑、選擇性去甲腎上腺素再攝取抑制劑。而單胺氧化酶抑制劑、三環(huán)類抗抑郁藥由于其毒副作用大、不良反應(yīng)多，治療劑量與中毒劑量相近，目前已較少使用。選擇性5-羥色胺再攝入抑制劑、選擇性去甲腎上腺素再攝取抑制劑的可選擇性也較少。因此針對(duì)PSD發(fā)病機(jī)制的新型抗抑郁藥的出現(xiàn)就顯得尤為迫切。microRNA(miR)是一類長(zhǎng)約19～22個(gè)核苷酸的單鏈小分子非編碼RNA，通過(guò)在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)來(lái)參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化。近年來(lái)大量研究[3-5]表明miRs在神經(jīng)元的生成、突觸可塑性及腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子生成等方面均扮演者重要角色，并參與抑郁癥的形成。PSD作為一種特殊類型的抑郁癥，其發(fā)病是否也與miRs相關(guān)呢?查閱相關(guān)文獻(xiàn)[6-12]，發(fā)現(xiàn)BLC2、SLC6、CREB1、Grin2A基因參與PSD形成，進(jìn)一步通過(guò)miRBASE、miRDB、TARGETSCAN-VERT等軟件進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)上述基因均是miR-137潛在靶基因，受miR-137的調(diào)控。因此本研究選擇miR-137作為缺血性PSD的臨床研究方向以探討缺血性PSD患者miR-137的變化，為進(jìn)一步研究miR-137在缺血性PSD中的作用提供基礎(chǔ)理論，并發(fā)現(xiàn)新的缺血性PSD的預(yù)測(cè)、診斷及治療指標(biāo)。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 以2016年1月～2016年6月新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院確診的首次急性缺血性腦卒中住院患者為研究對(duì)象，于確診14 d后根據(jù)漢密爾頓抑郁量表(HAMD-24項(xiàng))評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)將其分為并發(fā)抑郁組(≥ 20 分)和未并發(fā)抑郁組(<8分)。選取同期新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院確診的抑郁癥住院患者(既往無(wú)腦梗死病史)20例為抑郁癥組及新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院健康體檢者(既往無(wú)腦梗死、抑郁癥病史)為正常對(duì)照組。各組具體情況:(1)并發(fā)抑郁組：37例，男24例，女13例；年齡35～75歲，平均60.58歲。(2)未并發(fā)抑郁組：37例，男24例，女13例;年齡45～76歲，平均60.44歲。(3)抑郁癥組:20例，男13例，女7例;年齡41～75歲，平均60.50歲。(4)正常對(duì)照組：20名，男13名，女7名;年齡37～78歲，平均62.79歲。并發(fā)抑郁組及未并發(fā)抑郁組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)首次急性缺血性腦卒中的診斷均符合中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南 2014 診斷標(biāo)準(zhǔn)[13]，并經(jīng)頭顱 MRI-DWI 檢查證實(shí)，且NIHSS評(píng)分<16分；(2)抑郁癥的診斷均符合精神障礙診斷及統(tǒng)計(jì)手冊(cè)第五版(DSM-5)的規(guī)定[14]，且HAMD 評(píng)分≥ 20 分。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)NIHSS評(píng)分>16分，即神經(jīng)系統(tǒng)功能嚴(yán)重缺損導(dǎo)致意識(shí)障礙、聽力障礙、失語(yǔ)等無(wú)法配合檢查者；(2)合并對(duì)機(jī)體精神狀態(tài)可能產(chǎn)生消極影響的癲癇、Alzheimer’s病、自身免疫性疾病、腫瘤、甲狀腺功能減退等疾病者；(3)既往有腦卒中病史者；(4)伴有嚴(yán)重的心、肺、肝、腎功能不全者；(5)伴有原發(fā)性抑郁癥的缺血性腦卒中患者；(6)既往有腦梗死病史的抑郁癥患者；(7)不愿意配合調(diào)查者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)，并獲得研究對(duì)象及其家屬的知情同意。

1.2 方法

1.2.1 篩選入組 (1)缺血性腦卒中患者影像學(xué)證據(jù)收集：所有首發(fā)急性缺血性腦卒中患者均行頭顱MRI-DWI檢查，并記錄病變部位。(2)神經(jīng)系統(tǒng)功能缺損及抑郁狀態(tài)評(píng)估：采用NIHSS量表對(duì)所有缺血性腦卒中患者進(jìn)行神經(jīng)系統(tǒng)功能缺損評(píng)估，<16分者入組；采用中國(guó)精神疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)第三版(CCMD-3)規(guī)定及HAMD-24項(xiàng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)抑郁狀態(tài)進(jìn)行評(píng)估，HAMD 評(píng)分≥20 分入組。上述評(píng)估均由2名或2名以上醫(yī)師完成，結(jié)果取均數(shù)。(3)基本資料登記：入院 24 h 內(nèi)記錄所有入組患者基本情況，包括性別、年齡、腦卒中嚴(yán)重程度及高血壓病、糖尿病等。

1.2.2 miR-137定量檢測(cè) (1)樣本外周血采集：缺血性腦卒中患者于確診14 d后采取清晨空腹8 h以上外周血2 ml，健康對(duì)照組采取清晨空腹外周血2 ml，抑郁癥組于抗抑郁治療之前抽取清晨空腹外周血2 ml， EDTA-K2抗凝管4℃保存。(2)總RNA提?。?℃保存的外周血于抽取后6 h內(nèi)應(yīng)用RNAiso Blood提取總RNA，并依次應(yīng)用超微量分光光度計(jì)及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA純度與完整性，提取的RNA純度與完整性合格后，于離心管中-80℃保存以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。(3)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA：采用Prime Script TMRT reagent Kit with gDNA Eraser進(jìn)行基因組DNA消化及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。(4)實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR)反應(yīng)：應(yīng)用SYBR? Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)和qRT-PCR儀進(jìn)行miR-137的定量檢測(cè)：以U6作為內(nèi)參，最終配制成25 μg反應(yīng)體系。反應(yīng)條件：預(yù)變性：1個(gè)循環(huán)、95℃30 s；PCR反應(yīng)：40個(gè)循環(huán)、95℃30 s、60℃34 s。反應(yīng)結(jié)束后得到循環(huán)閾值Ct，計(jì)算表達(dá)量。每個(gè)樣本做3個(gè)復(fù)孔實(shí)驗(yàn)，取平均值。ΔCt=CtmiR-137-CtU6，ΔΔCt=(實(shí)驗(yàn)組ΔCt)-(對(duì)照組ΔCt)，2-ΔΔCt為miR-137的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 四組樣本臨床基本資料比較 見表1。四組樣本的性別、年齡、合并高血壓病、合并糖尿病、合并心臟病、NIHSS評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；并發(fā)抑郁組與未并發(fā)抑郁組相比其左側(cè)腦梗死例數(shù)明顯增高(P<0.05)。

表1 四組臨床基本資料比較(x±s，例，%)臨床資料正常對(duì)照組(n=20)未并發(fā)抑郁組(n=37)并發(fā)抑郁組(n=37)抑郁癥組(n=20)P值男性13(65．00)24(64．86)24(64．86)13(65．00)1．000年齡(歲)62．79±7．4560．44±8．6360．58±8．0560．50±9．720．601合并高血壓病10(50．00)20(54．05)19(51．35)11(55．00)0．976合并糖尿病9(45．00)18(48．65)17(45．95)10(50．00)0．977合并心臟病10(50．00)19(51．35)17(45．95)9(45．00)0．933左側(cè)腦梗死-7(18．92)28(75．68)-0．000NIHSS評(píng)分(分)-5．84±3．116．16±2．22-0．602

2.2 總RNA檢測(cè)結(jié)果 見圖1。應(yīng)用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)各樣本的總RNA純度，OD 260/280在1.7～2.1之間，說(shuō)明總RNA提取純度好，無(wú)蛋白等其他成分污染，無(wú)降解。提取的總RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠掃描成像可見28S，18S及5.8S三條帶完整清晰，無(wú)擴(kuò)散現(xiàn)象，28S條帶亮度約為18S條帶2倍，樣本總RNA提取合格，且5.8S條帶清晰可見(根據(jù)miR bp值，miR電泳位置位于5.8S)，故可繼續(xù)下一步實(shí)驗(yàn)。

2.3 擴(kuò)增曲線及熔解曲線的結(jié)果 擴(kuò)增曲線Ct值均<35，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均可靠。熔解曲線結(jié)果均為單峰曲線，說(shuō)明該反應(yīng)特異性良好，無(wú)引物二聚體等其它非目的性產(chǎn)物。

2.4 qRT-PCR相對(duì)定量檢測(cè)miR-137結(jié)果 (1)miR-137的相對(duì)表達(dá)量即2-ΔΔCt值在并發(fā)抑郁組(0.003±0.000)、未并發(fā)抑郁組(0.025±0.015)較正常對(duì)照組明顯降低(均P<0.05)；(2)2-ΔΔCt值在并發(fā)抑郁組(0.016±0.014)較未并發(fā)抑郁組明顯降低(P<0.05)；(3)2-ΔΔCt值在并發(fā)抑郁組(1.272±0.517)較抑郁癥組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 四組外周血樣本總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖結(jié)果 注： 1、2、3、4 分別為正常對(duì)照組、抑郁癥組、并發(fā)抑郁組、未并發(fā)抑郁組

3 討 論

腦卒中是一種嚴(yán)重威脅人類健康的難以治愈疾病，它具有很高的發(fā)病率、致殘率及死亡率。近幾年的研究[15]表明腦卒中的發(fā)病率以每年9%的速率進(jìn)行增長(zhǎng)，并且已經(jīng)成為中國(guó)人的主要死亡原因之一。PSD是腦卒中后最常見的一種精神行為并發(fā)癥，與腦卒中患者的神經(jīng)功能、社會(huì)功能的恢復(fù)密切相關(guān)。急性腦卒中患者至少有1/3最終會(huì)發(fā)展為抑郁，而抑郁會(huì)增加腦卒中的發(fā)病率、致殘率、死亡率[16]。

有研究[17]表明抑郁的病理機(jī)制可能為神經(jīng)再生減少及大腦突觸可塑性失調(diào)，而腦卒中等急性應(yīng)激可導(dǎo)致部分神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)信號(hào)通路減弱，海馬及前額葉皮質(zhì)神經(jīng)元再生、突觸可塑性受損等，從而通過(guò)邊緣系統(tǒng)導(dǎo)致抑郁的產(chǎn)生，說(shuō)明腦卒與抑郁具有相關(guān)性。另外miRs在神經(jīng)元的生成、突觸可塑性及腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子生成等方面均扮演者重要角色[5]，由此推測(cè)腦卒中可能會(huì)通過(guò)影響miRs來(lái)調(diào)節(jié)抑郁的產(chǎn)生。檢索大量文獻(xiàn)后發(fā)現(xiàn)，關(guān)于miRs與PSD的研究較少，且研究?jī)?nèi)容僅局限在某一miR的一個(gè)方面。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)靶基因預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-137調(diào)控BLC2、SLC6、CREB1、Grin2A等多種PSD相關(guān)基因，能從上述多種機(jī)制參與PSD形成，且目前尚無(wú)相關(guān)臨床研究。因此認(rèn)為，miR-137可能在PSD形成中發(fā)揮重要作用，有望成為新的藥物治療靶點(diǎn)，具有重要研究?jī)r(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)各組臨床基本資料如：年齡、性別、合并常見慢性疾病、神經(jīng)功能缺損情況等進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)上述各指標(biāo)在各組間不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，即確保了混雜因素在各組間無(wú)差異性，保證了缺血性腦卒中為唯一變量，進(jìn)而使miR-137的表達(dá)不受缺血性腦卒中以外的其他因素影響，使研究結(jié)果更加可信。另外，通過(guò)對(duì)比并發(fā)抑郁組及未并發(fā)抑郁組，本研究發(fā)現(xiàn)左側(cè)大腦半球梗死(特別是基底節(jié)區(qū)及額葉梗死)更容易引起抑郁狀態(tài)的產(chǎn)生，這可能與大腦半球不同部位的不同功能有關(guān)。對(duì)比各組間miR-137表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，缺血性腦卒中會(huì)引起外周血miR-137水平下調(diào)，并發(fā)抑郁組miR-137水平下調(diào)更明顯，甚至已經(jīng)超過(guò)單純抑郁癥組。綜上所述，缺血性腦卒中會(huì)引起miR-137表達(dá)水平的下降，并且miR-137表達(dá)水平的下降參與缺血性PSD的形成。miR-137可以作為缺血性PSD的預(yù)測(cè)、診斷及治療指標(biāo)。但本實(shí)驗(yàn)尚存在一定的不足之處：(1)由于腦卒中患者住院療程的限制，本實(shí)驗(yàn)納入樣本量不夠大；(2)miR-137調(diào)控基因的最終作用機(jī)制，即分子、蛋白水平的調(diào)控，尚需進(jìn)一步的臨床實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究。

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Expression and its clinical significance of miR-137 in peripheral blood of patients with depression after ischemic stroke

LUYu,TIANXiao-jun,SHILi-jin,etal.

DepartmentofNeurology,theFirstAffiliatedHospitalofXinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453100,China

Objective To explore the changes of miR-137 of patients with depression after ischemic stroke and its clinical significance. Methods All the patients were separately divided into four groups according to the following rating scales: 2014 diagnostic criteria for acute cerebral infarction, Hamilton depression scale(HAMD-24), Diagnostic and statistical manual of mental disorders, the fifth edition (DSM-5)were applied to categorizing. According to the above grouping standards,all the patients were grouped as normal control group (n=20),the depression group (n=20), post-stroke depression group (n=37),no depression after stroke group (n=37). The expression level of microRNA(miR)-137 in each group was detected by quantitative real-time PCR(qRT-PCR),and the results were compared. Results The difference of gender,age,chronic dieases,the site of infarction,NIHSS score had no statistical significance in the four group (allP>0.05). Compared with no depression after stroke group, the number of patients with left cerebral infarction was significantly increased in post-stroke depression group(P<0.05). Compared with the normal control group,miR-137 in no depression after stroke group and in post-stroke depression group significantly decreased(allP<0.05); compared with no depression after stroke group, miR-137 in post-stroke depression group significantly decreased(P<0.05); the level of miR-137 between post-stroke depression group and depression group showed no statistical significance (P>0.05).Conclusions Ischemic stroke can induce the low expression of miR-137 which participates in the formation of post-stroke depression.miR-137 may act as a predictive,diagnostic，therapeutic index of poststroke depression.

stroke;post-stroke depression;miR-137

453100新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

王玉梅

R746.13

A

1004-1648(2017)03-0217-04

2016-07-26

2016-08-29)