夏烈新，陳立銘，彭曉艷，冉文

·論著·

天麻素對(duì)癲癇大鼠海馬神經(jīng)元IL-1β、TNF-α及IL-10的影響

夏烈新，陳立銘，彭曉艷，冉文

目的 探討IL-1β、TNF-α及IL-10在癲癇發(fā)病中的作用以及天麻素對(duì)癲癇大鼠海馬神經(jīng)元IL-1β、TNF-α及IL-10水平的影響。方法 將45只成年雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC組)15只、癲癇組(EP組)15只和天麻素組(GE組)15只。EP組和GE組每日1次經(jīng)腹腔注射閾下劑量的戊四氮建立大鼠癲癇模型，然后給予GE組大鼠腹腔注射天麻素，觀察兩組大鼠的行為學(xué)變化。應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)大鼠海馬IL-1β、TNF-α及IL-10水平的變化并進(jìn)行比較。結(jié)果 GE組的發(fā)作潛伏期較EP組明顯延長(zhǎng)，且發(fā)作持續(xù)時(shí)間縮短、發(fā)作強(qiáng)度降低(P<0.05)。EP組與NC組比較，大鼠海馬神經(jīng)元IL-1β、TNF-α水平明顯上調(diào)(P<0.01)，而IL-10水平明顯降低(P<0.01)。GE組與EP組比較，大鼠海馬神經(jīng)元IL-1β、TNF-α水平明顯降低(P<0.01)，而IL-10水平明顯升高(P<0.01)。結(jié)論 IL-1β、TNF-α可促進(jìn)癲癇的發(fā)生與發(fā)展，而IL-10有抗癲癇作用；天麻素可通過降低IL-1β、TNF-α水平并升高IL-10而發(fā)揮抗癲癇作用。

癲癇; 天麻素; IL-1β;TNF-α；IL-10

癲癇是神經(jīng)系統(tǒng)的常見病之一，其特點(diǎn)是臨床癥狀復(fù)雜多樣，病程長(zhǎng)且反復(fù)發(fā)作?？拱d癇治療的目標(biāo)是控制癲癇發(fā)作，減少致殘率并提高患者生活質(zhì)量。目前，癲癇的治療主要以藥物，主要以西藥為主。天麻素(對(duì)羥基苯甲醇-O-β-D-吡喃葡萄糖苷)[1]為傳統(tǒng)名貴中藥天麻的主要藥物活性成分，已有大量報(bào)道[1]證實(shí)了其具有的抗癲癇作用。但其具體抗機(jī)制目前還不明確。細(xì)胞因子不僅是一種重要的免疫調(diào)節(jié)因子，同時(shí)也在CNS中起到神經(jīng)調(diào)節(jié)的作用。本研究通過戊四氮點(diǎn)燃大鼠模型模擬人類癲癇模型，經(jīng)點(diǎn)燃大鼠腹腔內(nèi)注射天麻素，觀察其對(duì)癲癇發(fā)作潛伏期、發(fā)作持續(xù)時(shí)間的影響；并采用免疫組化的方法觀察癲癇大鼠海馬神經(jīng)元IL-1β、TNF-α及IL-10水平的變化以及天麻素對(duì)癲癇大鼠海馬神經(jīng)元TNF-α、IL-1β及IL-10水平的影響，分析天麻素抗癲癇的免疫機(jī)制，為天麻素預(yù)防和治療癲癇提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 將45只健康成年雄性Wistar大鼠(湖北中醫(yī)藥高等專科學(xué)校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體質(zhì)量180～230 g)，隨機(jī)分為3組：正常對(duì)照組(NC組)、癲癇組(EP組)和天麻素組(GE組)，每組15只。均在安靜、清潔、12 h光照/黑暗的環(huán)境中飼養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑和材料 戊四氮粉劑(Sigma公司)，天麻素注射液(昆明制藥廠), 輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)(浙江金華益迪醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn))，兔抗大鼠IL-1β、TNF-α及IL-10抗體(科瑞生物制品有限公司)，AH-2型Olympus光學(xué)顯微鏡及光學(xué)顯微照像系統(tǒng)(日本Olympus光學(xué)工業(yè)株式會(huì)社)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備 (1)GE組15只，均在每日上午8:00～10:00經(jīng)腹腔注射閾下劑量的戊四氮(35 mg/kg[2])，并觀察行為學(xué)變化。行為學(xué)判斷按Racine方法[3]分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ級(jí)：濕狗樣顫動(dòng)，面肌抽動(dòng)、咀嚼；Ⅱ級(jí)：節(jié)律性點(diǎn)頭；Ⅲ級(jí)：前肢陣攣；Ⅳ級(jí)：站立伴前肢陣攣；Ⅴ級(jí)：失平衡、傾倒、四肢抽動(dòng)、全身陣攣。若連續(xù)3次出現(xiàn)Ⅳ級(jí)以上發(fā)作，即達(dá)到點(diǎn)燃標(biāo)準(zhǔn)，以后每3～4 d注射1次戊四氮(劑量同上)，以維持點(diǎn)燃效應(yīng)。全部大鼠點(diǎn)燃(28 d)后24 h，均經(jīng)腹腔注射天麻素(200 mg/kg )，注射天麻素2 h后，再經(jīng)腹腔注射戊四氮(35 mg/kg)誘發(fā)癲癇發(fā)作，觀察并記錄大鼠行為學(xué)變化，連續(xù)觀察l h左右。以后每天注射并觀察共7 d。(2)EP組：EP組15只，模型制造方法、點(diǎn)燃標(biāo)準(zhǔn)以及維持點(diǎn)燃效應(yīng)方法與GE相同。大鼠全部點(diǎn)燃(28 d) 后24 h，均腹腔注入同天麻素相同體積的生理鹽水，注射生理鹽水2 h后，再經(jīng)腹腔注射戊四氮(同上述劑量)誘發(fā)癲痛發(fā)作，并觀察行為學(xué)變化，連續(xù)觀察1 h左右。連續(xù)注射并觀察共7 d。(3)NC組：NC組每日上午8:00～10:00經(jīng)腹腔注入與戊四氮相同體積的生理鹽水，排除疼痛刺激對(duì)大鼠造成的影響。

1.2.2 標(biāo)本的制作 3組大鼠在GE組連續(xù)應(yīng)用天麻素并觀察7 d，待最后一次癲癇發(fā)作停止后，均經(jīng)腹腔注射10%的水合氯醛(0.3 g/kg)進(jìn)行麻醉，統(tǒng)一行心臟灌注、固定及取材。取含整個(gè)海馬結(jié)構(gòu)的組織修塊，將修塊后的腦組織塊放入4%多聚甲醛磷酸二鈉/氫氧化納緩沖液中，置于4℃冰箱中過夜。將修塊后的腦組織取出，放入20%蔗糖中，常溫下放置12 h。將腦組織用石蠟包埋后，用冷冰凍切片機(jī)切片，片厚約4 μm。每只動(dòng)物取12張腦片，且每張切片的斷面水平在每只大鼠中均相似。

1.2.3 免疫組織化學(xué)方法(S-P法) 免疫組化染色采用S-P法(DAB免疫組化染色試劑盒購于北京中山生物制品工程有限公司)行免疫組化染色。

1.2.4 圖象分析和數(shù)據(jù)處理 每只大鼠均取12張腦片，4張切片用于神經(jīng)元IL-1β的檢測(cè)，4張切片用于神經(jīng)元TNF-α的檢測(cè)，4張切片用于神經(jīng)元IL-10的檢測(cè)。每張切片的每個(gè)區(qū)域隨機(jī)選擇3個(gè)高倍視野(×200)進(jìn)行測(cè)定，取其平均值作為最終結(jié)果，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。應(yīng)用PIPS-2011彩色病理圖文分析管理系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析。首先分析海馬內(nèi)含IL-1β、TNF-α、IL-10神經(jīng)元的平均陽性細(xì)胞記數(shù)，然后對(duì)所選腦區(qū)進(jìn)行陽性反應(yīng)細(xì)胞平均光密度測(cè)定(待測(cè)物質(zhì)顏色越深，表明其在細(xì)胞中表達(dá)的量越高；反之，顏色越淺，表明其在細(xì)胞中表達(dá)的量越低)。

2 結(jié) 果

2.1 各組行為學(xué)變化的比較 見表1。NC組均無癲癇發(fā)作。EP組和GE組大鼠在注射閾下劑量戊四氮后第6 d開始出現(xiàn)反應(yīng)，點(diǎn)燃時(shí)間為21～28 d，平均24 d。行為學(xué)的判斷標(biāo)準(zhǔn)參考Racine方法[3]分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。點(diǎn)燃后，EP組每次腹腔注射戊四氮后所有大鼠均出現(xiàn)Ⅴ級(jí)發(fā)作，平均潛伏期為(152.46±43.54)s，平均持續(xù)時(shí)間為(2796.40±601.15)s；GE組注射戊四氮后有3只大鼠出現(xiàn)Ⅴ級(jí)發(fā)作，3只大鼠出現(xiàn)Ⅳ級(jí)發(fā)作，其余均為Ⅲ級(jí)發(fā)作，平均潛伏期為(249.58±78.64)s，平均持續(xù)時(shí)間為(2063.70±679.28)s。GE組的發(fā)作潛伏期較EP組明顯延長(zhǎng)，且發(fā)作持續(xù)時(shí)間縮短、發(fā)作強(qiáng)度降低(均P<0.05)。

表1 EP組和GE組大鼠平均潛伏期和平均持續(xù)時(shí)間的比較(n=15，x±s，s)組別平均潛伏期(s)平均持續(xù)時(shí)間(s)EP組152．46±43．542796．40±601．15GE組249．58±78．64?2063．70±679．28? 注：與EP組比較?P<005

2.2 各組間海馬IL-1β平均陽性細(xì)胞記數(shù)和胞體平均光密度值的比較 見表2、圖1～圖3。免疫反應(yīng)的強(qiáng)弱用平均光密度值表示，顏色越深則數(shù)值越大。EP組明顯高于NC組(P<0.01)；GE組明顯低于EP組(P<0.01)，明顯高于NC組(P<0.01)。

圖1 NC組海馬IL-1β神經(jīng)元陽性細(xì)胞數(shù)和光密度，DAB顯色為棕黃色(×200) 圖2 EP組海馬IL-1β神經(jīng)元陽性細(xì)胞數(shù)和光密度，DAB顯色為棕黃色(×200) 圖3 GE組海馬IL-1β神經(jīng)元陽性細(xì)胞數(shù)和光密度，DAB顯色為棕黃色(×200)

2.3 各組間海馬TNF-α平均陽性細(xì)胞記數(shù)和胞體平均光密度值的比較 見表3、圖4～6。 免疫反應(yīng)的強(qiáng)弱用平均光密度值表示，顏色越深則數(shù)值越大。EP組明顯高于NC組(P<0.01)；GE組明顯低于EP組(P<0.01)，明顯高于NC組(P<0.01)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 海馬神經(jīng)元TNF?α陽性細(xì)胞數(shù)和平均光密度比較(n=15，x±s)組別陽性細(xì)胞數(shù)平均光密度NC組92．43±21．420．265±0．017EP組164．76±34．17#0．489±0．028#GE組127．65±27．62#?0．392±0．021#? 注：與NC組比較#P<001；與EP組比較?P<001

2.4 各組間海馬IL-10平均陽性細(xì)胞記數(shù)和胞體平均光密度值 見表4、圖7～9。免疫反應(yīng)的強(qiáng)弱用平均光密度值表示，顏色越深則數(shù)值越大。EP組明顯低于NC組(P<0.01)，GE組明顯高于戊四氮組(P<0.01)，明顯高于NC組(P<0.01) 。

圖4 NC組海馬TNF-α神經(jīng)元陽性細(xì)胞數(shù)和光密度，DAB顯色為棕黃色(×200) 圖5 EP組海馬TNF-α神經(jīng)元陽性細(xì)胞數(shù)和光密度，DAB顯色為棕黃色(×200) 圖6 GE組海馬TNF-α神經(jīng)元陽性細(xì)胞數(shù)和光密度，DAB顯色為棕黃色(×200)

表4 海馬神經(jīng)元IL?10陽性細(xì)胞數(shù)和平均光密度比較(n=15，x±s)組別陽性細(xì)胞數(shù)平均光密度NC組98．34±21．390．367±0．019EP組86．37±15．91#0．217±0．013#GE組136．63±32．48#?0．512±0．028#? 注：與NC組相比#P<001；與EP組相比?，P<001

圖7 NC組海馬IL-10神經(jīng)元陽性細(xì)胞數(shù)和光密度，DAB顯色為棕黃色(×200) 圖8 EP組海馬IL-10神經(jīng)元陽性細(xì)胞數(shù)和光密度，DAB顯色為棕黃色(×200) 圖9 GE組海馬IL-10神經(jīng)元陽性細(xì)胞數(shù)和光密度，DAB顯色為棕黃色(×200)

3 討 論

神經(jīng)元異常放電是癲癇的病變基礎(chǔ)，神經(jīng)元異常放電的同步和擴(kuò)散導(dǎo)致癲癇的發(fā)生、發(fā)展。近年來研究[4]發(fā)現(xiàn)，癲癇的發(fā)病機(jī)制與機(jī)體的神經(jīng)免疫系統(tǒng)功能紊亂有密切關(guān)系。細(xì)胞因子是一種重要的免疫調(diào)節(jié)因子，癲癇的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞因子關(guān)系密切。

許多動(dòng)物研究[5-6]表明，IL-1β與TNF-α具有誘發(fā)抽搐的作用，而IL-10的抗驚厥作用。關(guān)于IL-1β誘發(fā)癲癇的機(jī)制，在于其不僅能通過增加一氧化氮的產(chǎn)生來提高癲癇敏感性，并能通過激活N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)受體或使NMDA受體表達(dá)水平增加而增強(qiáng)NMDA受體功能，IL-1β還能通過抑制GABA受體、抑制細(xì)胞內(nèi)K+外流而增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞興奮性。IL-1β的致癇作用也依賴于海馬中神經(jīng)磷脂酶和Src激酶的活化，其能導(dǎo)致NMDA受體的NR2B亞基的磷酸化，從而引起神經(jīng)元的過度興奮[7]。升高的IL-1β可能通過激活膠質(zhì)細(xì)胞釋放其他細(xì)胞因子，促進(jìn)黏附分子的表達(dá)并參與炎癥反應(yīng)，促進(jìn)癲癇的發(fā)生發(fā)展[8]。TNF-α表達(dá)增加可通過促進(jìn)NMDA受體的激活，介導(dǎo)神經(jīng)元內(nèi)鈣升高，使神經(jīng)元興奮性提高[9]。TNF-α還可能通過對(duì)GABA能(GABAA)受體的內(nèi)吞作用，是突觸表面GABAA受體減少，使突觸興奮性增強(qiáng)。TNF-α可通過抑制膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)谷氨酰胺合成酶的活性，使谷氨酸的表達(dá)增加、活性增強(qiáng)。通過與P55受體的相互作用，TNF改變了突觸α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸(AMPA)受體的分子化學(xué)計(jì)量，并增加興奮性突觸的活動(dòng)[10]。TNF-α能通過減弱神經(jīng)細(xì)胞抑制性突觸后電位并興奮海馬CA3錐體細(xì)胞而導(dǎo)致致異常癇樣放電。IL-10是一種在CNS受損傷時(shí)起重要抗炎作用的細(xì)胞因子，具有一定的抗氧化酶、抗自由基的作用。IL-10能通過抑制神經(jīng)細(xì)胞Ca2+內(nèi)流、減少大腦皮質(zhì)興奮性氨基酸特異性受體的表達(dá)并使神經(jīng)細(xì)胞GABA的表達(dá)增加等途徑而發(fā)揮抗癲癇作用[11-12]。IL-10能抑制神經(jīng)細(xì)胞的過度興奮，降低谷氨酸的興奮性神經(jīng)毒性并能抑制神經(jīng)細(xì)胞死亡，具有很強(qiáng)的神經(jīng)保護(hù)作用[13]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，EP組大鼠海馬神經(jīng)元IL-1β、TNF-α的陽性細(xì)胞數(shù)和光密度較NC組明顯增加，而EP組大鼠海馬神經(jīng)元IL-10的陽性細(xì)胞數(shù)和光密度較NC組降低。應(yīng)用天麻素后，GE組大鼠海馬神經(jīng)元IL-1β、TNF-α的陽性細(xì)胞數(shù)和光密度較EP組明顯下降，而GE組大鼠海馬神經(jīng)元IL-10的陽性細(xì)胞數(shù)和光密度較EP組明顯升高。這說明海馬神經(jīng)元內(nèi)IL-1β、TNF-α可促進(jìn)癲癇的發(fā)生與發(fā)展，而IL-10具有抗癲癇作用。GE組與EP組比較，點(diǎn)燃大鼠在應(yīng)用天麻素后再給予戊四氮刺激時(shí)，GE組大鼠癲癇發(fā)作的強(qiáng)度明顯減弱、發(fā)作的潛伏期明顯延長(zhǎng)且發(fā)作持續(xù)時(shí)間明顯縮短，兩組比較具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這說明天麻素可能通過抑制海馬神經(jīng)元IL-1β、TNF-α的表達(dá)，促進(jìn)IL-10的表達(dá)而影響了神經(jīng)元電生理活動(dòng)，抑制了神經(jīng)元異常放電的產(chǎn)生、擴(kuò)散和傳導(dǎo)。天麻素可能通過影響大鼠海馬神經(jīng)元內(nèi)細(xì)胞因子的表達(dá)在一定程度上影響神經(jīng)元的興奮性，起到了一定的抑制癲癇發(fā)生發(fā)展的作用。

[1]趙燕玲，張博愛，賈延劼，等.天麻素對(duì)海人酸致大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用[J].中國(guó)實(shí)用神經(jīng)疾病雜志，2009，12：33.

[2]Diehl RG, Smialowski A, Gotwo T. Development and persistence of kindled seizures after repeated injections of pentylenetetrazol in rats and Guinea pigs[J]. Epilepsia, 1984, 25: 506.

[3]Racine R, Okujava V, Chipashvili S. Modification of seizure activity by electrical stimulation：Ⅲ. Mechanisms[J]. Electroencephalogr Clin Neurophysiol, 1972, 32: 295.

[4]Friedman A, Dingledine R. Molecular cascades that mediate the influence of inflammation on epilepsy[J]. Epilepsia, 2011, 52: 33.

[5]Zhu G, Okada M, Yoshida S, et al. Effects of interleukin-1beta on hippocampal glutamate and GABA releases associated with Ca2+-induced Ca2+releasing systems[J]. Epilepsy Res, 2006, 71: 107.

[6]Ravizza T, Vezzani A. Status epilepticus induces time-dependent neuronal and astrocytic expression of interleukin-1 receptor type I in the rat limbic system[J]. Neuroscience, 2006, 137: 301.

[7]Balosso S, Maroso M, Sanchez-Alavez M, et al. A novel non-transcriptional pathway mediates the proconvulsive effects of interleukin-1beta[J]. Brain, 2008, 131: 3256.

[8]Rao RS, Prakash A, Medhi B. Role of different cytokines and seizure susceptibility: a new dimension towards epilepsy research[J]. Indian J Exp Biol, 2009, 47: 625.

[9]Li Z, Liu Q, Zhu C, et al. Effect of coriaria lactone-activated astrocyte-conditioned medium on the cerebral TNF-alpha of normal rats[J]. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci, 2006, 26: 161, 184.

[10]Corcoran C, Connor TJ, O’keane V, et al. The effects of vagus nerve stimulation on pro- and anti-inflammatory cytokines in humans: a preliminary report[J]. Neuroimmunomodulation, 2005, 12: 307.

[11]Vezzani A, Moneta D, Richichi C, et al. Functional role of inflammatory cytokines and antiinflammatory molecules in seizures and epileptogenesis[J]. Epilepsia, 2002, 43: 30.

[12]Mattson MP, Camandola S. NF-kappaB in neuronal plasticity and neurodegenerative disorders[J]. J Clin Invest, 2001, 107: 247.

[13]Ishizaki Y, Kira R, Fukuda M, et al. Interleukin-10 is associated with resistance to febrile seizures: Genetic association and experimental animal studies[J]. Epilepsia, 2009, 50: 761.

Effect of gastrodin on IL-1β,TNF-α and IL-10 in hippocampus neurons from epileptic rats

XIALie-xin,CHENLi-min,PENGXiao-yan,etal.

DepartmentofNeurology,thePeople’sFirstAffiliatedHospitalofYangtzeUniversity,Jingzhou434000,China

Objective To explore the possible role of IL-1β,TNF-α and IL-10 in the pathogenesis of epilepsy, and investigate the effect of gastrodin on IL-1β,TNF-α and IL-10 in hippocampus neurons from epileptic rats.Methods Forty-five adult male Wistar rats were randomly divided into normal control group (NC group), the epilepsy group (EP group) and gastrodin group (GE group).EP group and the GE group injection subthreshold doses of Pentylenetetrazol by intraperitoneal once a day,until them reache the ignited standards. GE group injection gastrodin by intraperitoneal. Observed and recorded the changes of rats’s behavior. IL-1β，TNF-α and IL-10 levels change in hippocampal neurons were detected and compared by immunohistochemistry. Results Compared gastrodin group with epilepsy group the incubation period of onset was significantly prolonged, the duration is shorter、attack strength is lower (P<0.05).Compared with normal control group, IL-1β,TNF-α levels in hippocampal neurons of epilepsy group significantly increased(P<0.01), and IL-10 levels decreased significantly(P<0.01).Compared with epilepsy group,IL-1β,TNF-α levels in hippocampal neurons of gastrodin group decreased significantly (P<0.01),and IL-10 levels increased significantly (P<0.01).Conclusions IL-1β、TNF-α can promote the occurrence and development of epilepsy, antiepileptic and IL-10 has the effect of antiepileptic. The gastrodin play an antiepileptic effect by lower IL-1β,TNF-α and increased IL-10 levels.

epilepsy;gastrodin;IL-1β;TNF-α;IL-10

434000 長(zhǎng)江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬荊州市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

R742.1

A

1004-1648(2017)03-0209-04

2016-02-27

2016-03-29)