任 婧，李景富，張 佳，劉俊芳，許向陽(yáng)，姜景彬

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝園林學(xué)院，哈爾濱 150036)

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基于3，5-二硝基水楊酸比色法建立一種快速測(cè)定總糖含量的方法

任 婧，李景富，張 佳，劉俊芳，許向陽(yáng)，姜景彬

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝園林學(xué)院，哈爾濱 150036)

本實(shí)驗(yàn)利用3，5-二硝基水楊酸(DNS)比色法對(duì)番茄果實(shí)總糖含量進(jìn)行了測(cè)定，并初步建立了微型化DNS比色法測(cè)定總糖含量的實(shí)驗(yàn)方法和DNS比色法測(cè)定番茄總糖含量的最佳條件，對(duì)影響測(cè)定結(jié)果的因素：測(cè)定波長(zhǎng)、顯色劑用量、顯色時(shí)間進(jìn)行了單因素試驗(yàn)。結(jié)果表明，540 nm波長(zhǎng)、0.2 mL DNS、沸水浴4 min為最佳測(cè)定條件。該最佳測(cè)定條件下，葡萄糖含量在20～200 μg與吸光值呈良好的線性關(guān)系。利用得到優(yōu)化方法對(duì)4個(gè)番茄品種的總糖含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明測(cè)定樣品在1.5 h內(nèi)的吸光值較為穩(wěn)定，RSD為2.19%～2.88%。本研究得到番茄果實(shí)總糖含量測(cè)定的優(yōu)化方法，是一種穩(wěn)定、高效可行的測(cè)定方法，為番茄高糖品種的鑒定和篩選提供了依據(jù)。

番茄；DNS；酶標(biāo)儀

番茄(Lycopersicon esculentum Mill)，原產(chǎn)于南美洲的秘魯和墨西哥，營(yíng)養(yǎng)豐富，是人們餐桌上不可缺少的蔬菜。番茄也是全世界種植最為普遍的蔬菜作物之一。番茄含有VA、VC、葉酸、鉀等主要的營(yíng)養(yǎng)元素，其中富含的番茄紅素可以清除人體內(nèi)的活性氧自由基，延緩衰老，同時(shí)具有預(yù)防癌癥、心血管疾病等功能[1]。因此，近些年番茄果實(shí)的風(fēng)味品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)含量也越來(lái)越受到人們的關(guān)注[2]。含糖量是番茄風(fēng)味品質(zhì)的重要組成部分[3]，同時(shí)也是番茄品質(zhì)育種的重要指標(biāo)。而番茄含糖量的測(cè)定的方法較多，如高效液相色譜法[4]、斐林試劑法[5]、蒽酮比色法[6]、3，5-二硝基水楊酸(DNS)比色法[7]等，大多是利用紫外可見光吸收法，但這些方法存在一些明顯的缺點(diǎn)，如價(jià)格昂貴、操作復(fù)雜、測(cè)定時(shí)間長(zhǎng)、污染嚴(yán)重，不能進(jìn)行批量測(cè)定。DNS比色法是半微量測(cè)定糖法[8]，操作簡(jiǎn)便、快速，適合批量測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)對(duì)3，5-二硝基水楊酸法測(cè)定番茄總糖含量的反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，尋找最佳實(shí)驗(yàn)條件以保證試驗(yàn)的精確度，獲得可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為番茄育種提供參考。

1 儀器與試藥

酶標(biāo)儀(伯騰Epoch)；水浴鍋；天平；容量瓶；離心管；3，5-二硝基水楊酸；6 mol/L HCl；6 mol/L NaOH；0.5%酚酞；葡萄糖；蒸餾水。

2 方法

2.1 溶液的制備

2.1.1 DNS 試液的配制

將6.3 gDNS和2 mol/LNaOH溶液362 mL，加到500 mL含有185 g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加5 g結(jié)晶酚和5 g亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻后加蒸餾水定容至1 000 mL，貯于棕色瓶中備用[9]。

2.1.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的配制

精密稱定葡萄糖1 g，加水溶解并定容至1 000 mL 的容量瓶，即得濃度為1 mg/mL。

2.1.3 待測(cè)總糖溶液的制備

將-80℃冷凍的番茄“16588”、“16698”、“16541”、“16513”去皮、籽，取3 g，充分研磨成勻漿，放入離心管，加入6 mol/L鹽酸10 mL和蒸餾水15 mL，沸水浴40 min，過(guò)濾，冷卻后滴入1滴酚酞，用6 mol/L NaOH中和至pH中性，定容至100 mL。

2.2 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

為建立一種快速、準(zhǔn)確測(cè)定還原糖的含量的方法，對(duì)3，5-二硝基水楊酸比色法的測(cè)定波長(zhǎng)、顯色劑用量、顯色時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

2.2.1 最佳波長(zhǎng)

取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0 μL、20 μL、40 μL、60 μL、80 μL、100 μL、120 μL、140 μL、160 μL、180 μL、200 μL到0～10號(hào)離心管中，加蒸餾水至200 μL，DNS 0.4 mL于離心管中混合，沸水浴5 min，立即冰水冷卻，靜置10 min，加入1 600 μL水混勻，搖勻后以酶標(biāo)板空白孔為空白對(duì)照，在300～800 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。以波長(zhǎng)值為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制曲線。在300～460 nm波長(zhǎng)內(nèi)各濃度不都有對(duì)應(yīng)吸光值，550～800 nm波長(zhǎng)內(nèi)空白對(duì)照的值為負(fù)值，均不考慮(圖1)。470～540 nm波長(zhǎng)內(nèi)對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)在540 nm處最大(R2=0.9757y=0.003x-0.0194)，故選擇540 nm為最佳波長(zhǎng)。

2.2.2 顯色劑用量

取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0 μL、20 μL、40 μL、60 μL、80 μL、100 μL、120 μL、140 μL、160 μL、180 μL、200 μL到0～10號(hào)離心管中，加蒸餾水至200μL，分別加入DNS 0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL于離心管中混合，沸水浴5 min，立即冰水冷卻，靜置10 min，加入1 600 μL水混勻，以0號(hào)管為空白對(duì)照，在540 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，每組進(jìn)行3次重復(fù)。以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，吸光值(A540)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在0.2 mL DNS加入量時(shí)標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)(R2=0.996 1)最大(圖2)，故選擇0.2 mL為DNS最適加入量。

圖1 不同濃度葡萄糖在不同波長(zhǎng)下的吸光值Fig.1 The absorbance of different concentrations of glucose at different wavelengths

圖2 不同濃度DNSFig.2 Different concentrations of DNS

2.2.3 顯色時(shí)間

取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0 μL、20 μL、40 μL、60 μL、80 μL、100 μL、120 μL、140 μL、160 μL、180 μL、200μl到0～10號(hào)離心管中，加蒸餾水至200 μL，加入DNS 0.2 mL于離心管中混合，分別沸水浴1 min、2 min、3 min、4 min、5 min、6 min，立即冰水冷卻，靜置10 min，加入1 600 μL水混勻，以0號(hào)管為空白對(duì)照，在540 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，每組進(jìn)行3次重復(fù)。以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，吸光值(A540)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，4 min時(shí)標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)(R2=0.997 5)最大(圖3)，故選擇4 min為最適加熱時(shí)間。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0 μL、20 μL、40 μL、60 μL、80 μL、100 μL、120 μL、140 μL、160 μL、180μL、200 μL到0～10號(hào)離心管中，加蒸餾水至200 μL，加入DNS 0.2 mL于離心管中混合，沸水浴4 min，立即冰水冷卻，靜置10 min，加入1 600 μL水混勻，以葡糖糖含量為橫坐標(biāo)，吸光值(A540)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖3 不同加熱時(shí)間Fig.3 Different heating times

圖4 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 The standard curve

2.4 精密度試驗(yàn)

將不同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液(20 μL、100 μL、200 μL)，按上述方法顯色，加到同一個(gè)酶標(biāo)板上測(cè)定吸光值，隨后分別加到3個(gè)不同的酶標(biāo)板上測(cè)量吸光值。同樣處理進(jìn)行第二批次，不同酶標(biāo)板在540 nm處的吸光值相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.86%～3.07%(表1)，表明儀器的精密性良好，可用于測(cè)定吸光值。

表1 精度測(cè)定值

2.5 番茄總糖含量的測(cè)定

2.5.1 總糖含量測(cè)定

取測(cè)定液200 μL稀釋到600 μL，取稀釋后的溶液200 μL加入DNS 0.2 mL到離心管，沸水浴4 min，立即冰水冷卻，加入蒸餾水1 600 μL，靜置10 min，使用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光值，同時(shí)按2.3方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算得到“16698”、“16588”、“16541”、“16513”總糖含量分別為42.06 mg/g、54.38 mg/g、57.36 mg/g、49.41 mg/g。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密量取稀釋待測(cè)液200 μL，按2.5.1項(xiàng)下方法顯色，室溫放置，每隔 30 min測(cè)定一次吸光度。結(jié)果表明，在顯色 1.5 h 內(nèi)基本穩(wěn)定，RSD為2.19%～2.88%。

2.5.3 回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的總糖溶液各5份，分別精密加入葡萄糖對(duì)照品20 μg，按照2.5.1與2.3項(xiàng)方法分別測(cè)定其吸光值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算回收率。結(jié)果(表2)表明測(cè)定結(jié)果可靠性良好，該方法可用于測(cè)定番茄總糖含量。

表2 回收率測(cè)定

3 討論

DNS比色法測(cè)定總糖含量的原理是利用酸水解法將沒(méi)有還原性的雙糖和多糖使其降解成有還原性的單糖進(jìn)行測(cè)定，還原糖在堿性條件下被氧化成糖酸及其他產(chǎn)物，3，5-二硝基水楊酸被還原為棕色3-氨基-5-硝基水楊酸，在一定范圍內(nèi)，還原糖含量與棕色物質(zhì)顏色的深淺成正比關(guān)系，利用酶標(biāo)儀測(cè)定其吸光值，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總糖含量。測(cè)定的關(guān)鍵步驟有測(cè)定波長(zhǎng)的選擇、顯色液用量、顯色時(shí)間、穩(wěn)定時(shí)間等。

DNS比法測(cè)定還原糖含量最佳吸收光譜的確定，不同的作物需要采用不同的檢測(cè)波長(zhǎng)。朱海霞等[10]在馬鈴薯還原糖測(cè)定確定λmax=510 nm、趙凱等[11]在測(cè)定還原糖含量的研究確定λmax=550 nm、王俊麗等[12]對(duì)DNS法測(cè)定最佳波長(zhǎng)的研究中確定λmax=520 nm，這些與本實(shí)驗(yàn)得出的λmax=470 nm 有所不同。這可能由于最佳波長(zhǎng)的確定受到儀器靈敏度、試驗(yàn)中葡萄糖含量及DNS用量、蒸餾水加入量等因素的影響。因此應(yīng)采用合適的實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系和測(cè)定儀器來(lái)確定所需的最佳條件。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)單因素試驗(yàn)得到在470 nm波長(zhǎng)處不同含量的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液(20～200 μg)均能測(cè)到吸光值且為最大值，但標(biāo)準(zhǔn)曲線在此波長(zhǎng)下的線性較差，相關(guān)系數(shù)較低，可能與DNS顯色液自身在此波長(zhǎng)下也有極高的吸光值有關(guān)，這種自身吸光值高可能會(huì)對(duì)樣品測(cè)定值產(chǎn)生誤差，所以還原糖顯色后具有最大吸光值的波長(zhǎng)不一定是最佳測(cè)定波長(zhǎng)。在540 nm波長(zhǎng)處顯色液自身吸光值最低且大于零，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)性最好，綜合相關(guān)系數(shù)和顯色液自身吸光值，選定540 nm為最適測(cè)定波長(zhǎng)。

實(shí)驗(yàn)使用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光值，酶標(biāo)儀和分光光度計(jì)原理基本相似，對(duì)樣品的吸光值可以進(jìn)行批量測(cè)定，同時(shí)操作方便，減少了傳統(tǒng)紫外分光光度計(jì)比色皿清洗不徹底從而影響測(cè)定值的問(wèn)題。酶標(biāo)法的線性范圍良好，穩(wěn)定性、可重復(fù)性和精密度較高，測(cè)定時(shí)需要的樣品量少[13]。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)單因素試驗(yàn)和RSM分析最終確定了最佳測(cè)定波長(zhǎng)為540 nm，顯色劑用量為0.2 mL，顯色時(shí)間為4 min，穩(wěn)定靜置最少時(shí)間為10 min。根據(jù)最佳條件測(cè)定的番茄總糖糖含量在1.5 h內(nèi)吸光值穩(wěn)定，該方法可用于批量集中測(cè)定番茄總糖含量。番茄總糖的測(cè)定受到多種因素的干擾，如：水解時(shí)間、水解溫度、HCl的加入量、番茄紅素等。為了排除番茄糖液提取過(guò)程中色素對(duì)測(cè)定的干擾，試用活性炭除色素，以對(duì)照品溶液試驗(yàn)時(shí)，吸光值略有增加，說(shuō)明活性炭吸附了色素等可以影響到吸光值測(cè)定的因素，與江建麗[14]測(cè)定五味子還原糖含量使用活性炭的結(jié)果不同，可能是由于測(cè)定樣品不同，提取方法不同造成。從2.5.2 測(cè)定結(jié)果可以看出，不同品種番茄的測(cè)定值較為穩(wěn)定、可靠，具有方便快捷、安全、準(zhǔn)確、低成本等特點(diǎn)，可用于不同品種番茄總糖含量測(cè)定。

[1] 佑奎. 強(qiáng)大的西紅柿[J].健與美，2013，(07)：93.

[2] Causse M，F(xiàn)riguet C，Coiret C，et al. Consumer Preferences for Fresh Tomato at ：A Common Segmentation on Taste and Firmness[J].Journal of Food Science，2010，75(9)：S531.

[3] 田春雨，劉野.番茄風(fēng)味品質(zhì)性狀遺傳研究進(jìn)展[J].農(nóng)業(yè)科技與裝備，2009，(03)：4-5.

[4] 劉靜.高效液相色譜法測(cè)定番茄中糖酸的研究[J].農(nóng)業(yè)科技與裝備，2009，(04)：87-89.

[5] 楊林娥，彭曉光，楊慶文，等.斐林試劑法測(cè)定還原糖方法的改進(jìn)[J].中國(guó)釀造，2010，29(5)：160-161.

[6] 姚立虎，徐茜.蒽酮比色法測(cè)食品總糖含量的簡(jiǎn)化研究[J].食品工業(yè)，1992，(03)：40-42.

[7] 尹建雄，盧紅，謝強(qiáng)，等.3，5-二硝基水楊酸比色法快速測(cè)定煙草水溶性總糖、還原糖及淀粉的探討[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，22(6)：829-833.

[8] 劉忠義，歐昌榮，湯海青，等.3，5-二硝基水楊酸法測(cè)定葡萄酒中總糖含量的條件優(yōu)化[J].核農(nóng)學(xué)報(bào)，2013，27(11)：1717-1723.

[9] 高繼國(guó).普通生物化學(xué)教程實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2009.

[10] 朱海霞，石瑛，張慶娜，等.3，5-二硝基水楊酸(DNS)比色法測(cè)定馬鈴薯還原糖含量的研究[J].中國(guó)馬鈴薯，2005，19(5)：266-269.

[11] 趙凱，許鵬舉，谷廣燁. 3，5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定還原糖含量的研究[J].食品科學(xué)，2008，29(8)：534-536.

[12] 王俊麗，聶國(guó)興，李素貞，等.DNS法測(cè)定還原糖含量時(shí)最適波長(zhǎng)的確定[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，(04)：115-118.

[13] 石耀強(qiáng)，張晗依，劉雙月.酶標(biāo)儀檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用的研究進(jìn)展[J].科技展望，2016，26(24)：73，107.

[14] 江建麗. 3，5-二硝基水楊酸(DNS)法測(cè)定五味子還原糖含量的適宜條件[J].海峽藥學(xué)，2014，26(1)：57-60.

A method for rapid determination of total sugar content based on 3, 5-dinitrosalicylic acid colorimetry

REN Jing, LI Jing-fu, ZHANG Jia, LIU Jun-fang, XU Xiang-yang, JIANG Jing-bin

(Northeast Agricultural University, College of Horticulture and Landscape, Harbin 150036, China)

In this study, a colorimetric method was used to estimate the total sugars content in tomato with 3, 5-dinitrosalicylic acid. An experimental method for the determination of total sugar content by miniaturiza DNS colorimetric method were initially established and we obtained the optimize conditions for the determination of total sugar content in tomato by DNS colorimetric method. The single-factor test and response surface methodology were applied to optimize conditions including the determination wavelength, color developer amount, time and stability of the reaction. The results showed that 540 nm wavelength, 0.2 mL, DNS and boiling water bath 4min were the best conditions for determination. There was a linear relationship between the content of glucose in the range of 20～200 μg and absorbance at this optimum determination conditions. The optimized method was used to determine the total sugar content of 4 tomato cultivars. The results showed that the properties of the samples were stable in 1.5 hour, and RSD was 2.19% to 2.88%. In this study, the optimal method for the determination of total sugar content in tomato fruit is a stable, efficient and feasible method which provided basis for identification and screening of high sugar cultivars.

Tomato; DNS; Microplate reader

2017-04-09

番茄雜種優(yōu)勢(shì)利用技術(shù)與強(qiáng)優(yōu)勢(shì)雜交種創(chuàng)制(2016YFD0101703)

任婧(1992-)，女，碩士。

李景富(1943-)，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，e-mail：Lijf_2005@126.com。

TS255.7

A

1674-8646(2017)10-0066-04