李琦，陳明真，趙林果

(南京林業(yè)大學化學工程學院；江蘇省生物質綠色燃料與化學品重點實驗室，南京210037)

耐熱木聚糖酶基因的克隆表達及其在酶解玉米芯木聚糖中的應用

李琦，陳明真，趙林果*

(南京林業(yè)大學化學工程學院；江蘇省生物質綠色燃料與化學品重點實驗室，南京210037)

為尋求具有耐熱性能的木聚糖酶，筆者以嗜熱網(wǎng)球菌(Dictyoglomusthermophilum)DSM3960的基因組為模板，克隆得到木聚糖酶基因xynB-DT，該基因全長1 083 bp，共編碼361個氨基酸，蛋白的理論分子量約為40 ku。通過NCBI數(shù)據(jù)庫比對發(fā)現(xiàn)該基因編碼的蛋白質屬于糖苷水解酶G11家族。實現(xiàn)大腸桿菌異源表達重組木聚糖酶XynB-DT，通過IPTG誘導，酶活達到30.6 U/mL。該重組木聚糖酶的最適溫度為85℃，在60～80℃范圍內(nèi)均有較好溫度穩(wěn)定性，在60℃條件下保溫2 h，酶活維持在90%以上，在90℃下保溫2 h，酶活尚殘余約50%；最適pH為6.5，在pH為5.0～7.5范圍內(nèi)保溫24 h仍可保留約90%剩余酶活力。該酶以Beechwood木聚糖為底物，米氏常數(shù)(Km)和最大反應速率(Vmax)值分別為5.63 mg/mL和1.572 mmol/(L·min-1)。以玉米芯木聚糖為底物，研究XynB-DT水解玉米芯木聚糖的條件及產(chǎn)物，結果顯示在溫度70℃、pH 6.0條件下酶解12 h，加酶量為400 U/g，最終酶解得率為44.3%，玉米芯木聚糖的水解產(chǎn)物主要以木二糖和木三糖為主，表明該木聚糖酶在低聚木糖制備方面具有較大應用潛能。

嗜熱網(wǎng)球菌；木聚糖酶；克?。凰?/p>

木聚糖酶是一類可將木聚糖降解為低聚木糖和木糖的酶的總稱，主要分為內(nèi)切β-1,4-木聚糖酶、外切β-1,4-木聚糖酶以及β-D-木糖苷酶[1-3]。內(nèi)切β-1,4-木聚糖酶，以內(nèi)切方式水解木聚糖主鏈中的β-1,4-糖苷鍵，生成木二糖和木三糖等寡糖，是降解木聚糖最主要的酶，在造紙、紙漿工業(yè)、食品和飼料工業(yè)中有廣泛應用前景[4-6]。我國作為農(nóng)業(yè)大國，全國年糧食總產(chǎn)量達到6億t，但大量秸稈、玉米芯等農(nóng)副產(chǎn)物卻只能被焚燒，既造成環(huán)境污染又浪費生物資源。玉米芯內(nèi)木聚糖含量高達35%，木聚糖經(jīng)木聚糖酶水解后可獲得具有應用價值的低聚木糖。低聚木糖作為一種新型功能性食品添加劑，在提高食物質量方面具有較大潛能[7]。然而，在食品加工工業(yè)中，需要利用較高溫度以提升底物的溶解性并防止雜菌污染。耐高溫木聚糖酶具有較大應用價值及廣闊市場前景。

目前，木聚糖酶已經(jīng)從細菌、真菌、植物和各種無脊椎動物中分離，其中，微生物來源的木聚糖酶最為廣泛[8]，通常細菌來源的木聚糖酶比真菌來源的木聚糖酶耐熱。根據(jù)酶蛋白催化區(qū)的氨基酸同源性以及疏水簇分析，大多數(shù)木聚糖酶屬于糖苷水解酶家族F/10和G/11族。一般情況下，F(xiàn)/10族木聚糖酶分子量大，熱穩(wěn)定性好，大部分含有多個結構域，作用底物廣泛，且水解產(chǎn)物中單糖成分含量較多。與F/10族木聚糖酶相比，G/11族木聚糖酶同源性在40%～90%范圍內(nèi)，且分子量低，催化效率高，最適pH為2.0～9.0，最適溫度為35～80℃，熱穩(wěn)定性低以及單一催化結構域等特點，對木聚糖有較高的特異性[9-11]。嗜熱網(wǎng)球菌(Dictyoglomusthermophilum)作為一種極耐熱菌，其分泌的木聚糖酶歸屬于G/11家族，通過研究其酶學特性，能夠使其較好應用于半纖維素資源生產(chǎn)食品、藥品、保健品等。筆者通過基因克隆方法，從D.thermophilum中獲得耐高溫的木聚糖酶XynB-DT，再利用該酶酶解玉米芯木聚糖，最終利用離子色譜法分析水解后的低聚木糖產(chǎn)物。對該類具有應用價值的低聚木糖進行開發(fā)和研究，不僅可充分利用資源，也能夠創(chuàng)造較高經(jīng)濟價值。

1 材料與方法

1.1 菌株質粒和培養(yǎng)基

表達載體pET-20b購于TaKaRa公司；目的基因來源菌株D.thermophilumDSM3960購于DSM(www.dsmz.de)；宿主菌大腸桿菌(Escherichiacoli)Top 10F’和BL21由南京林業(yè)大學化學工程學院微生物技術研究室保藏。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨1 g，酵母提取物0.5 g，NaCl 1 g(pH控制在中性)，加入100 mL蒸餾水，121℃滅菌20 min，培養(yǎng)基溫度降至60℃時加入相應抗生素。

1.2 主要試劑

dNTP、Ex Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、DL5000 DNA Marker、限制性內(nèi)切酶EcoRI、NotI等購于TaKaRa公司；胰蛋白胨、酵母提取物購于Oxoid公司；櫸木木聚糖(Beechwood)標準品購于Sigma公司；凝膠回收試劑盒、質粒小提試劑盒、氨芐青霉素、核酸染料等購自于南京天為公司；引物合成及測序由南京思普金公司完成。

1.3 主要儀器

上海智城ZHWY-2102C搖床，日本TOMY SX-500自動蒸氣滅菌鍋，德國Eppendorf公司臺式高速冷凍離心機5415R，德國Eppendorf公司梯度PCR儀，美國Bio-rad公司凝膠成像系統(tǒng)，美國Molecular Devices公司全波長酶標儀SpectraMax190。

1.4 試驗方法

1.4.1 引物設計

根據(jù)NCBI上公布的D.thermophilumDSM3960的xynB-DT基因序列設計引物如下：xynB-DT-f1(CCGGAATTCATGTTTCTTAAAAAACTTA)和xynB-DT-r1(TTGCGGCCGCTTACTGTATCAAC)。下劃線部分分別為EcoRI和NotI酶切位點。

1.4.2 木聚糖酶基因的克隆

將合成的引物用TE buffer稀釋成10 μmol/L工作液，以D.thermophilumDSM3960基因組DNA為模板，用引物對xynB-DT進行PCR擴增。PCR體系為：D.thermophilumDSM3960基因組DNA 1.0 μL，上下游引物(10 μmol/L)各2.0 μL，dNTP Mixture 4.0 μL，10×Ex Taq buffer(Mg2+free)5.0 μL，MgCl24.0 μL，Ex Taq酶(5 U/μL)0.5 μL，ddH2O 31.5 μL。

1.4.3 pET-20b-xynB-DT表達載體的構建及表達

割膠回收基因片段xynB-DT，用限制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI分別對目的基因片段和大腸桿菌表達載體pET-20b進行雙酶切后連接，構建表達載體pET-20b-xynB-DT。將表達載體轉化到大腸桿菌E.coliTop 10F’和E.coliBL21感受態(tài)細胞中，將重組菌接入到含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)平板中37℃過夜培養(yǎng)，篩選出陽性重組菌。挑選陽性單菌落至5 mL含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，在37℃，180 r/min條件下恒溫過夜培養(yǎng)，至OD600達到0.6～0.8時，加入終濃度為0.1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，28℃誘導培養(yǎng)4 h后，離心收集菌體，用50 mmol/L pH為7.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液重懸后，超聲破碎至菌液澄清，在4℃條件下10 000 r/min離心5 min，收集上清液即為胞內(nèi)酶液。

1.4.4 重組木聚糖酶的表達條件優(yōu)化

挑取單菌至5 mL LB培養(yǎng)基中，在37℃，180 r/min條件下恒溫培養(yǎng)12 h。轉接于50 mL LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)至OD600為0.8，加入終濃度分別為0.005，0.01，0.02，0.05和0.1 mmol/L的IPTG，28℃下誘導4 h，以不添加IPTG為對照；選定IPTG濃度為0.01 mmol/L，在28℃條件下分別誘導2，4，6和8 h，以0 h為對照；選定IPTG濃度為0.01 mmol/L，誘導時間為4 h，改變誘導溫度20，24，28，32和37℃。

1.4.5 重組木聚糖酶的純化、酶活測定及SDS-PAGE分析

重組蛋白用鎳親和試劑盒純化。Ni柱平衡后，將粗酶液以1 mL/min速率上樣，然后使用平衡緩沖液以同樣速率洗去未吸附的蛋白質和雜質，使用200 mmol/L咪唑緩沖液進行洗脫，并收集蛋白。將收集的酶液透析除鹽后進行酶活測定和SDS-PAGE分析。

以Beechwood木聚糖為底物，采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)法[12]測定純化后的木聚糖酶XynB-DT的活性。反應體系為：100 μL檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液(pH 6.5, 50 mmol/L)，50 μL 1%底物在85℃下預熱5 min，加入50 μL酶液，85℃下反應30 min后加入300 μL DNS混勻，煮沸計時5 min后混勻，于540 nm波長處測定其吸光度。以有底無酶作為對照。

SDS-PAGE試驗方法參照分子生物學實驗指南進行[13]。取500 μL酶液，加入500 μL的2×蛋白電泳緩沖液，煮沸計時5 min后離心。取15 μL上清液進行SDS-PAGE電泳。

1.4.6 重組木聚糖酶酶學性質分析

最適反應溫度及溫度穩(wěn)定性測定：在60，65，70，75，80，85和90℃溫度下，分別測定木聚糖酶酶活，以測定的酶活最高為100%計算相對酶活；在最適pH條件下，于60，70，80和90℃條件下分別保溫20，40，60，80，100和120 min，以未育溫的木聚糖酶活力為相對100%。

最適反應pH及pH穩(wěn)定性測定：在最適溫度條件下，分別測定pH 5.0～7.5條件下的酶活力，以測定的最高酶活力為相對100%，根據(jù)各pH條件下酶活力大小確定重組木聚糖酶的最適反應pH；在不含底物條件下，將重組木聚糖酶置于不同pH(5.0～7.5)的檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液中，于4℃保存24 h，在最適溫度及pH條件下測定其殘余酶活力，以未經(jīng)過pH處理酶的酶活力為相對100%。

1.4.7 重組木聚糖酶水解玉米芯木聚糖條件優(yōu)化

玉米芯木聚糖提取方法[14]：風干玉米芯粉碎至40～60目(420～250 μm)，加入10%的NaOH溶液至固液比為1∶10，在121℃條件下抽提1 h后抽濾，用適量水洗滌抽濾渣1～2遍。合并所有液體，使用鹽酸中和至pH為7.0，離心后沉淀物用蒸餾水洗至乳白色，烘干粉碎后即為玉米芯木聚糖。樣品用4%硫酸水解，混勻后在121℃下水解1 h，調節(jié)pH至中性，離心取上清液測定總還原糖，將所測還原糖質量濃度乘以木聚糖聚合系數(shù)0.88，即得到木聚糖質量。

重組木聚糖酶酶解玉米芯木聚糖條件優(yōu)化：玉米芯木聚糖底物質量濃度為1.25 mg/mL，以純化后的XynB-DT為酶解用酶，以還原糖質量濃度為評價指標，研究溫度(30，40，50，60，70和80℃)、pH(5.0，5.5，6.0，6.5，7.0和7.5)、加酶量(50，100，200，400，800和1 000 U/g)和時間(2，4，6，8，10，12，14和16 h)對酶解的影響，優(yōu)化酶解條件，所有條件均設置3組平行試驗。酶解率和低聚木糖得率根據(jù)以下公式計算：

酶解率=(還原糖×0.88)/玉米芯木聚糖質量濃度×100%

低聚木糖得率=(x2+x3+x4+x5+x6)/玉米芯木聚糖質量濃度×100%

式中，x2、x3、x4、x5和x6分別為木二糖、木三糖、木四糖、木五糖和木六糖的質量濃度，mg/mL。

2 結果與分析

2.1 木聚糖酶基因的克隆及表達載體構建

根據(jù)NCBI網(wǎng)站公布的來源于D.thermophilumDSM3960的xynB-DT基因序列設計特異性引物(Genbank：CP001146.1)，擴增出xynB-DT基因片段，全長1 083 bp，該基因編碼361個氨基酸。該基因與來源于Caldicellulosiruptorsp.F32和Paenibacilluscurdlanolyticus的木聚糖酶基因分別具有80%和56%的同源性。將xynB-DT基因片段連接到大腸桿菌表達質粒pET-20b中，構建重組質粒pET-20b-xynB-DT(圖1)，載體轉化大腸桿菌E.coliTop 10F’中，篩選陽性克隆。

對重組質粒進行EcoRI和NotI雙酶切驗證(圖1)，一條在3 000 bp左右，為切去xynB-DT基因的pET-20b片段；另一條在1 000 bp左右的條帶為xynB-DT基因的片段，說明此細菌木聚糖酶的基因已插入到pET-20b載體上。

Lane1：DL5000 Marker；Lane2：重組質粒雙酶切產(chǎn)物圖1 表達載體pET-20b-xynB-DT的構建及雙酶切驗證圖Fig. 1 Construction and double enzyme digestion of expression vector pET-20b-xynB-DT

2.2 重組木聚糖酶表達條件優(yōu)化

在不同的誘導劑IPTG濃度、誘導時間和誘導溫度條件下，測定重組木聚糖酶酶活力，以最高酶活力為100%，結果如圖2所示。重組木聚糖酶誘導表達的最佳條件分別為：在32℃條件下，添加0.02 mmol/L的IPTG，誘導6 h后所測木聚糖酶酶活最高，達到30.6 U/mL，表達量在木聚糖酶大腸桿菌表達水平下位居前列[15-16]。

圖2 重組木聚糖酶表達條件優(yōu)化Fig. 2 Condition optimization of expression of recombinant xylanase

2.3 目的蛋白純化及重組木聚糖酶的酶學性質

誘導6 h后的菌液離心收集，并超聲破碎后,經(jīng)過鎳親和柱純化得到電泳純的木聚糖酶XynB-DT(表1)。結果顯示，經(jīng)鎳親和柱純化后，最終的酶得率為73%。透析除鹽后進行SDS-PAGE分析(圖3)和木聚糖酶酶學性質測定。SDS-PAGE分析的結果表明，誘導的重組菌具有明顯蛋白條帶，經(jīng)85℃熱處理后，已有較大部分雜蛋白被去除，說明該細菌木聚糖酶蛋白純化手段簡單。經(jīng)鎳柱純化后得到一條清晰單一的XynB-DT蛋白條帶，且目的蛋白條帶在40～55 ku范圍內(nèi)，與理論蛋白分子量接近，由此可知，重組木聚糖酶基因已在大腸桿菌中成功表達。

表1 重組木聚糖酶XynB-DT的純化

利用純化后的重組木聚糖酶進行酶學性質分析，結果如圖4。以1% Beechwood xylan為底物，在pH 5.0條件下，測定溫度60～90℃下的酶活性。由圖4a可知，重組木聚糖酶的最適反應溫度為85℃，在70～90℃內(nèi)均能保持80%以上相對酶活力；而由圖4b可見，該重組木聚糖酶在60～80℃下 具有較好穩(wěn)定性，保溫120 min后酶活基本未變化。

M：蛋白上樣Marker；1：帶有空載質粒pET-20b的大腸桿菌；2：細胞破碎后粗酶液；3：85℃熱變性60 min蛋白；4：鎳柱純化后蛋白圖3 重組木聚糖酶的SDS-PAGE圖Fig. 3 The SDS-PAGE of recombinant xylanase

在90℃下保溫60 min仍能保持50%以上相對酶活力。在溫度85℃下，測定pH 5.0～7.5條件下的酶活性。由圖4c可知，該木聚糖酶在pH 5.5～7.0范圍內(nèi)均能維持80%以上活性，當pH高于7.0后，活性下降趨勢明顯。該重組木聚糖酶在pH 5.0～7.5緩沖液中4℃下放置24 h后，仍能保持90%以上活性(圖4c)。

以不同濃度的木聚糖為底物測定重組酶的酶活，采用雙倒數(shù)法計算該酶的米氏常數(shù)Km。1/s為橫坐標(底物濃度的倒數(shù))，1/v為縱坐標(酶促反應速度的倒數(shù))，該直線在x軸上的截距為1/Km值，y軸上的截距為1/Vmax值，結果如圖4d所示。重組木聚糖酶的Km和Vmax分別為5.63 mg/mL和1.572 mmol/(L·min-1)。

a)最適溫度；b)溫度穩(wěn)定性；c)最適pH和pH穩(wěn)定性；d)反應動力學方程圖4 重組木聚糖酶的酶學性質Fig. 4 Enzyme characterization of recombinant xylanase

2.4 玉米芯木聚糖的制備及酶解條件研究

玉米芯中除含有高達35%的木聚糖外，還含有大量纖維素、木質素、脂肪、蛋白質等物質，它們通過共價鍵、氫鍵等作用力緊密結合，需通過物理、化學等手段進行預處理，手段一般包括高溫蒸煮浸提、酸法提取、堿法提取等[17]。本試驗通過堿法提取玉米芯木聚糖，從50 g玉米芯中得到木聚糖提取物10 g。

溫度和pH對酶的酶解有較大影響。一定溫度范圍內(nèi)，隨溫度升高，酶-底物中間體分解轉化為產(chǎn)物的速度加快。當溫度過高則會降低酶的穩(wěn)定性，使其失活，從而影響酶的反應速率。參考本文木聚糖酶的酶學性質，選取30，40，50，60，70和80℃測定其酶解的最適溫度(底物質量濃度為1.25 mg/mL，酶用量為200 U/g，pH為6.5，酶解12 h)，結果如圖5a所示。溫度對酶解率影響較大，最適酶解溫度為70℃，當溫度過低時不利于酶解反應發(fā)生，高于70℃后，酶解率開始下降。最適酶解溫度條件下，選取pH為5.0，5.5，6.0，6.5，7.0和7.5測定其酶解的最適pH(底物質量濃度為1.25 mg/mL，酶用量為200 U/g，酶解12 h)。由圖5b可知，在pH為5.0～6.5范圍內(nèi)，其酶解率維持在35%以上，而當pH逐漸升高為弱堿性時，其酶解率下降，當pH為6.0時，酶解效率最高。

a)最適溫度；b)最適pH；c)最適酶用量；d)最適酶解時間圖5 重組木聚糖酶酶解玉米芯木聚糖的條件優(yōu)化Fig. 5 Condition optimization of degradation of corncob xylan by recombinant xylanase

加酶量對酶解率也有顯著影響，當加酶量不足時，底物酶解不充分，而加酶量過大則導致生產(chǎn)成本增加，因此應選擇合適的加酶量。選取酶用量為50，100，200，400，800和1 000 U/g(底物質量濃度為1.25 mg/mL，溫度為70℃，pH為6.0，酶解12 h)，結果如圖5c所示。隨酶用量增加，酶解率逐漸升高，但當酶用量高于400 U/g時，酶解率增加趨勢平緩。這可能是因為半纖維素分子與木聚糖酶的結合位點數(shù)量有限，當結合位點全部被占據(jù)后，過多用量反而增加了酶與底物的無效吸附，從而降低了酶解率。因此，從降低生產(chǎn)成本方面考慮，酶用量選擇400 U/g較為合適。

酶解反應時間對酶解效果具有一定影響，酶解時間過短，則底物酶解不充分，但受酶穩(wěn)定性的限制，在70℃條件下經(jīng)過一定反應周期后酶逐漸失活，不利于低聚木糖產(chǎn)生，因此應選擇合適的酶解時間。當?shù)孜镔|量濃度1.25 mg/mL、溫度70℃、pH 6.0和加酶量400 U/g的條件下酶解2，4，6，8，10，12，14 和16 h后分別取樣，結果如圖5d所示，酶解率隨酶解時間的延長而升高，超過12 h后，酶解率變化不大。因此，最佳的反應時間為12 h。

x1：木糖；x2：木二糖；x3：木三糖；x4：木四糖圖6 重組木聚糖酶水解玉米芯木聚糖產(chǎn)物的離子色譜分析圖Fig. 6 Ion chromatography analysis diagram ofdegradation products of corncob xylan

目前，聚合度在2～4范圍內(nèi)的功能性低聚木糖在食品中應用較為廣泛，它們能夠促進腸道內(nèi)有益菌增殖，改善腸道功能，因此作為新一代生物制品具有較大應用潛力[18]。在最適條件下，重組木聚糖酶對玉米芯木聚糖的水解產(chǎn)物用離子色譜進行分析，結果如圖6所示。酶解12 h后，酶解產(chǎn)物以低聚木糖為主，其中木二糖和木三糖質量濃度分別達到279.381 5和275.228 4 mg/L，占總糖的90%以上，且只有少量木糖被檢出，而在G10族木聚糖酶的酶解產(chǎn)物中木糖含量則偏高[19]。最終的酶解得率為44.3%，與文獻報道結果相近[20-21]。本研究中得到的重組木聚糖酶具有較好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性，且酶解產(chǎn)物中木糖含量少，說明其在生物轉化木質纖維原料生產(chǎn)低聚木糖方面具有較大應用前景。

3 結 論

本研究以來源于D.thermophilumDSM3960的基因組為模板，對木聚糖酶XynB-DT進行克隆、表達研究，結論如下：

1)D.thermophilum來源的木聚糖酶基因全長1 083 bp，共編碼361個氨基酸，該基因編碼蛋白質屬糖苷水解酶G11家族。成功構建大腸桿菌表達質粒pET-20b-xynB-DT，優(yōu)化其表達條件：32℃條件下，添加0.02 mmol/L的IPTG誘導6 h后產(chǎn)酶量達到30.6 U/mL。

2)經(jīng)鎳親和柱純化后得到電泳純的重組木聚糖酶，該酶的最適反應溫度為85℃，最適反應pH為6.5，在pH為5.0～7.5范圍內(nèi)具有較好穩(wěn)定性，在90℃條件下保溫120 min，剩余酶活達50%以上，該酶的Km和Vmax分別為5.63 mg/mL和1.572 mmol/(L·min-1)。

3)利用重組木聚糖酶對玉米芯木聚糖進行酶解，獲得最佳酶解條件為：溫度70℃，pH 6.0，加酶量400 U/g，酶解12 h。利用HPLC對酶解產(chǎn)物進行分析，產(chǎn)物中含有較多木二糖和木三糖，分別占水解產(chǎn)物總量的49.4%和48.7%。因此，該重組木聚糖酶不但具有優(yōu)良的酶學性質，且在水解玉米芯木聚糖的產(chǎn)物中以低聚木糖為主，木糖含量少，較利于低聚木糖的純化，顯示了其在制備低聚木糖方面具有較大應用潛力。

本研究可為XynB-DT木聚糖酶工業(yè)化生產(chǎn)低聚木糖提供一定的理論基礎，促進其工業(yè)化應用。

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Cloning and expression of a thermophile GH11 xylanase gene andits application in xylooligosaccharide production

LI Qi, CHEN Mingzhen, ZHAO Linguo*

(CollegeofChemicalEngineering,NanjingForestryUniversity;JiangsuKeyLaboratoryofBiomassBasedGreenFuelsandChemicals,Nanjing210037,China)

The GH11 endo-1, 4-xylanase gene,xynB-DTfromDictyoglomusthermophilumDSM3960 was cloned and expressed inEscherichiacoli. The full-length gene contained 1 083 bp, which encoded 361 amino acids. The recombinant plasmid pET-20b-xynB-DTwas reconstructed and expressed in theE.coliBL21 successfully. In addition, the pure protein was obtained by Ni-NTA affinity column, and the molecular weight of protein was approximately 40 ku. The activity of recombinant xylanase was 30.6 U/mL in LB medium by IPTG induction. The properties of XynB-DT were analyzed and the results showed that the optimum temperature of this recombinant enzyme was 85℃, and the relative enzyme activity was higher than 90% under 60℃ in 120 min and more than 50% under 90℃ in 120 min. Correspondingly, the optimum pH was 6.5, and it preserved enzyme activity lower than 90% in the range of 5.0-7.5 for pH. TheKmandVmaxfor beechwood xylan was 5.63 mg/mL and 1.572 mmol/(L·min-1), respectively. Then, taking the corncobs xylan as the substrate, this study was focused on the hydrolyzing conditions and the hydrolysis products identified by ion chromatography, and the results showed that after 12 h, under 70℃, pH 6.0 with the enzyme dosage of 400 U/g, the final hydrolysis yield was 44.3%. As the major hydrolytic products, xylobiose and xylotriose were excised from corncob xylan by XynB-DT and only a little of amount of xylose was detected during the hydrolysis. All the results made XynB-DT be attractive for potential application in xylooligosaccharides production.

D.thermophilum; xylanase; gene cloning; hydrolysis

2016-10-28

2017-02-09

江蘇省高校自然科學研究重大項目(13KJA220004)；江蘇省“333高層次人才培養(yǎng)工程”專項資助項目 (BRA2015317)；江蘇省“六大人才高峰”資助項目(2014-JY-011)；江蘇省優(yōu)勢學科建設工程資助項目(PAPD)。

李琦，女，實驗師，研究方向為微生物發(fā)酵及酶工程。通信作者：趙林果，男，教授。E-mail:lgzhao@njfu.edu.cn

Q819

A

2096-1359(2017)04-0063-07