張 玲， 劉 娜， 向 銳， 朱翠婷， 劉雅嘉， 易 英， 殷以華

(武漢理工大學(xué) 化學(xué)化工與生命科學(xué)學(xué)院， 武漢 430070)

羧甲基殼聚糖納米膠束的制備與光響應(yīng)性研究

張 玲， 劉 娜， 向 銳， 朱翠婷， 劉雅嘉， 易 英， 殷以華*

(武漢理工大學(xué) 化學(xué)化工與生命科學(xué)學(xué)院， 武漢 430070)

智能響應(yīng)性聚合物膠束作為藥物控釋傳遞系統(tǒng)的載體引起廣泛關(guān)注，其中光刺激因?yàn)榭煽匦愿摺⑶鍧嵏咝У葍?yōu)點(diǎn)被廣泛研究.該文以丁二酸酐為連接臂將1-芘甲醇(PyM)接枝到羧甲基殼聚糖(CMCS)的氨基上制得兩親性大分子(PMS-g-CMCS)，然后在水溶液中自組裝成光響應(yīng)納米膠束.采用動(dòng)態(tài)光散射(DLS)和透射電鏡(TEM)表征膠束的大小和形態(tài)，并研究光刺激前后膠束的大小變化；通過(guò)核磁和熒光研究膠束的光響應(yīng)機(jī)制.結(jié)果表明該膠束為類球形核-殼結(jié)構(gòu)，粒徑約200 nm，且具有較好儲(chǔ)存穩(wěn)定性；在紫外(UV)光照下，能發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，其光響應(yīng)機(jī)制可歸因于連接PyM的酯鍵斷裂.膠束顯示出可用作疏水性藥物或農(nóng)藥光控釋放載體的潛力.

羧甲基殼聚糖； 光響應(yīng)； 納米膠束

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1試劑和儀器

試劑：羧甲基殼聚糖(CMCS，Mη=5.0×105Da，脫乙酰度為93.0%)，按報(bào)道[8]的方法制備，電位滴定法測(cè)得其羧甲基取代度為0.87.琥珀酸酐，1-芘甲醇(PyM)和尼羅紅購(gòu)買于Acros Organics，使用前均未經(jīng)純化處理.其他分析級(jí)試劑購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司.

儀器：傅立葉變換紅外光譜儀(Nexus)、核磁共振波譜儀(AVANCEIII型)、透射電子顯微鏡(TEM，JSM-6700F)、動(dòng)態(tài)光散射儀(Nano-ZS3600)和熒光光譜儀(QM-4).實(shí)驗(yàn)中使用的光源為UVA 340 nm(100W)的紫外光.

1.2光響應(yīng)聚合物(PMS-g-CMCS)的制備

取1-芘甲醇(PyM)(0.60 mmol，139.4 mg)溶于氯仿(30 mL)，然后向該溶液中加入琥珀酸酐(0.78 mmol，78.1 mg)和4-(N， N-二甲基氨基)吡啶(DMAP)(0.15 mmol，18.0 mg)，在55℃下攪拌回流反應(yīng)20 h.反應(yīng)完成后，用HCl溶液(1.0 mol·L-1)洗滌混合液以除去DMAP，然后用現(xiàn)配的飽和碳酸氫鈉溶液萃取反應(yīng)液，接著用乙醚洗滌水相以除去殘余的氯仿，再加HCl(1.0 mol·L-1)酸化水相溶液至pH 4.0，此時(shí)有固體粉末析出，經(jīng)過(guò)濾和真空干燥，得到產(chǎn)物1-芘甲基琥珀酸酯(PMS).取制得的PMS (33.2 mg，0.10 mmol)溶于DMSO(3.0 mL)中，分別加入EDC (23.0 mg，0.12 mmol)和NHS(11.5 mg，0.10 mmol)，活化2 h后，將反應(yīng)液緩慢滴加到羧甲基殼聚糖水溶液(110.8 mg CMCS，15.0 mL H2O)中，于25℃條件下攪拌24 h.將反應(yīng)液于去離子水中透析，旋蒸，凍干后得到光響應(yīng)聚合物 (PMS-g-CMCS).上述所有步驟均避光操作.

改變1-芘甲基琥珀酸酯和CMCS的葡萄糖單元的投料比，根據(jù)上述方法，合成投料摩爾比為1∶7，1∶5和1∶3的樣品，分別命名為PMS-g-CMCS-1，PMS-g-CMCS-2和PMS-g-CMCS-3.采用吸光光度法測(cè)得PMS的取代度分別為0.09，0.13和0.20.

“實(shí)際上，我并不理解為什么這些公司不愿在基因編輯產(chǎn)品上明確標(biāo)識(shí)?！睗h森說(shuō)，“沒(méi)有明確標(biāo)識(shí)反而會(huì)使消費(fèi)者疑心他們?cè)陔[藏某些東西，而且消費(fèi)者對(duì)新產(chǎn)品的接受程度也取決于此?！?/p>

1.3光響應(yīng)聚合物膠束的制備

取PMS-g-CMCS (10.0 mg) 溶于5.0 mL磷酸鹽緩沖溶液(0.02 mol·L-1，pH 7.4)中，超聲(60 W)3 min(開(kāi)2 s，關(guān)2 s)，將所得溶液通過(guò)0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾得到膠束溶液.上述所有操作均在黑暗條件下進(jìn)行.由PMS-g-CMCS-1，PMS-g-CMCS-2和PMS-g-CMCS-3制備的膠束樣品分別命名為PM-1，PM-2和PM-3.

1.4膠束的表征

1.4.1臨界膠束濃度(CMC)的測(cè)定 取等量尼羅紅分別加入到0.003 0 mg·mL-1、0.005 0 mg·mL-1、0.007 0 mg·mL-1、0.010 0 mg·mL-1、0.050 0 mg·mL-1、0.100 0 mg·mL-1、0.200 0 mg·mL-1和0.400 0 mg·mL-1PMS-g-CMCS聚合物溶液中，使尼羅紅的最終濃度均為1.0×10-5mol·L-1，然后采用熒光光譜儀依次測(cè)定其熒光發(fā)射光譜.

1.4.2形態(tài)、粒徑與Zeta電位的測(cè)定 配制2 mg·mL-1pH為7.4的納米膠束溶液滴加到置于濾紙上的銅片上，待其干燥后，用TEM觀察聚合物膠束的形態(tài)結(jié)構(gòu)；通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射儀(λ=512 nm，室溫)檢測(cè)聚合物膠束樣品(PM-1、PM-2、PM-3)的粒徑和Zeta電位.

1.5膠束的儲(chǔ)存穩(wěn)定性研究

將聚合物膠束樣品溶解在PBS溶液(1.0 mol·L-1，pH 7.4)中，避光放置30 d，用動(dòng)態(tài)光散射儀觀察膠束粒徑，電位以及分布的變化.

1.6膠束的光響應(yīng)性研究

通過(guò)DLS和TEM觀測(cè)膠束在光照前后的大小和形態(tài)變化來(lái)研究膠束的光響應(yīng)性.以光照前的樣品為對(duì)照，取10.0 mL膠束樣品溶液(2.0 mg·mL-1)在25℃下用紫外光照射20 min，然后通過(guò)DLS和TEM測(cè)定溶液中膠束的粒徑和形態(tài)變化.

通過(guò)1H NMR研究PMS-g-CMCS的光解機(jī)理.將PMS-g-CMCS-2溶于DMSO-d6/D2O(1∶3，V/V)，暴露于紫外光下20 min，然后用于1H NMR測(cè)量.使用熒光分光計(jì)來(lái)進(jìn)一步研究膠束的光響應(yīng)性：取溶解在pH 7.4 PBS中的PM-2(1.0 mg·mL-1)樣品進(jìn)行紫外光照處理20 min，測(cè)定光照前后的熒光強(qiáng)度.

2結(jié)果與討論

2.1聚合物(PMS-g-CMCS)的合成和表征

圖1顯示了PMS-g-CMCS的合成路徑.首先，PyM在DMAP催化下與丁二酸酐開(kāi)環(huán)酯化制得PMS，然后該化合物在碳二亞胺催化作用下嫁接到CMCS的氨基上獲得目標(biāo)化合物PMS-g-CMCS.采用紅外圖譜表征了CMCS、PMS和PMS-g-CMCS的結(jié)構(gòu).從圖2可看出，CMCS的主要特征譜帶(曲線a)分別位于3 426 cm-1(O-H伸縮與N-H伸縮的重疊吸收)，2 930 cm-1(C-H伸縮)，1 600 cm-1(COO-伸縮振動(dòng)與N-H彎曲振動(dòng)的重疊)，1 420 cm-1(COO-拉伸)，1 117 cm-1(β(1→4)橋接O的拉伸)，1 339 cm-1(C-N拉伸).與CMCS相比，PMS-g-CMCS(見(jiàn)曲線c)在1 730 cm-1(酯基的C=O伸縮)和1 072 cm-1(酯基的C-O伸縮)的新吸收帶以及觀察到在1 522 cm-1處的吸收增加(N-H彎曲)，表明PMS成功地接枝在CMCS上.與PMS(見(jiàn)曲線b)相比，PMS-g-CMCS在1 286 cm-1處吸收強(qiáng)度降低和在1 072 cm-1處的吸收增加也證明了PMS-g-CMCS被成功合成.

圖1 PMS-g-CMCS的合成路徑Fig.1 Schematic illustration of the synthesis route of PMS-g-CMCS

(a)CMCS，(b)PMS，(c)PMS-g-CMCS圖2 紅外圖譜Fig.2 FT-IR spectra

圖3描述了CMCS、PMS和PMS-g-CMCS的1H NMR譜圖.對(duì)于CMCS(見(jiàn)曲線a)，位于3.23～3.90 (H-2，3，4，5，6)處的信號(hào)峰歸屬于葡糖胺環(huán)上的質(zhì)子，在2.10和4.52 處的特征峰分別歸屬于N-乙酰葡糖胺的CH3和羧甲基的CH2.對(duì)于PMS(見(jiàn)曲線b)，出現(xiàn)在8.38～8.10(m，9H)的特征峰歸屬于芘環(huán)質(zhì)子，同時(shí)在5.86(s，2H)和2.68 (4H，CH2CH2)處的特征吸收峰對(duì)應(yīng)于芘亞甲基質(zhì)子和琥珀酸亞甲基質(zhì)子.與曲線a相比，曲線c中出現(xiàn)在8.38～8.10 區(qū)域以及在5.8和2.46 處的新信號(hào)峰顯示PMS成功地接枝到CMCS主鏈上.

a，CMCS；b，PMS；c，PMS-g-CMCS，溶劑DMSO-d6/D2O(1∶3，V/V )；d，光照20 min后PMS-g-CMCS，溶劑為 DMSO-d6/D2O (1∶3， V/V)圖3 1H NMR圖譜Fig.3 1H NMR spectra

2.2膠束的形成與表征

圖4描述了兩親性PMS-g-CMCS形成膠束的過(guò)程，帶有PMS側(cè)基的疏水鏈段相互聚集形成內(nèi)核，帶有羧基的親水鏈段向外伸展形成殼.圖5顯示了探針?lè)肿幽崃_紅在618 nm處的熒光強(qiáng)度對(duì)PMS-g-CMCS濃度的對(duì)數(shù)(logC)曲線圖.3個(gè)膠束樣品的CMC值分別為0.058 mg/mL，0.027 mg/mL和0.020 mg/mL，顯示出CMC與PMS的取代度成反比：PMS取代度越高，CMC值越小，PMS-g-CMCS更易于在較低濃度形成納米膠束.

圖4 PMS-g-CMCS的自組裝過(guò)程以及膠束的光解Fig.4 The assembly process of PMS-g-CMCS and the photolysis process of PMS-g-CMCS micelle

TEM觀察也提供了膠束形成的直接證據(jù).圖6(a)顯示膠束具有核-殼結(jié)構(gòu)的類球形，且直徑約為219.2±12.5 nm.

2.3膠束的儲(chǔ)存穩(wěn)定性

通過(guò)DLS測(cè)量膠束樣品在pH7.4溶液中儲(chǔ)存30 d后的平均粒徑(MD)，分布系數(shù)(PDI)和Zeta電位來(lái)研究膠束的儲(chǔ)存穩(wěn)定性.如表1所示，所有樣品在儲(chǔ)存前后沒(méi)有觀察到MD和PDI值的顯著變化，表明膠束具有高儲(chǔ)存穩(wěn)定性.這一結(jié)果可歸因于PMS-g-CMCS側(cè)鏈上芘基團(tuán)之間的疏水相互作用和π-π堆積作用.這對(duì)于膠束到達(dá)目標(biāo)位點(diǎn)之前避免藥物泄漏具有重要意義.

圖5 熒光強(qiáng)度與膠束PMS-g-CMCS-1 (◆)， PMS-g-CMCS-2(●) 和PMS-g-CMCS-3 (▲)濃度曲線Fig.5 Emission intensity of Nile red as a function of the concentrations of PMS-g-CMCS-1 (◆)， PMS-g-CMCS-2 (●)，and PMS-g-CMCS-3 (▲)

圖6 PMS-g-CMCS膠束的透射電鏡圖(a)光照前和(b)光照后Fig.6 TEM images of the PMS-g-CMCS micelles (a) before and (b) after UV irradiation for 20 min

聚合物膠束儲(chǔ)存前儲(chǔ)存后粒徑/nm分布系數(shù)電位/mV粒徑/nm分布系數(shù)電位/mVPM-1302±16．20．133±0．06-25．8±1．10309±16．00．143±0．08-27．3±0．87PM-2228±12．70．127±0．03-29．0±0．65230±12．90．129±0．08-28．2±0．74PM-3190±12．40．131±0．08-28．0±0．13193±13．20．133±0．07-29．4±0．24

2.4膠束的光響應(yīng)性

膠束的光響應(yīng)性可通過(guò)DLS和TEM檢測(cè)膠束光照前后粒徑的變化來(lái)研究.光照前，采用DLS測(cè)量的各樣品的粒徑見(jiàn)表1.在UV光照射20 min后，各樣品的粒徑分別降低至110±11.8 nm，140±12.8 nm和150±13.2 nm，這意味光解導(dǎo)致了膠束結(jié)構(gòu)的破壞.然而，由于在側(cè)鏈中光解產(chǎn)生的羧基可以與CMCS主鏈上的胺基形成離子交聯(lián)[9]，通過(guò)DLS檢測(cè)到新的納米聚集體.TEM也檢測(cè)了膠束在UV光下的粒徑大小變化.如圖6(a)所示，基于PMS-g-CMCS-2的膠束在沒(méi)有光照的情況下粒徑為219±12.4 nm，相比之下，在UV照射20 min后其粒徑減小到43.4±6.8 nm(圖6(b)).光照前后的粒徑差大于DLS檢測(cè)到的結(jié)果，這可歸因于TEM測(cè)試前的制樣過(guò)程，膠束發(fā)生了收縮.

1H NMR證實(shí)PMS-g-CMCS的光解機(jī)制為芘甲醇酯鍵的斷裂.如圖3中的曲線c所示，由于PMS-g-CMCS在D2O/DMSO-d6(3∶1)中完全溶解，可清楚地觀察到8.27～7.99處對(duì)應(yīng)于芘基團(tuán)的質(zhì)子信號(hào)以及5.88 (2H，-CH2Pyrene)處連接芘基團(tuán)的亞甲基質(zhì)子信號(hào).然而，當(dāng)混合溶液在UV光下照射20 min時(shí)，5.88 的質(zhì)子信號(hào)移動(dòng)到5.47 (曲線d)，這正是光解生成的芘甲醇亞甲基的質(zhì)子信號(hào).

為了進(jìn)一步證明膠束能響應(yīng)UV刺激發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，研究了膠束中芘基團(tuán)的熒光發(fā)射光譜.如圖7所示，在UV照射之前，PM-2溶液在470 nm處顯示出芘的準(zhǔn)分子發(fā)射峰，表明芘基團(tuán)的聚集和疏水核的形成.照射20 min后，準(zhǔn)分子發(fā)射強(qiáng)度明顯減弱，而歸因于PyM單體在380～410 nm范圍內(nèi)的發(fā)射帶強(qiáng)度增加，表明膠束疏水核的解聚，同時(shí)也進(jìn)一步證實(shí)了由于光解芘甲氧基從PMS-g-CMCS分子鏈上脫落下來(lái).

圖7 PM-2在紫外光照前后的熒光光譜Fig.7 Fluorescence emission spectra of the PM-2 solution before and after UV light irradiation

3結(jié)論

本文通過(guò)將光響應(yīng)基團(tuán)接枝到羧甲基殼聚糖骨架上，再通過(guò)自組裝得到納米膠束.TEM觀察顯示膠束為約200 nm的核-殼結(jié)構(gòu)，且分布均勻；熒光探針測(cè)定表明PMS-g-CMCS中光響應(yīng)基團(tuán)的取代度與臨界膠束濃度呈反比；DLS研究表明膠束具有良好的儲(chǔ)存穩(wěn)定性.TEM、DLS研究表明膠束具有良好的光響應(yīng)性，核磁和芘基團(tuán)的熒光發(fā)射光譜研究證實(shí)其光響應(yīng)性歸因于連接芘甲氧基的酯鍵斷裂.這些結(jié)果為該膠束用作疏水性藥物或農(nóng)藥載體提供了理論依據(jù).

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Preparation and study of photo-responsive nanomicelles based on carboxymethyl chitosan

ZHANG Ling， LIU Na， XIANG Rui， ZHU Cuiting， LIU Yajia， YI Ying， YIN Yihua

(School of Chemistry， Chemical Engineering and Life Science， Wuhan University of Technology， Wuhan 430070)

The intelligent response polymer micelles have attracted much attention as a carrier of drug controlled release system. Light stimulation is of great interest because of its advantages such as high controllability， clean and high efficiency. In this thesis， 1-pyrenemethyl succinate (PMS) was prepared by the esterification of 1-pyrenemethanol with succinic anhydride， which was grafted onto the carboxymethyl chitosan backbone to obtain photoresponsive polymer (PMS-g-CMCS)， which could self-assemble into light-responsive polymeric micelles in aqueous condition. The size and morphology of the micelles were characterized and their changes before and after light stimulation were studied by dynamic light scattering (DLS) and transmission electron microscopy (TEM). Their photoresponsive mechanism was also investigated by fluorescence and1H NMR. The results showed that the micelles are spherical-core structures with a diameter of about 200 nm and exhibiteded good storage stability. Under the UV light stimulus， the structure will be able to chang. The photoresponsive mechanism can be attributed to the breakage of ester bond linked to PyM. These properties of micelles show the potential for use as a light controlled release carrier of hydrophobic drug or pesticide.

carboxymethyl chitosan; photo responsiveness; nanomicelle

2017-03-11.

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(51373130); 武漢理工大學(xué)本科生創(chuàng)新研究基金(2016-HS-B1-12)．

10.19603/j.cnki.1000-1190.2017.04.009

1000-1190(2017)04-0465-05

O636.9

A

*通訊聯(lián)系人. E-mail: yihuayin@aliyun.com.