楊曉云， 黃其亮， 江騰輝， 徐漢虹

(1 天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，廣東 廣州510642； 2 廣東省環(huán)境保護(hù)職業(yè)技術(shù)學(xué)校，廣東 廣州 510655； 3廣東省農(nóng)業(yè)有害生物預(yù)警防控中心，廣東 廣州510500)

印楝素在甘藍(lán)及土壤中的消解動(dòng)態(tài)

楊曉云1， 黃其亮2， 江騰輝3， 徐漢虹1

(1 天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，廣東 廣州510642； 2 廣東省環(huán)境保護(hù)職業(yè)技術(shù)學(xué)校，廣東 廣州 510655； 3廣東省農(nóng)業(yè)有害生物預(yù)警防控中心，廣東 廣州510500)

【目的】甘藍(lán)Brassicaoleracea生長(zhǎng)期施用w為0.3%的印楝素乳油，檢測(cè)印楝素在甘藍(lán)和土壤中的殘留及消解動(dòng)態(tài)?！痉椒ā坑￠卦?.05～5.00 mg·kg-1水平范圍內(nèi)取0.1、0.5、1.0 mg·kg-1添加，樣品中的印楝素經(jīng)乙腈超聲波輔助提取，弗羅里硅土固相萃取柱凈化，高效液相色譜(HPLC) 檢測(cè)，外標(biāo)法定量?！窘Y(jié)果】印楝素在甘藍(lán)中的平均回收率為88.52%～93.21%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.75%～3.55%；在土壤中平均回收率為90.69%～93.32%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.09%～3.46%。印楝素在甘藍(lán)中的殘留半衰期為0.89 d，在土壤中的殘留半衰期為2.40 d?！窘Y(jié)論】印楝素屬易降解農(nóng)藥。該施藥方法安全可靠，值得借鑒。

印楝素； 乳油； 甘藍(lán)； 土壤； 農(nóng)藥殘留； 高效液相色譜

印楝素(Azadirachtin)是一類從印楝Azadirachtaindica中分離出來(lái)的活性較強(qiáng)的化合物，它屬于四環(huán)三萜類，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其活性最好的是印楝素A，目前發(fā)現(xiàn)的活性成分還有印楝素B等[1]。印楝素是世界公認(rèn)的低毒、廣譜、高效、易降解的殺蟲(chóng)劑[2-3]。到目前為止，我國(guó)尚未出臺(tái)印楝素的最大允許殘留值及相關(guān)檢測(cè)方法，但根據(jù)歐盟地區(qū)的標(biāo)準(zhǔn)，蔬菜中印楝素的MRL為1.0 mg·kg-1。目前，分光光度法在測(cè)定印楝素總含量方面的應(yīng)用較為普遍[4-5]，但其他物質(zhì)容易對(duì)其產(chǎn)生干擾；對(duì)于較高含量的印楝素的測(cè)定，可用薄層色譜酸化香蘭素顯色法[6]；液相色譜法可用于分析植物生長(zhǎng)與印楝素的相關(guān)性[7]和茶葉中印楝素的殘留量[8]，也可分析水[9]、土壤[10]和橄欖樹(shù)Canaviumalbum[11]中印楝素的降解。

對(duì)印楝素在草莓Fragariaananassa、番茄Solanumlycopersicum等水果上的殘留已有研究報(bào)道[12-14]，而在蔬菜上的殘留則鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究根據(jù)文獻(xiàn)[15]中的方法設(shè)計(jì)田間試驗(yàn)，印楝素乳油施用于甘藍(lán)田后，采用超聲波萃取、固相萃取凈化、高效液相色譜法(High performance liquid chromatography，HPLC)測(cè)定甘藍(lán)和土壤中印楝素的殘留，記錄印楝素在甘藍(lán)及土壤中的消解動(dòng)態(tài)，以期規(guī)避農(nóng)藥殘留風(fēng)險(xiǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

Agilent1100高效液相色譜儀(配DAD 檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器、化學(xué)工作站)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器EYELAN-1100(日本EYELA公司)；超聲波清洗器KH-500(昆山創(chuàng)超聲儀器有限公司)；循環(huán)水真空泵SHB-Ⅲ；組織搗碎機(jī)MJ-25BM02C(常州博遠(yuǎn)實(shí)驗(yàn)儀器廠)；烘箱S.C.101(上海試驗(yàn)儀器廠)；萬(wàn)分之一電子天平BS210S(德國(guó)Sa RtoRius公司)；精密移液槍(德國(guó)艾本德公司)。

SPE 小柱(Florisil，標(biāo)準(zhǔn)樣品為1g)；w為95%印楝素標(biāo)準(zhǔn)品(美國(guó)Sigma公司)；甲醇和乙腈為色譜純(美國(guó)MREDA公司)；w為0.3%印楝素乳油(成都綠金生物科技有限責(zé)任公司)；乙腈、丙酮、氯化鈉、正己烷為分析純(天津富宇精細(xì)化工有限公司)，自制超純水，電阻≥18.0 MΩ。

1.2 方法

1.2.1 田間試驗(yàn)方案及樣品采集 試驗(yàn)小區(qū)面積均為30 m2，另外設(shè)空白對(duì)照區(qū)，每組3 個(gè)重復(fù)，并在各小區(qū)間進(jìn)行相應(yīng)隔斷處理。采用常規(guī)手動(dòng)噴霧器對(duì)甘藍(lán)進(jìn)行噴霧處理，1次施藥，多次取樣。施藥時(shí)間結(jié)合甘藍(lán)的害蟲(chóng)防治期和推薦采收間隔期確定。施藥劑量是5.4 g·m-2。土壤殘留消解動(dòng)態(tài)試驗(yàn)在旁邊隨機(jī)選擇的空白地進(jìn)行。于藥后1、6 h和1、2、3、4、5、7 d采集樣品。每次在每個(gè)小區(qū)內(nèi)隨機(jī)采集多于1 kg 生長(zhǎng)正常的植株，在小區(qū)內(nèi)隨機(jī)采集深度為0～10 cm處的土壤，且多于 1 kg。樣品采集后放入樣品袋，并盡快運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室在-20 ℃的冰箱中保存待測(cè)。

1.2.2 印楝素的提取 準(zhǔn)確稱取20 g 甘藍(lán)樣品放入勻漿機(jī)中并加入乙腈100 mL，高速勻漿2 min 后用濾紙過(guò)濾，將濾液加入到含有氯化鈉(6 g)的量筒中，劇烈震蕩數(shù)分鐘后靜置30 min，使乙腈和水分層，吸取上清液50 mL，加入平底燒瓶中，在40 ℃的條件下減壓濃縮處理，加V(正己烷)∶V(丙酮)=7∶3的混合液2 mL溶解，待凈化。準(zhǔn)確稱取20 g 土壤加入到三角瓶中，并加入乙腈100 mL，超聲提取30 min，過(guò)濾，將濾液加入到含有氯化鈉(6 g)的量筒中，劇烈震蕩數(shù)分鐘后靜置30 min，使乙腈和水分層，吸取上清液50 mL，加入平底燒瓶中，在40 ℃條件下進(jìn)行減壓濃縮處理，其后用甲醇定容到1 mL并經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾后，進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3 樣品凈化 預(yù)先用V(正己烷)∶V(丙酮)=7∶3的混合液5 mL活化Florisil固相萃取柱，轉(zhuǎn)移提取液到柱上，用V(正己烷)∶V(丙酮)=7∶3的混合液進(jìn)行洗脫處理，每次5 mL，共洗脫3次，然后在40 ℃條件下用氮吹儀進(jìn)行濃縮，其后用甲醇定容到1 mL并經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾后，進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4 液相色譜 色譜柱為Agilent TC-C18(5 μm)，250 mm×4.6 mm；柱溫30 ℃；流動(dòng)相為V(乙腈)∶V(水)=40∶60；流速1 mL·min-1；二極管陣列檢測(cè)波長(zhǎng)217 nm，進(jìn)樣量10 μL。定量方式采用外標(biāo)法。在上述檢測(cè)條件下印楝素的保留時(shí)間為9.80 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 印楝素在甘藍(lán)和土壤中的添加回收率及檢出限

以200 mg·kg-1印楝素標(biāo)樣測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1A所示。在0.5～5.0 mg·kg-1線性范圍內(nèi)，進(jìn)行添加回收處理，分別在空白甘藍(lán)和空白土壤中，準(zhǔn)確添加3個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0.1、0.5、1.0 mg·kg-1)的印楝素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)重復(fù)5 次，然后測(cè)定回收率，添加回收色譜圖見(jiàn)圖1B，由圖1B可知，印楝素峰形好、重現(xiàn)性較好且未見(jiàn)雜質(zhì)干擾。印楝素在土壤中平均回收率為90.69%～93.32%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.09%～3.46%，在甘藍(lán)中的平均回收率為88.52 %～93.21%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.75%～3.55%(表1)。此方法的準(zhǔn)確度和精密度均符合農(nóng)藥殘留分析的要求。該方法的最小檢出量為2 ng，印楝素的最低檢出濃度為0.02 mg·kg-1。

圖1 甘藍(lán)添加印楝素的高效液相色譜圖

Fig.1 HPLC chromatogram of cabbage sample spiked with azadirachtin

表1 印楝素在甘藍(lán)和土壤的添加回收率Tab.1 Recovery rates of azadirachtin in cabbage and soil

2.2 印楝素在甘藍(lán)和土壤中的消解動(dòng)態(tài)

空白對(duì)照組的液相色譜圖見(jiàn)圖2。表2為0.3%(w)印楝素乳油在甘藍(lán)和土壤上的消解動(dòng)態(tài)，當(dāng)施藥量為2.7 g·m-2時(shí)，印楝素在甘藍(lán)和土壤中的原始沉積量分別為3.93和0.31 mg· kg-1，藥后5 d在甘藍(lán)和土壤中印楝素的殘留量分別為0.07和0.06 mg·kg-1，消解率分別為 98.21% 和80.64%。印楝素在甘藍(lán)和土壤中的消解動(dòng)態(tài)符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，即Ct=C0e-kt，運(yùn)用DPS進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析后，可以得到印楝素在甘藍(lán)和土壤中的殘留消解的動(dòng)態(tài)方程(表2)。由表2可知，印楝素在甘藍(lán)中的半衰期為0.89 d，在土壤中的半衰期為2.40 d。

圖2 空白對(duì)照的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of control without azadirachtin

Tab.2 Dissipation dynamics of 0.3% azadirachtin EC residue in cabbages and soil

t取樣/d甘藍(lán)土壤殘留量/(mg·kg-1)消解率/%殘留量/(mg·kg-1)消解率/%03.930.310.253.4611.950.296.451.001.8054.190.2616.122.000.8578.370.1938.703.000.3790.580.1454.834.000.1895.410.0970.965.000.0798.210.0680.647.00…………消解方程Ct=4.0251e-0.7775tCt=0.3195e-0.2882t相關(guān)系數(shù)0.99890.9909F2288270P0.000010.00002半衰期/d0.892.40

3 結(jié)論

本研究建立了較為簡(jiǎn)便的檢測(cè)印楝素在甘藍(lán)和土壤中殘留的方法。試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)此方法處理的樣品，液相色譜圖峰形良好且該方法的添加回收率及準(zhǔn)確度等均符合要求。本研究用2倍的推薦劑量對(duì)田間甘藍(lán)進(jìn)行施藥，6 h后印楝素的殘留量就已經(jīng)低于檢出限而檢測(cè)不出。為了進(jìn)一步獲得印楝素在甘藍(lán)上殘留降解行為的信息，本研究采用了20倍的推薦劑量施藥，施藥后1 h在甘藍(lán)上的原始沉積量為3.93 mg·kg-1，半衰期為0.89 d，7 d后已檢測(cè)不出。施藥后1 h在土壤中的原始沉積量為0.31 mg·kg-1，半衰期為2.40 d。印楝素屬于植物性殺蟲(chóng)劑，目前國(guó)內(nèi)鮮見(jiàn)印楝素在蔬菜上的MRL和安全使用標(biāo)準(zhǔn)。歐盟則規(guī)定印楝素在蔬菜上的MRL為1.0 mg·kg-1，安全間隔期為3 d。根據(jù)本研究結(jié)果，并參照FAO/WHO和國(guó)內(nèi)農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，可知印楝素屬于低毒、低殘留農(nóng)藥。但為了保證安全，仍需進(jìn)一步開(kāi)展各種試驗(yàn)，多積累數(shù)據(jù)并結(jié)合毒性資料等來(lái)制定印楝素在農(nóng)產(chǎn)品中的MRL值。

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【責(zé)任編輯 霍 歡】

Degradation dynamics of azadirachtin in cabbage and soil

YANG Xiaoyun1， HUANG Qiliang2， JIANG Tenghui3， XU Hanhong1

(1 Key Laboratory of Natural Pesticide and Chemical Biology, Ministry of Education/College of Agriculture, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China; 2 Guangdong Vocational and Technotogical School of Environmental Protection, Guangzhou 510655, China; 3 Agricultural Pest Prevention and Control Center of Guangdong Province, Guangzhou 510500, China)

【Objective】 To identify the residual and degradation dynamics of azadirachtin in cabbage and soil after spraying 0.3%azadirachtin emulsifiable concentrate during the growth period of cabbage (Brassicaoleracea)．【Method】Azadirachtin was added with three concentrations of 0.1，0.5 and 1.0 mg·kg-1within the range from 0.05 to 5.00 mg·kg-1. Azadirachtin was extracted from cabbage and soil using acetonitrile assisted with ultrasonic, purificated using a florisil solid phase extraction column, detected by HPLC and quantified by external standard method．【Result】The average recovery rates of azadirachtin in cabbage ranged from 88.52% to 93.21% with relative standard deviations ranging from 2.75% to 3.55%, and the average recovery rates in soil were ranged from 90.69% to 93.32% with relative standard deviations ranging from 2.09% to 3.46%.The half-lives of azadirachtin in cabbage and soil were 0.89 and 2.40 d respectively.【Conclusion】Azadirachtin is an easily degradable pesticide. Application of 0.3% azadirachtine mulsifiable concentrate is safe and recommended.

azadirachtin; emulsifiable concentrate; cabbage; soil; pesticide residue；HPLC

2017- 03- 02 優(yōu)先出版時(shí)間：2017- 06-21

楊曉云(1966—)，男，苗族，副教授，博士，E-mail：yxyhyxy@scau.edu.cn；通信作者：徐漢虹(1961—)男，教授，博士，E-mail：hhxu@csau.edu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金(20377015)

S481.8

A

1001- 411X(2017)04- 0037- 04

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20170621.1924.012.html

楊曉云， 黃其亮， 江騰輝， 等.印楝素在甘藍(lán)及土壤中的消解動(dòng)態(tài)[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2017,38(4):37- 40.