王宏運(yùn)，王宮，喻琳，褚克丹，徐偉，李煌

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122；2.福建省中醫(yī)藥研究院，福建 福州 350003

牛樟芝和沉水樟芝的物種同源性及質(zhì)量控制研究

王宏運(yùn)1，王宮2，喻琳1，褚克丹1，徐偉1，李煌1

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122；2.福建省中醫(yī)藥研究院，福建 福州 350003

目的 比較研究牛樟芝和沉水樟芝藥材間的物種同源性，進(jìn)行質(zhì)量控制研究。方法 建立牛樟芝和沉水樟芝藥材的 HPLC 指紋圖譜，采用 Diamonsil C18（2）色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），乙腈-1%甲酸水為流動(dòng)相梯度洗脫，流速 0.8 m L/m in，檢測波長 254 nm，柱溫 30 ℃。結(jié)果 牛樟芝和沉水樟芝的 HPLC指紋圖譜中標(biāo)定了 9 個(gè)共有峰，11 批牛樟芝相似度在 0.906～0.995 之間，10 批沉水樟芝相似度在 0.956～0.998之間。結(jié)論 本法簡便、重復(fù)性好，牛樟芝和沉水樟芝的 HPLC 指紋圖譜和紅外光譜具有一定相似性。

牛樟芝；指紋圖譜；高效液相色譜法

牛樟芝 Antrodia Cinnamomea 又名樟芝、樟菇等，屬于多孔菌科，寄生于牛樟樹 Cinnamomum kanehirae hayata 的腐朽內(nèi)壁。其產(chǎn)于我國臺灣省，是一種珍貴的藥用真菌。《中國藥用真菌圖志》記載，牛樟芝具有抑腫瘤、抗氧化、消炎等功效[1]。研究表明，牛樟芝主要含三萜、多糖、腺苷等成分[2]，具有降糖[3]、保肝[4-5]、緩解疲勞[6]等功效。但自然界中牛樟樹被大量砍伐，以至瀕臨絕種，被列為臺灣保育類樹種，且野生牛樟芝對生長環(huán)境要求苛刻，生長速度緩慢，因而產(chǎn)量較低。近年來有人工培育牛樟芝技術(shù)的出現(xiàn)，其中段木培養(yǎng)法所得產(chǎn)物與野生牛樟芝成分最為相似[2，7-9]，但段木栽培法也會(huì)受到其寄主牛樟樹資源數(shù)量的限制。沉水樟芝是選擇沉水樟 Cinnamomum micranthum 作為樟芝的新宿主，經(jīng)人工培育得到。沉水樟主要分布于我國臺灣、福建、廣東、廣西、湖南、江西及越南北部等地，資源數(shù)量相對比較豐富。本研究運(yùn)用HPLC指紋圖譜和紅外光譜分析牛樟芝與沉水樟芝的相似性，探討二者物種的同源性，并進(jìn)行質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

Ultimate 3000 高效液相色譜儀，Thermo Fisher Scientific；Diamonsil C18（2）色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），DIKMA 公司；電子分析天平，METTLER TOLEDO；KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；冷凍干燥機(jī)，CHRIST；傅里葉變換紅外光譜儀，Thermo Fisher Scientific。

乙腈、甲酸均為色譜純。牛樟芝和沉水樟芝樣品來源信息見表 1，經(jīng)福建省中醫(yī)藥研究院王宮副研究員鑒定為多孔菌科牛樟芝 Antrodia Cinnamomea 和沉水樟芝 Antrodia Cinnamomea 的干燥子實(shí)體，樣品保存在福建中醫(yī)藥大學(xué)中藥檢定中心。

表 1 牛樟芝和沉水樟芝樣品來源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18（2）色譜柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；檢測波長：254 nm；流速：0.8 m L/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣濃度：20 mg/m L；進(jìn)樣量：10 μL；采集時(shí)間：80 m in；流動(dòng)相為乙腈-1%甲酸水，梯度洗脫程序見表2。

表 2 流動(dòng)相梯度洗脫程序（%）

2.2 供試品溶液的制備

取牛樟芝樣品粉末約 0.6 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入 95%乙醇 9 m L，超聲提取 40 min（功率 500 W，頻率 40 kHz），過濾，濾渣再加 95%乙醇9 m L，同法提取 2 次，合并濾液，置于 60 ℃水浴鍋內(nèi)揮干溶劑，殘?jiān)?95%乙醇溶解，轉(zhuǎn)移至 10 m L 容量瓶中，加 95%乙醇至刻度，搖勻，取 1 m L 定容后的溶液，加入 95%乙醇 2 m L，0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得。同法制備沉水樟芝供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 分別取同一批牛樟芝（N1）和沉水樟芝（C1）的供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下條件連續(xù)進(jìn)樣6次，檢測特征指紋圖譜。結(jié)果表明，各色譜峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積基本一致，RSD 均小于 3.0%，符合指紋圖譜技術(shù)要求。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別取同一批牛樟芝（N1）和沉水樟芝（C1）的供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下條件，分別在 0、2、4、8、12、24 h 檢測特征指紋圖譜。結(jié)果表明，各色譜峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積基本一致，RSD 均小于 3.0%，說明供試品溶液在 24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 分別取同一批牛樟芝（N1）和沉水樟芝（C1）樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法操作，制備 6 份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣，檢測特征指紋圖譜。結(jié)果表明，各色譜峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積基本一致，RSD 均小于 3.0%，符合要求。

2.4 樣品測定

分別將 11 批牛樟芝樣品和 10 批沉水樟芝樣品按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣檢測，記錄色譜圖，見圖 1、圖 2。

圖 1 11 批牛樟芝 HPLC 指紋圖譜疊加圖

圖 2 10 批沉水樟芝 HPLC 指紋圖譜疊加圖

2.5 指紋圖譜的建立

2.5.1 共有峰的確認(rèn) 根據(jù)11批牛樟芝供試品溶液HPLC 指紋圖譜給出的參數(shù)，通過比較，其中 10 個(gè)峰為各批樣品共有。確定這 10個(gè)峰為不同批牛樟芝的共有峰，見圖 3。同理，確定 11 個(gè)峰為不同批沉水樟芝的共有峰，見圖 4。對比牛樟芝和沉水樟芝的指紋圖譜發(fā)現(xiàn)：沉水樟芝極少含有圖3中7號峰，牛樟芝極少含有圖 4 中 3’、4’號峰，將 3 個(gè)無法比較的峰除去，2種樟芝樣品得到9個(gè)共有峰。

圖 3 牛樟芝對照圖譜

圖 4 沉水樟芝對照圖譜

2.5.2 牛樟芝和沉水樟芝指紋圖譜相似度評價(jià) 在“2.1”項(xiàng)色譜條件下建立 11 批牛樟芝和 10 批沉水樟芝的 HPLC 指紋圖譜，將圖譜導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng) 2012 版》軟件，建立牛樟芝和沉水樟芝指紋圖譜的共有模式圖（圖 3、圖 4）。以共有模式圖作為對照指紋圖譜，計(jì)算 11 批牛樟芝與對照指紋圖譜的相似度以及 10批沉水樟芝與對照指紋圖譜的相似度，結(jié)果見表3。

表 3 11 批牛樟芝、10 批沉水樟芝與其對照指紋圖譜的相似度

2.6 紅外光譜分析

2.6.1 樣品制備 將牛樟芝、沉水樟芝樣品按“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行提取操作，提取液用冷凍干燥機(jī)干燥，過 100 目篩；溴化鉀研細(xì)，過 100 目篩。將樣品和溴化鉀放烘箱干燥至恒重。

2.6.2 掃描圖譜 將樣品粉末與溴化鉀粉末混合（溴化鉀與樣品用量之比為 100∶3），放入瑪瑙研缽研磨，壓片。掃描條件：光譜測量范圍 400～4000 cm-1，掃描次數(shù) 16 次，OPD 速度 0.2 cm-1/s，掃描樣品壓片后立即采集背景。獲得樣品的紅外光譜圖，見圖5。

2.6.3 結(jié)果分析 從紅外光譜圖看，牛樟芝和沉水樟芝并無明顯差別，主要區(qū)別在 1675～1500 cm-1處，由 C=C、C=N 的伸縮振動(dòng)引起。推測牛樟芝和沉水樟芝所含化學(xué)基團(tuán)種類基本相同。

3 討論

本試驗(yàn)考察了水、甲醇、95%乙醇作為樣品提取溶劑并參考相關(guān)文獻(xiàn)[10]，結(jié)果 95%乙醇的提取率最高，最終選擇 95%乙醇作為提取溶劑。

本試驗(yàn)考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-1%甲酸水和乙腈-1%甲酸水 4 個(gè)流動(dòng)相系統(tǒng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用乙腈-1%甲酸水流動(dòng)相系統(tǒng)，各峰的分離度相對良好，基線較平穩(wěn)，因此最終采用乙腈-1%甲酸水系統(tǒng)作為流動(dòng)相系統(tǒng)。試驗(yàn)記錄 200 m in 的色譜峰，考察80 min 后的色譜峰情況，結(jié)果 80 m in 后的圖譜中還有 3 個(gè)色譜峰出現(xiàn)，保留時(shí)間分別為 92、103、135 m in，但峰面積小，并且均在 10以內(nèi)，對整體色譜情況影響很小，為縮短檢測時(shí)間決定舍棄。

通過對色譜峰紫外區(qū)進(jìn)行全波長掃描發(fā)現(xiàn)，在254 nm 處呈現(xiàn)的色譜峰最多，且各色譜峰吸收良好，分離效果佳，因此選擇 254 nm 作為檢測波長。

11 批牛樟芝相似度在 0.906～0.995 之間，10 批沉水樟芝相似度在 0.956 ～0.998 之間， 相 似度 均在0.9～1.0 之間，符合制定指紋圖譜的條件，其中沉水樟芝質(zhì)量相對更為穩(wěn)定。因牛樟芝目前尚未列入《中華人民共和國藥典》，市面上也缺少相應(yīng)的對照品，自行制備對照品成本過高，故本試驗(yàn)暫不對其具體成分進(jìn)行定性和定量。通過對各批牛樟芝和沉水樟芝樣品指紋圖譜以及相應(yīng)對照指紋圖譜的比較發(fā)現(xiàn)，雖然2種樟芝寄主有所不同，但色譜峰的種類基本相同。兩者相同保留時(shí)間的色譜峰比較，在進(jìn)樣量相同的情況下牛樟芝樣品各色譜峰的峰面積普遍大于沉水樟芝樣品對應(yīng)色譜峰的峰面積，唯有牛樟芝樣品 3、4號峰例外，峰面積略小于或大致等于對應(yīng)沉水樟芝的5 ’、 6 ’ 號 峰 。 2 種 樟 芝 屬 于 同 一 物 種 Antrodia Cinnamomea，推測牛樟芝所含化學(xué)成分大部分為沉水樟芝所含有，但有些成分含量相對較少，有些成分含量大致相等。

牛樟芝因?qū)ιL環(huán)境要求苛刻、生長緩慢等原因?qū)е沦Y源稀缺。牛樟芝藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)研究顯示其可以抗炎[11]、抑制腫瘤細(xì)胞生長[12]。盡管牛樟芝具有多種有益功效，但是受到資源數(shù)量的限制而不能得到廣泛應(yīng)用。從本研究的指紋圖譜來看，沉水樟芝含有的色譜峰數(shù)量、保留時(shí)間與牛樟芝幾乎一致，僅峰面積有所不同，說明沉水樟芝與牛樟芝具有較大的相似性。并且牛樟芝和沉水樟芝本是同一物種，沉水樟芝是以沉水樟代替牛樟樹作為其寄主。沉水樟芝能否作為牛樟芝的替代品，還需在有效成分及藥效學(xué)方面進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

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Study on Species Homology and Quality Control of Two K inds of Antrodia Cinnamomea

WANG Hong-yun1, WANG Gong2, YU Lin1, CHU Ke-dan1, XU Wei1, LI Huang1(1. College of Pharmacy, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, China; 2. Fujian Academy of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350003, China)

Objective To compare and study species homology of two kinds of Antrodia Cinnamomea; To conduct the study on quality control. Methods HPLC fingerprint of two kinds of Antrodia Cinnamomea was applied. The HPLC fingerprints were determined on an Diamonsil C18 (2) column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) eluted With the mobile phase consisting of 1% formic acid solution and acetonitrile in gradient mode at a flow rate of 0.8 m L/min; the detection wavelength was set at 254 nm; the column temperature was 30 ℃. Results There were 9 common peaks in the HPLC fingerprints of Antrodia Cinnamomea. The similarities varied from 0.906 to 0.995 and from 0.956 to 0.998 in 11 batches and 10 batches of two kinds of Antrodia Cinnamomea, respectively. Conclusion The method is simple and With good reproducibility, which shows that the HPLC fingerprint and infrared spectrum share sim ilarity for two kindsof Antrodia Cinnamomea.

Antrodia Cinnamomea; fingerprint; HPLC

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.08.019

R284.1

A

1005-5304(2017)08-0085-04

2016-11-28）

（

2017-02-20；編輯：陳靜）

福建省戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(xiàng)（2013 年）

徐偉，E-mai l：xwf j tcm@sina.com