姜 麗 朱尊民 周 放 袁曉莉

(鄭州大學河南省人民醫(yī)院血液內科，鄭州410003)

miR-125b靶向Sema4C調控STAT3信號通路影響非霍奇金淋巴瘤的侵襲遷移①

姜 麗 朱尊民 周 放 袁曉莉

(鄭州大學河南省人民醫(yī)院血液內科，鄭州410003)

目的：研究miR-125b靶向Sema4C調控STAT3信號通路影響非霍奇金淋巴瘤的侵襲遷移。方法：運用QT-PCR法檢測miR-125b在非霍奇金淋巴瘤組織和細胞株中的表達；運用免疫組化法檢測Sema4C在正常淋巴組織和非霍奇金淋巴瘤組織中的表達；用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測miR-125b對Sema4C轉錄活性的影響；用Transwell小室侵襲實驗和劃痕實驗檢測miR-125b的表達對NK-92細胞侵襲能力的影響；用 Western blot法檢測過表達miR-125b后NK-92細胞Sema4C的表達變化；Western blot法檢測沉默Sema4C后NK-92細胞STAT3信號通路的蛋白表達水平變化。結果：與正常淋巴組織比較，miR-125b在非霍奇金淋巴瘤組織中表達明顯降低[(0.48±0.05)% vs (1.59±0.38)%,P<0.05]，Sema4C在非霍奇金淋巴瘤中表達較高[(1.36±0.25)% vs (0.34±0.08)%,P<0.05]；過表達miR-125b后，NK-92細胞的侵襲和轉移能力明顯降低[(326.25±7.75)% vs (58.75±5.76)%]，Sema4C的表達水平下調[(84.26±6.94)% vs (15.61±4.68)%,P<0.05]。沉默Sema4C后，NK-92細胞JAK和STAT3蛋白表達下調[(85.26±6.94)% vs (12.61±4.32)%,P<0.05]；雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測結果顯示，miR-125b可以直接調控Sema4C的轉錄活性。結論：在非霍奇金淋巴瘤組織和細胞株中，miR-125b可靶向Sema4C的表達，從而調控非霍奇金淋巴瘤細胞的侵襲和遷移能力。

非霍奇金淋巴瘤；miR-125b；Sema4C；STAT3

惡性淋巴瘤是血液腫瘤中發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，發(fā)現(xiàn)晚，誤診率高，在中國發(fā)病率遠高于西方發(fā)達國家，嚴重危害人類健康的疾病[1]。世界衛(wèi)生組織年將其作為惡性血液組織腫瘤中的一種獨特類型[2]。非霍奇金淋巴瘤的病因和發(fā)病機制還沒有徹底研究清楚，一般認為是體內和體外多種混合因素相互作用的結果，如病毒感染、理化刺激、免疫缺陷等都可能與非霍奇金淋巴瘤的發(fā)病相關。

目前化療、放療、免疫生物治療等是治療非霍奇金淋巴瘤的主要方法，盡管少部分亞型非霍奇金淋巴瘤可以通過上述方案獲得早期病情緩解，能夠獲得有效的治療效果，但是，大部分類型的非霍奇金淋巴瘤治療后收效甚微，出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，或者在治療后很快出現(xiàn)復發(fā)[3]。目前研究表明，非霍奇金淋巴瘤的復發(fā)、耐藥等生物學特性與靶基因或者分子標志物有一定關聯(lián)，因此，對非霍奇金淋巴瘤的分子發(fā)病機制研究，可以為臨床診治提供有效的作用靶點和標志物，具有重要的臨床意義。

近年來有些研究報道指出，某些miRNA與哺乳動物血液細胞的生成、分化相關，可以干擾造血過程及血液系統(tǒng)循環(huán)的過程[4]。最近研究表明，特定的miRNA在T細胞和B細胞發(fā)育過程中可以扮演重要的角色[5]。另外，miRNA與非霍奇金淋巴瘤的發(fā)生進展也有部分關聯(lián)。例如在彌漫性大B淋巴瘤中發(fā)現(xiàn)miRNA-17a家族可與癌基因C-myc相互協(xié)調，誘導淋巴瘤形成。miRNA-19家族也可調控PTEN腫瘤抑制基因來促進淋巴瘤的增生和自身免疫病的形成[6]。

最近許多研究證實，miRA-125b在多種腫瘤中高表達，在造血細胞分化過程中起到重要作用，與其他下調的miRNA共同作用，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。我們推測，miR-125b可能與淋巴瘤的發(fā)展分化有一定的相關性。本試驗通過檢測miR-125b在非霍奇金淋巴瘤中表達變化，檢測過表達miR-125后Sema4C蛋白水平的變化和非霍奇金淋巴瘤細胞的生物學行為的改變，推測miR-125b通過Sema4C對非霍奇金淋巴瘤的影響，通過檢測STAT3信號蛋白水平變化驗證以上作用。

1 材料與方法

1.1 細胞株與主要試劑 人非霍奇金淋巴瘤細胞株NK-92 購于上海中山細胞庫，用含有10%胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)液在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)和傳代。胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基均購自Hyclone公司(Hyclone,Logan,UT)。Transwell小室購自美國Millipore公司(Millipore,Billerica,MA)，Matrigel購自Bio-Rad(Bio-Rad,Madrid,Spain)。Sema4C兔單克隆抗體購自Abcam(ab171559)。miR-125b mimics、miR-125b inhibitors、Sema4C沉默及對照慢病毒購自上海吉凱制藥技術有限公司。miR-125b和Sema4C qPCR引物以及RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、PCR試劑盒均購自上海吉瑪基因有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化試驗 將石蠟包埋的組織行4 μmol/L 連續(xù)切片，60℃烤箱中烘烤3～4 h；二甲苯溶液脫蠟3次，每次15 min，80%～100%的酒精逐步水化，每次3 min；PBS 洗3次，每次3 min；將切片置入檸檬酸鹽緩沖液高壓修復10 min，置于PBS液中浸洗3次，每次3 min；3%過氧化氫甲醇溶液封閉10 min，PBS液洗3次，每次3 min；加山羊血清后靜置15 min滴加一抗，4℃孵育過夜；37℃復溫 30 min，PBS+1‰ Tween20 液浸洗3次，每次3 min；室溫下滴加二抗孵育15 min，PBS+1‰ Tween20 液浸洗3次，每次3 min；滴加二氨基聯(lián)苯胺(DAB)后觀察染色情況；蘇木素染色，清水沖洗3次，烘箱內烘干，用中性樹膠進行封片。

1.2.2 qPCR 熒光定量PCR法檢測miR-125b和Sema4C的表達 首先合成雙向PCR引物，引物序列，miR-125b:5′-TCCCTGAGACCCTAACTTGT-3′，3′-AGGGACTCTGGGATTGAACA-5′，將反應混合液加熱至94～98℃保持20～30 s，反應溫度降至50～65℃時，引物與互補的序列形成氫鍵。退火溫度72℃，維持20～40 s，繼續(xù)降低至68℃，PCR反應進行30～35個循環(huán)，68～74℃延伸5～10 min，根據(jù)美國Sigma公司熒光定量試劑盒(GoTaq?qPCRMaster Mix)操作說明配制反應體系，每組反應體系的體積為20 μl，并各設置3個復孔，每組樣本cDNA 均需行目的RNA和內參基因GAPDH熒光定量PCR擴增。使DNA全部反應完畢。實驗重復3次。

1.2.3 Western blot法檢測蛋白表達 將細胞分為兩組，NC組為未處理的NK-92細胞組，LV3-Sema4C組為沉默Sema4C后的NK-92細胞組。制10%SDS-PAGE，每孔加入30 g蛋白樣品，在120V恒壓下條件下電泳60 min，使蛋白完全電泳散開。使用濕轉法電轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，1∶1 000 TBST稀釋一抗(兔抗人Sema4C多克隆抗體)，4℃過夜；加入辣根過氧化酶物標記羊抗兔IgG(1∶5 000)稀釋，室溫孵育2 h；ECL發(fā)光。實驗重復3次。

1.2.4 Transwell小室侵襲實驗檢測非霍奇金淋巴瘤瘤細胞遷移能力 Transwell小室的底面厚度為8 μmol/L，使用細胞培養(yǎng)基50 μl平鋪在小室底，Matrigel平鋪在小室上，常溫下凝膠后接種細胞。將NK92細胞濃度稀釋為 1×106個/ml，在小室上層加入300 μl含胎牛血清的細胞培養(yǎng)基，向每個小室上層加入25 μl的細胞懸液，然后置于37℃孵箱孵育24 h。用無菌棉簽輕度擦拭上室上層的細胞，擦拭干凈后用結晶紫染色10 min，倒去染液PBS清洗5 min，然后于鏡下觀察并拍照計數(shù)。

1.2.5 劃痕實驗檢測非霍奇金淋巴瘤細胞遷移能力 將呈對數(shù)生長期的NK-92細胞接種到6孔板中，分為兩組，NC組為未處理的NK-92細胞組，miR-125b-mimic組為過表達miR-125b后的NK-92細胞組。在恒溫孵箱中培養(yǎng)，等細胞長滿視野時，使用黑色馬克筆孔板背后劃線，保證槍頭劃痕時垂直。使用高溫滅菌的20 μl槍頭在孔板上垂直于線劃痕。劃好后充分沖洗，將殘余懸浮細胞沖洗掉。然后向孔內加入不含胎牛血清的細胞培養(yǎng)基，置于恒溫孵箱孵育24、48、72 h后在顯微鏡下取點，觀察，拍照。分別測量細胞遷移的距離，與0 h的初始距離作對比，計算細胞的遷移率。

2 結果

2.1 miR-125b在非霍奇金淋巴瘤組織和細胞株中的表達 在非霍奇金淋巴瘤組織中，miR-125b的表達水平低于正常對照組織[(0.48±0.05)% vs (1.59±0.38)%]。在非霍奇金淋巴瘤細胞株NK-92中miR-125b的表達水平低于正常對照細胞株[(0.31±0.04)% vs (1.12±0.25)%](圖1)。

2.2 免疫組化方法檢測在非霍奇金淋巴瘤中Sema4C的表達情況 在非霍奇金淋巴瘤組織中，Sema4C的表達水平高于正常對照組織[(1.36±0.25)% vs (0.34±0.08)%](圖2)。

圖1 miR-125b在非霍奇金淋巴瘤組織和NK-92細胞株中的表達Fig.1 miR-125b in non-Hodgkin′s lymphoma tissue and NK-92 cell lines were lower than normal control groupNote: Compared with NT，*.P<0.05.

2.3 雙熒光素酶驗證Sema4C是NK-92細胞miR-125b下游的靶向基因 為了進一步證實Sema4C是miR-125b下游的靶向基因，使用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn)，在NK-92細胞中，Sema4C和PIK3R3是miR-214的直接靶點，Sema4C可能被上游miR-214調控其表達(圖3)。

2.4 過表達miR-125b后NK-92細胞Sema4C的蛋白表達情況 Western blot實驗結果顯示:與NC組相比，NK-92細胞miR-125b-mimic組中Sema4C蛋白表達水平明顯降低[(84.26±6.94)% vs(15.61±4.68)%]，說明miR-125b-mimic轉染NK-92細胞之后可以有效的降低Sema4C蛋白的表達(圖4)。

2.5 過表達miR-125b后NK-92細胞的侵襲能力的變化 Transwell實驗結果顯示，miR-125b-mimic組穿透過基質膠的NK-92細胞數(shù)量明顯少于NC組[(326.25±7.75)% vs (58.75±5.76)%]，差異有統(tǒng)計學意義。該結果表明，過表達miR-125b可以有效抑制NK-92細胞的侵襲能力(圖5)。

圖2 免疫組化實驗檢測Sema4C在非霍奇金淋巴瘤組織中的表達情況Fig.2 Immunohistochemical test to detect expression of Sema4C in non-Hodgkin's lymphomaNote: Compared with NT,*.P<0.05.

圖3 雙熒光素酶驗證Sema4C是miR-125b下游的靶向基因Fig.3 Sema4C is a target gene downstream of miR-125b by double luciferase assaysNote: Compared wiht NC，*.P<0.05.

圖4 Western blot實驗檢測miR-125b對Sema4C蛋白的調控作用Fig.4 miR-125b regulation of Sema4C protein detected by Western blotNote: Compared with NC，*.P<0.05.

圖5 Transwell侵襲實驗檢測miR-125b對NK-92細胞侵襲能力的影響Fig.5 Effect of miR-125b on NK-92 cell invasion detected by Transwell invasion assayNote: Compared with NC，*.P<0.05.

2.6 過表達miR-125b后NK-92細胞遷移能力的變化 劃痕實驗結果顯示，在顯微鏡下觀察，與NC對照組相比，miR-125b-mimic組細胞的遷移比率明顯降低，在24、48、72 h結果分別是(28.67±6.32)% vs (45.75±4.34)%；(48.45±6.35)% vs (67.64±6.85)%；(56.84±2.75)% vs (87.12±9.09)%，差異有統(tǒng)計學意義。該結果表明，過表達miR-125b后可以有效抑制NK-92細胞的遷移能力(圖6)。

2.7 沉默Sema4C后NK-92細胞STAT3通路蛋白水平變化 Western blot實驗結果顯示:與NC組相比，LV3-Sema4C組NK-92細胞中JAK和STAT3蛋白表達水平明顯降低[(85.26±6.94)% vs(12.61±4.32)%]，說明Sema4C的降低可以有效地下調信號通路STAT3蛋白的表達(圖7)。

圖6 劃痕愈合實驗檢測miR-125b對NK-92細胞遷移能力的影響Fig.6 Effect of miR-125b on NK-92 cell migration detected by Scratch healing testNote: Compared with NC，*.P<0.05，bar=100 μm.

圖7 Western blot實驗檢測NK-92細胞中Sema4C對STAT3通路蛋白的表達的影響Fig.7 Effect of Sema4C on STAT3 pathway protein expression in NK-92 cells detected by Western blot assayNote: Compared with NC，*.P<0.05.

3 討論

據(jù)文獻報道指出，miR-125b在乳腺癌、子宮內膜癌和肺癌中廣泛存在著表達缺失現(xiàn)象，提示其具有一定抑癌基因的功能[7-9]。不過在非霍奇金淋巴瘤中的作用機制尚未研究清楚。本課題首先驗證了miR-125b在非霍奇金淋巴瘤組織和細胞株中的表達情況，然后通過免疫組化驗證Sema4C在非霍奇金淋巴瘤組織中的表達情況，利用雙熒光素酶標記證明Sema4C和miR-125b的相互關系。之后功能研究證實，過表達miR-126b可以在體外實驗中明顯抑制非霍奇金淋巴瘤細胞的侵襲和遷移。綜上所述，非霍奇金淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展與miR-125b的表達情況有密切的聯(lián)系。

miR-125b是目前研究熱度較高的腫瘤相關miRNA，Testoni 等[10]于2015年就在彌漫大B淋巴細胞瘤患者中發(fā)現(xiàn)miR-125b表達水平相對較為富集，這表示其預后可能不佳[11]。越來越多研究表明，miR-125b在炎癥、免疫系統(tǒng)和腫瘤細胞之間起到極為重要的作用，miR-125b既可以介導和調控炎癥的發(fā)生，又在選擇性激活或抑制免疫細胞的生長和生物因子釋放，同時也參與腫瘤細胞的分化和成熟[12]。有研究表明，在蛋白激酶JNK及轉錄調節(jié)因子VEGF等的作用和炎性介質的刺激下，miR-125b在高分化的B淋巴細胞中呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，提示miR-125b與淋巴瘤細胞的生物學功能密切聯(lián)系[13]。另有研究人員發(fā)現(xiàn)，在激活狀態(tài)下CD8+T細胞的miR-125b表達升高，miR-125b的表達下調能夠增強CD8+T細胞的免疫抑制功能。近來研究發(fā)現(xiàn)，miR-125也可以通過促進炎性T細胞的活化，進而導致自身免疫炎癥的出現(xiàn)[14,15]。同時也有相關調查表明，提高miR-125b在淋巴瘤細胞中的轉錄活性，可以調控STAT3通路蛋白的表達，進而調控腫瘤細胞的增殖和侵襲起到關鍵作用[16]。

Shi 等[17]運用Targetscans/PICTAR預測軟件預測，miR-125b下游可能存在的靶基因位點，檢測結果發(fā)現(xiàn)，miR-125b可以與下游STAT3的某些保守序列相結合。因此我們推測，STAT3可能是miR-125b的潛在下游靶基因。

STAT是一種廣泛存在于多種人類惡性腫瘤組織及細胞系中的分子，在正常組織中很少出現(xiàn)STAT及其家族蛋白的活化情況，即使有，也只是短暫的活化。而且，STAT3也是眾多抑癌和促癌基因信號通路轉導的樞紐[18]。STAT家族中的STAT3蛋白，廣泛存在于多種腫瘤組織中，影響腫瘤細胞的增殖、遷移及侵襲等一系列的生物學行為，扮演促癌基因的角色。某些因子(IL-6、VEGF)在腫瘤細胞和其免疫微環(huán)境中起抑制某些抑癌基因的表達，從而導致免疫抑制的增強，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[19]。為了進一步探討非霍奇金淋巴瘤細胞中miR-125b的表達改變對Sema4C蛋白的影響。我們通過轉染miR-125b到非霍奇金淋巴瘤細胞，使miR-125b過表達后能夠有效降低Sema4C蛋白的表達。相反，在非霍奇金淋巴瘤細胞中，可以通過抑制miR-125b表達，能上調Sema4C的表達。上述結果與其他腫瘤組織中Sema4C受miR-125b的調控情況相似[20,21]。

通過對非霍奇金淋巴瘤細胞生物學行為的檢測發(fā)現(xiàn)，miR-125b過表達可以抑制非霍奇金淋巴瘤的增殖和侵襲。miR-125b在非霍奇金淋巴瘤細胞中表達下調，Sema4C在非霍奇金淋巴瘤細胞系中上調。通過以上結果可以推測，在生理狀態(tài)下，miR-125b/Sema4C保持低水平表達狀態(tài)，一旦進入病理狀態(tài)，環(huán)路的平衡狀態(tài)被打破，則很大可能引起腫瘤的出現(xiàn)或發(fā)展。綜上所述，miR-125b/Sema4C/STAT3可能在非霍奇金淋巴瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，有可能成為預測非霍奇金淋巴瘤的發(fā)生和進展的標志物。

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[收稿2017-02-18 修回2017-03-11]

(編輯 許四平 劉格格)

miR-125b targets Sema4C regulating invasion and migration of Non-Hodgkin′s lymphoma by STAT3 signaling pathway involved

JIANGLi，ZHUZun-Min，ZHOUFang,YUANXiao-Li.

DepartmentofHematology,HenanProvincialPeople′sHospital,ZhengzhouUniversity，Zhengzhou410003，China

Objective:To investigate the effect of miR-125b targeting Sema4C on STAT3 signaling pathway on invasion and metastasis of non-Hodgkin′s lymphoma.Methods: Expression of miR-125b in non-Hodgkin′s lymphoma tissues and cell lines was detected by QT-PCR.Expression of Sema4C in normal lymphocyte tissues and non-Hodgkin′s lymphoma tissues was detected by immunohistochemistry.Dual luciferase effect of miR-125b on the transcriptional activity of Sema4C was examined by the reporter gene system.Transwell invasion assay was used to detect the expression of miR-125b in the non-Hodgkin′s lymphoma cell line NK-92.Scratch test Western blot was used to detect the expression of Sema4C.Western blot was used to detect the protein expression of STAT3 signal pathway after silencing Sema4C.The protein expression of Sema4C was detected by Western blot.Results: Expression of miR-125b was significantly lower in non-Hodgkin′s lymphoma tissues than that in normal tissues[(0.48±0.05)% vs (1.59±0.38)%,P<0.05].Sema4C was highly expressed in non-Hodgkin′s lymphoma[(326.25±7.75)% vs (58.75±5.76)%].After overexpression of miR-125b,non-Hodgkin′s lymphoma cells expression level of Sema4C was down-regulated after silencing Sema4C[(326.25±7.75)% vs (58.75±5.76)%],and the expression of JAK and STAT3 protein were down-regulated after miR-125b overexpression[(85.26±6.94)% vs (12.61±4.32)%,P<0.05].The dual luciferase reporter gene system showed that miR-125b could directly regulate the transcriptional activity of Sema4C.Conclusion: miR-125b can regulate the invasion and migration of non-Hodgkin′s lymphoma cells by targets the expression of Sema4C.

Non-Hodgkin′s lymphoma；miR-125b；Sema4C；STAT3

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.07.013

姜 麗(1981年-)，女，在讀博士，主治醫(yī)師，主要從事多發(fā)性骨髓瘤的診治、異基因造血干細胞移植方面的研究，E-mail：chenyanccai@sina.com。

及指導教師：朱尊民(1964年-)，男，博士，主任醫(yī)師，主要從事淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、急性白血病等血液系統(tǒng)疾病方面的研究。

R733.4

A

1000-484X(2017)07-1018-06

①本文為2012年度河南省醫(yī)學科技攻關計劃項目(201203068)。