盧宇 費小薔 楊淑芳 徐邦奎 馬詠梅 趙成媛 李湘怡

泰州市人民醫(yī)院內分泌科，江蘇 泰州 225300

過氧化物酶體增殖物激活受體γ (peroxisome proliferators activated receptor，PPARγ)激動劑是一類在臨床中廣泛應用的口服降糖藥物，其代表性藥物有吡格列酮和羅格列酮。臨床使用中發(fā)現(xiàn)PPARγ激動劑的副作用之一是增加女性特別是絕經(jīng)后女性的骨質疏松和骨折風險[1]。既往研究表明PPARγ激動劑可以增加成骨細胞的凋亡，抑制成骨細胞的增殖[2]。Duan等[3]的研究發(fā)現(xiàn)，20 μmol/L吡格列酮作用于MC3T3-E1細胞24 h，可以明顯抑制成骨細胞的增殖活性，促進細胞凋亡。在17β-雌二醇缺乏的情況下，TZDs可以誘導成骨細胞凋亡，上調骨硬化蛋白的表達，從而導致骨質的流失[4]。在雌激素缺乏的去卵巢雌性大鼠模型中過表達PPARγ會導致骨密度減少，但在雄性大鼠中過表達PPARγ對骨密度沒有影響[5]。提示雌激素缺乏與PPARγ激動劑導致的骨質疏松有關，雌激素或許可以改善PPARγ激動劑導致的骨質疏松。

雌激素替代療法可以使絕經(jīng)后女性骨質疏松的風險降低50%，降低冠心病的發(fā)生率，改善絕經(jīng)后女性生活質量[6]，但是長期服用雌激素會使子宮內膜癌和乳腺癌等疾病的風險明顯增加[7]。近年來來源于自然的植物性雌激素越來越受到推崇。葛根素是一種植物性雌激素，具有抗骨質疏松的作用，且具有調節(jié)血壓、血糖、血脂，抗炎，抑制血小板聚集，抗氧化，抑制腫瘤等作用[8, 9]。

本實驗擬通過觀察葛根素對吡格列酮誘導的成骨細胞凋亡的影響及凋亡相關蛋白的表達，探討葛根素調節(jié)骨代謝的功能及分子機制。

1 材料和方法

1.1 材料

小鼠成骨細胞株MC3T3-E1(小鼠顱頂前骨細胞亞克隆14)購自中國科學院細胞庫。葛根素由南京正大天晴制藥有限公司提供，吡格列酮由江蘇德源藥業(yè)有限公司提供。MTT 試劑盒由碧云天生物技術研究所提供。Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒由江蘇凱基生物技術股份有限公司提供。Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-8抗體由Cell Signaling Technology提供。Bcl-2、Bax抗體由Santa Cruz Biotechnology提供。羊抗兔二抗由武漢谷歌生物科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及實驗分組：MC3T3-E1細胞用a-MEM培養(yǎng)基 (含10%胎牛血清，1%青霉素及鏈霉素溶液)，置于37 ℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞進入對數(shù)生長期時進行藥物干預。

1.2.2MTT檢測細胞活性：分組：正常對照組(Control)、0.01-100 μmol/L的葛根素組(PUE)、20 μmol/L吡格列酮組(PIO)、0.01-100 μmol/L的葛根素+吡格列酮組(PUE+PIO)，干預24 h。取對數(shù)生長期的MC3T3-E1 細胞，按2×103個/孔接種于96 孔培養(yǎng)板。細胞融合達80%時根據(jù)實驗分組進行干預，干預24 h后加入MTT(5 mg/mL)繼續(xù)孵育4 h，吸去上清，每孔加入100 μL DMSO振蕩10 min 使結晶充分溶解，檢測490 nm波長處OD值。

1.2.3流式細胞術檢測細胞凋亡：分組：正常對照組、1 μmol/L，葛根素組、吡格列酮組(20 μmol/L)、1 μmol/L葛根素+吡格列酮組。采用 Annexin V-FITC 細胞凋亡試劑盒檢測檢測細胞凋亡率。取對數(shù)生長期胞按1×105/孔接種 12 孔板，干預 24h后用不含 EDTA 的胰酶消化收集，冷PBS洗滌細胞兩次，加入500 μL Bingding Buffer重懸細胞，加入5 μL Annexin V-FITC 混勻，室溫避光反應 10 min，再加入5μL PI混勻，室溫避光應 15 min，1 h內流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.4Western blot 檢測各組凋亡相關蛋白的表達：上述細胞加入裂解液提取蛋白，冰浴30 min，4 ℃ 14 000 rpm 離心15 min，取上清，純化的蛋白用BCA 法進行蛋白濃度測定。取20 g μ蛋白樣品在聚丙烯酰胺凝膠上行SDS-PAGE，電泳結束后轉印至PVDF 膜上。5%脫脂奶粉封閉非特異性抗體，加入稀釋一抗4 ℃孵育過夜。次日用TBST洗膜3 次，加入二抗室溫孵育1h，洗膜，ECL 法成像。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 不同濃度葛根素和吡格列酮對成骨細胞增殖的影響

各組藥物干預成骨細胞24 h后，與對照組相比，吡格列酮組的細胞增殖活性明顯下降(P<0.05 )，0.1、1、10 μmol/L葛根素組細胞增殖活性明顯增強(P<0.05 )。而與吡格列酮組相比，吡格列酮+0.1及1 μmol/L葛根素組的細胞增殖活性明顯增強(P<0.05)，其中吡格列酮+1 μmol/L葛根素組有最大的促細胞增殖作用，后續(xù)試驗均選用1 μmol/L葛根素進行，見圖1。

圖1 不同濃度葛根素和吡格列酮對成骨細胞增殖的影響(24 h)(*P<0.05，與對照組比較；# P<0.05，與吡格列酮組比較)Fig.1 Different concentrations of puerarin and pioglitazone on osteoblasts proliferation (24h)(*P<0.05 compared with control group； #P<0.05 compared with pioglitazone group)

2.2 葛根素和吡格列酮對成骨細胞凋亡的影響

與對照組相比，干預成骨細胞24 h后，吡格列酮組細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)，1 μmol/L葛根素組的細胞凋亡率似乎有下降的趨勢，但無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。而與吡格列酮組相比，吡格列酮+1 μmol/L葛根素組的細胞凋亡率明顯下降(P<0.05)，見圖2。

圖2 葛根素和吡格列酮對成骨細胞凋亡的影響(24 h)A: 流式細胞術檢測成骨細胞凋亡；B:各組細胞的凋亡率(*P<0.05，與對照組比較；# P<0.05，與吡格列酮組比較)Fig.2 Puerarin and pioglitazone on osteoblasts apoptosis (24 h)A: Flow cytometry detection of osteoblasts apoptosis; B: Apoptosis rate of different groups(*P<0.05 compared with control group； #P<0.05 compared with pioglitazone group)

2.3 葛根素和吡格列酮對成骨細胞凋亡相關蛋白表達的影響

與對照組相比，吡格列酮組活化的caspase-3和caspase-8的表達明顯上升，加入葛根素以后，活化的caspase-3表達下調，而活化的caspase-8表達無明顯變化。與對照組相比，吡格列酮組Bax的表達上升，Bcl-2的表達下降。加入葛根素以后，Bax的表達無明顯變化，Bcl-2的表達上調，Bax/ Bcl-2下調，見圖3。

圖3 Western blot法檢測各組成骨細胞凋亡相關蛋白的表達Fig.3 Western blot detection of osteoblasts apoptosis related protein expression of different groups

3 討論

PPARγ激動劑是一種廣泛使用的口服降糖藥，參與調節(jié)脂肪細胞和成骨細胞的分化、脂質代謝和周圍組織的胰島素敏感性[10]。它可以增強外周組織(脂肪組織、骨骼肌)和肝臟對胰島素的敏感性，減輕胰島素抵抗，促進葡萄糖的攝取和利用，調節(jié)脂肪酸代謝，從而能有效地控制血糖[11]。但隨著使用時間的延長，臨床研究發(fā)現(xiàn)PPARγ激動劑會增加骨質疏松和骨折的風險。一項臨床研究表明[12]吡格列酮會促使絕經(jīng)后婦女的骨密度降低，骨量減少。大型臨床研究ADOPT研究[13]報道，在羅格列酮組中，女性的骨折發(fā)生率為9.3%，明顯高于二甲雙胍組和格列本脲組中女性的骨折發(fā)生率(5.1%；3.5%)。Soroceanu等[14]用PPARγ激動劑喂養(yǎng) C57BL/6 小鼠 90 天后發(fā)現(xiàn)，成骨細胞/骨細胞數(shù)量和活性下降，抗凋亡因子Bcl-2 表達降低。一項研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ激動劑曲格列酮可以導致成骨細胞MC3T3-E1凋亡，主要是由于曲格列酮可以通過上調 p38 信號通路，激活caspase-3 而誘導成骨細胞凋亡[15]。Yasuda 等[16]研究發(fā)現(xiàn)環(huán)格列酮、吡格列酮在成骨細胞顯著地增強了FGF-2 誘導的SAP/JNK 的磷酸化，促凋亡因子Bax表達增加。本研究的結果也表明吡格列酮可以激活caspase-3、caspase-8，上調促凋亡因子Bax，下調抗凋亡因子Bcl-2，促進成骨細胞的凋亡。

葛根素是一種植物性雌激素，多項動物體內實驗研究結果表明葛根素具有抗骨質疏松作用。Wang等[17]的研究表明，葛根素可以促進大鼠成骨細胞的增殖和分化，并且可以通過激活雌激素受體依賴的 MEK/ERK和 PI3K/Akt信號通路而抑制順鉑誘導的成骨細胞凋亡。另一項研究[18]則發(fā)現(xiàn)低濃度葛根素(0.001-10 μmol/L)可以促進成骨細胞增殖，增加ALP活性，而高濃度葛根素(100-1 000 μmol/L)則會抑制成骨細胞增殖，減少ALP活性。Liu等[19]研究表明，葛根素可以通過ERK通路抑制成骨細胞凋亡，上調Bcl-2的表達，下調Bax的表達。Yu等[20]研究發(fā)現(xiàn)葛根素可以增加成骨細胞的增殖活性，通過抑制JNK信號通路、激活PI3K/Akt信號通路而抑制地塞米松誘導的成骨細胞凋亡。本研究的結果表明葛根素可以促進成骨細胞增殖，并且可以抑制吡格列酮誘導的成骨細胞凋亡。該作用可能是通過上調抗凋亡因子Bcl-2、下調caspase-3蛋白的表達而實現(xiàn)的。

Caspase-3處于細胞凋亡的下游，是caspase級聯(lián)“瀑布”下游最關鍵的凋亡執(zhí)行蛋白酶，在各種因素啟動的凋亡程序中起最后的樞紐作用，可在人體正常組織和多種腫瘤組織中廣泛表達[21, 22]。細胞凋亡有兩條經(jīng)典的凋亡途徑，一條是細胞外途徑(細胞表面死亡受體途徑)，該途徑又稱為caspase-8依賴途徑；另一條是細胞內途徑(線粒體引發(fā)途徑)。細胞表面死亡受體途徑是研究最多的凋亡途徑，通過Fas、TNFRl、DR3等死亡配體與死亡受體結合，募集pro-caspase-8，形成死亡誘導信號復合物(DISC)，隨之caspase-8被激活，傳導凋亡信號，活化caspase-3。但有研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)中藥抗癌藥物可通過誘導線粒體釋放細胞色素c至胞漿中，導致產生Apaf-l和pro-caspase-9激活，形成全酶復合物凋亡體(apoptosome)，進而激活caspase-3，使細胞凋亡。YU等[20]的研究發(fā)現(xiàn)吡格列酮可以通過線粒體途徑抑制成骨細胞凋亡。本研究結果顯示葛根素可以降低吡格列酮導致的成骨細胞caspase-3表達升高，但是不能降低吡格列酮導致的成骨細胞caspase-8表達升高，提示葛根素發(fā)揮抗凋亡作用不是通過細胞外途徑，可能是通過其他途徑來完成的。

眾所周知Bcl-2 蛋白是細胞凋亡抑制因子，它自身發(fā)生同源二聚化或與Bax形成同源的蛋白二聚體，這是細胞凋亡的啟動子[23]。這兩種蛋白是細胞凋亡的關鍵介質，他們表達的比率受凋亡誘導因子調控。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)葛根素可以通過上調吡格列酮導致的Bcl-2 表達水平的下降、降低Bax/ Bcl-2 比例來抑制成骨細胞的凋亡。

總的來說，本實驗證明葛根素可以抑制吡格列酮導致的成骨細胞凋亡，為葛根素進一步應用于臨床治療糖尿病骨質疏松提供理論基礎，但具體抗凋亡的機制還需進一步研究。