張鳳蘭，楊璐軍，朱紅梅，張南煬，沙學(xué)芳，朱柯穎，肖志成,5*

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)分子臨床醫(yī)學(xué)研究院,云南省干細(xì)胞和再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650500； 2.深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院，深圳 518101； 3.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院神經(jīng)外科,廣東神經(jīng)外科研究所,廣東省腦功能修復(fù)與再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510282；4.昆明醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，昆明 650500； 5.澳大利亞莫納什大學(xué)免疫與干細(xì)胞研究中心，墨爾本VIC3010)

不同胎齡小鼠腦組織中神經(jīng)干細(xì)胞所占比例的研究

張鳳蘭1，楊璐軍2,3，朱紅梅1，張南煬1，沙學(xué)芳4，朱柯穎4，肖志成1,5*

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)分子臨床醫(yī)學(xué)研究院,云南省干細(xì)胞和再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650500； 2.深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院，深圳 518101； 3.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院神經(jīng)外科,廣東神經(jīng)外科研究所,廣東省腦功能修復(fù)與再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510282；4.昆明醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，昆明 650500； 5.澳大利亞莫納什大學(xué)免疫與干細(xì)胞研究中心，墨爾本VIC3010)

目的 詳細(xì)了解并比較不同胎齡小鼠全腦和大腦皮層組織中神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)所占比例，為后期優(yōu)化分離培養(yǎng)NSCs提供直接量化數(shù)據(jù)。方法 分離不同胎齡小鼠全腦(胎齡12.5、14、16和18 d)和大腦皮層(胎齡14、16 和18 d)組織，消化成單細(xì)胞懸液，貼壁培養(yǎng)3 ～ 4 h，細(xì)胞免疫熒光標(biāo)記NSCs特異性標(biāo)記物Nestin，統(tǒng)計(jì)分析各組中NSCs所占比例。另外，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)Nestin mRNA在不同胎齡(12.5、14、16和18 d)小鼠大腦皮層中的表達(dá)水平。結(jié)果 細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，分離培養(yǎng)的不同胎齡小鼠全腦和大腦皮層組織中均有Nestin陽性細(xì)胞。在分離培養(yǎng)的小鼠全腦組織中胎齡12.5 d組NSCs所占比例最高，為53.42% ± 1.57%；胎齡18 d組NSCs所占比例最低，為25.96% ± 1.31%，而胎齡14 d組和16 d組位于二者之間。在分離培養(yǎng)的不同胎齡小鼠大腦皮層組織中，胎齡14 d組NSCs所占比例最高，為33.65% ± 0.29%；胎齡18 d組比例最低，為25.29% ± 0.28%，胎齡16 d組位于二者之間(26.82% ± 0.30%)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，當(dāng)把胎齡12.5 d組的小鼠大腦皮層組織中Nestin mRNA表達(dá)水平設(shè)定為1，胎齡14 d組的小鼠大腦皮層組織中Nestin mRNA的相對(duì)表達(dá)量為0.83± 0.04，胎齡16 d組為0.77± 0.05，胎齡18 d組為0.44± 0.05。因此，隨著小鼠胎齡增加，小鼠大腦皮層中的Nestin mRNA的表達(dá)水平逐漸下降。結(jié)論 在小鼠大腦發(fā)育過程中，隨著胎齡增加，分離培養(yǎng)的小鼠全腦和大腦皮層組織中神經(jīng)干細(xì)胞比例逐漸降低。

小鼠；不同胎齡；神經(jīng)干細(xì)胞；全腦；大腦皮層

神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一類能夠自我更新，增殖并分化成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞[1，2]。1992，Reynolds 和Weiss在成體小鼠紋狀體中首次分離培養(yǎng)出NSCs[3]。自此以后，NSCs的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用成為國(guó)內(nèi)外新熱點(diǎn)[4，5]。近年來，小鼠NSCs體外分離培養(yǎng)技術(shù)已被廣泛報(bào)道，但是所用小鼠胎齡有所不同[6]。本實(shí)驗(yàn)旨在統(tǒng)計(jì)分析分離培養(yǎng)的不同胎齡小鼠全腦和大腦皮層細(xì)胞中NSCs所占比例及差異，為后期優(yōu)化培養(yǎng)高純度NSCs提供直接量化數(shù)據(jù)和前期研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)C57BL/6小鼠，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)【SCXK(京)2011-0011】，后在昆明醫(yī)科大學(xué)清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房繁殖飼養(yǎng)【SYXK(滇)2005-0004】。

1.2 主要試劑

Nestin抗體(Millipore公司)，山羊抗小鼠熒光二抗(Abcam公司)，DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基(Gibco公司)，堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF，Peprotech公司)，表皮生長(zhǎng)因子(EGF，Peprotech公司)，B27(Gibco公司)，0.05% EDTA-胰蛋白酶(Gibco公司)，多聚甲醛(索萊寶公司)，BSA(索萊寶公司)，DAPI(羅氏公司)，Trizol(Sigma公司)，DNaseI(寶生物公司)，PrimerScript RT reagent Kit(寶生物公司)，F(xiàn)aststart Universal SYBR Green Master(ROX)(羅氏公司)

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 小鼠大腦組織細(xì)胞的分離培養(yǎng)

將20～ 26 g左右健康成年C57BL/6雌性小鼠與雄性小鼠于傍晚合籠，次日觀察雌性小鼠有無陰道栓，若有則表示交配成功，記為胎齡0.5 d(embryonic 0.5 d，E0.5)。標(biāo)記多只孕鼠，分別在胎齡12.5 d(E12.5)、14 d(E14)、16 d(E16)和18 d(E18)時(shí)使用。將孕鼠麻醉，在無菌條件下每組至少分離3 ～ 4只雌雄不限的胎鼠全腦和大腦皮層，加入適量0.05% EDTA-胰蛋白酶在37℃水浴中消化腦組織，然后輕柔吹散成單個(gè)細(xì)胞，800 rpm離心10 min，棄上清，加入含2% B27，20 ng/mL的EGF和bFGF的DMEM/F12生長(zhǎng)培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度，按照 5 × 105cells/mL接種至已包被細(xì)胞外基質(zhì)的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)3 ～ 4 h。然后加入4%多聚甲醛固定30 min，用于后期細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 細(xì)胞免疫熒光染色

將固定的細(xì)胞用PBS洗3遍，孔內(nèi)加入0.3% Triton X-100打孔10 min，然后加入10% BSA室溫封閉1 h。再次用PBS洗3遍，加入Nestin一抗(1∶50)4℃孵育過夜，次日用PBS清洗后加入相應(yīng)的二抗(1∶1000)室溫孵育1 h(此后需避光)，最后加入DAPI細(xì)胞核染色5 min。熒光顯微鏡下觀察，然后每個(gè)樣品隨機(jī)采集至少5張細(xì)胞分布較均勻的圖片，計(jì)數(shù)Nestin陽性細(xì)胞和DAPI陽性細(xì)胞并計(jì)算二者比例。

1.3.3 RNA抽提及real-time PCR

每組至少分離3只12.5 d(E12.5)、14 d(E14)、16 d(E16)和18 d(E18)胎齡的雌雄不限的胎鼠大腦皮層，加入適量Trizol研磨至組織完全溶解，按照說明書操作步驟抽提總RNA，加入DNaseI去除基因組DNA。然后按照Primer Script RT reagent Kit(Perfect Real-time)說明書逆轉(zhuǎn)獲取cDNA。應(yīng)用ABI7300型熒光定量PCR儀，使用Faststart Universal SYBR Green Master(ROX)進(jìn)行擴(kuò)增。Nestin上游引物序列為5′-AAAGTTCCAGCTGG CTGTGG-3′，下游引物序列為5′-TGGGGTCAGG AAAGCCAAGA-3′，Gapdh上游引物序列為5′-TGACGTGCCGCCTGGAGAAA-3′，下游引物序列為5′-AGTGTAGCCCAAGATGCCCTTCAG-3′。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用2-ΔΔCT法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同胎齡小鼠全腦NSCs的比例及差異

通過觀察4組細(xì)胞免疫熒光圖發(fā)現(xiàn)，不同胎齡小鼠全腦組織細(xì)胞經(jīng)消化分離后，未見細(xì)胞團(tuán)塊幾乎全為單細(xì)胞，且未發(fā)現(xiàn)碎裂細(xì)胞殘片。細(xì)胞貼壁培養(yǎng)3 ～ 4 h后，能較好貼壁。DAPI陽性細(xì)胞呈藍(lán)色，在細(xì)胞核中均勻分布。Nestin陽性細(xì)胞呈綠色，在細(xì)胞質(zhì)中均勻分布。且胎齡12.5 d組Nestin陽性細(xì)胞比例較胎齡14、16 d和18 d組高(圖1)。

圖1 不同胎齡小鼠全腦組織中的NSCs (細(xì)胞免疫熒光染色)Fig.1 NSCs in the whole brain of mice at different embryonic days (Imunofluorescence staining)

注：***P< 0.001。圖2 不同胎齡小鼠全腦組織NSCs的比例Note. ***P< 0.001 showing a significant difference at different embryonic days.Fig.2 Proportion of NSCs in the whole brain of mice at different embryonic days

細(xì)胞免疫熒光統(tǒng)計(jì)分析顯示，胎齡12.5 d組分離培養(yǎng)的全腦細(xì)胞中NSCs所占比例最高，為53.42% ± 1.57%，并與其他三組差異有顯著性(P< 0.001)。胎齡18 d組所占比例最低，為25.96% ± 1.31%，胎齡14 d和16 d 組位于二者之間。另外，胎齡14 d組NSCs比例(33.77% ± 1.12%)與胎齡18 d組之間差異有顯著性(P<0.05，未標(biāo)注)(圖2)。2.2 不同胎齡小鼠大腦皮層NSCs的比例及差異

觀察3組不同胎齡小鼠大腦皮層細(xì)胞的免疫熒光圖，發(fā)現(xiàn)無細(xì)胞團(tuán)塊，無碎裂細(xì)胞殘片(與圖1類似)，且胎齡14 d組Nestin陽性細(xì)胞比例較胎齡16 d和18 d組高(圖3)。

細(xì)胞免疫熒光統(tǒng)計(jì)分析顯示，胎齡14 d組小鼠大腦皮層細(xì)胞中NSCs所占比例最高，為33.65% ± 0.29%；胎齡18 d組所占比例最低，為25.29% ± 0.28%。胎齡14 d組與16 d組(P< 0.01)和18 d組(P< 0.001)之間差異有顯著性，但胎齡16 d組與18 d組之間差異無顯著性(圖4)。

2.3 不同胎齡小鼠大腦皮層中Nestin mRNA的表達(dá)水平

Real-time PCR檢測(cè)胎齡12.5、14、16 d和18 d時(shí)小鼠大腦皮層中Nestin mRNA的表達(dá)水平結(jié)果顯示，當(dāng)把胎齡12.5 d組小鼠大腦皮層的Nestin mRNA表達(dá)水平設(shè)定為1時(shí)，胎齡14 d組的相對(duì)表達(dá)量為0.83±0.04，16 d組為0.77± 0.05，18 d組為0.44± 0.05。其中，胎齡18 d組小鼠大腦皮層中的Nestin mRNA表達(dá)水平最低，與另外三組差異有顯著性(P< 0.01或0.001)。另外，胎齡12.5 d組與胎齡16 d組之間差異有顯著性(P<0.05，未標(biāo)注)(圖5)。由此可知，隨著小鼠胎齡增加，小鼠大腦皮層中Nestin mRNA的表達(dá)水平逐漸下降。

圖3 不同胎齡小鼠大腦皮層的NSCs(細(xì)胞免疫熒光染色)Fig.3 NSCs in cerebral cortex of mice at different embryonic days (Immunofluorescence staining)

注：**P< 0.01；***P< 0.001。圖4 不同胎齡小鼠大腦皮層NSCs的比例Note. **P< 0.01; ***P< 0.001.Fig.4 Proportions of NSCs in the cerebral cortex of mice at different embryonic days

注：**P< 0.01；***P< 0.001。圖5 不同胎齡小鼠大腦皮層中Nestin mRNA 的表達(dá)水平Note. **P< 0.01; ***P< 0.001.Fig.5 Expression of Nestin mRNA in the cerebral cortex of mice at different embryonic days

3 討論

NSCs的發(fā)現(xiàn)是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的重要進(jìn)展, 徹底改變了人們以往認(rèn)為中樞神經(jīng)不能再生的傳統(tǒng)理念，為神經(jīng)系統(tǒng)的研究與應(yīng)用開辟了廣闊的前景[7，8]。但是，目前NSCs的來源及數(shù)量不足仍是臨床應(yīng)用和基礎(chǔ)研究中普遍存在的問題[1,9]。因此，優(yōu)化NSCs的體外培養(yǎng)對(duì)于研究其潛在價(jià)值具有重要意義。

目前，在小鼠的腦源性NSCs研究中，已經(jīng)建立以胎鼠、新生鼠和成體鼠作為主要供體來源的NSCs培養(yǎng)方法[10，11]。但就胎鼠而言，各科研機(jī)構(gòu)取材時(shí)間有所不同，主要集中于胎齡12 d至胎鼠出生前[12，13]。雖然取自不同胎齡小鼠腦組織的神經(jīng)干細(xì)胞都能自我更新，增殖并可以誘導(dǎo)分化，但是如何提高NSCs占分離培養(yǎng)總細(xì)胞的比例，減少雜細(xì)胞在NSCs培養(yǎng)中造成的負(fù)面影響是NSCs培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中非常重要的前期工作[14]。因此，充分了解并比較來自不同胎齡小鼠腦組織中NSCs的比例及其差異是十分必要的。

Nestin是一種中間纖維絲，屬于細(xì)胞骨架蛋白[15，16]。它在早期胚胎發(fā)育的神經(jīng)外胚層細(xì)胞中強(qiáng)烈表達(dá)，隨著神經(jīng)細(xì)胞的遷移和分化表達(dá)逐漸減弱，并在神經(jīng)細(xì)胞的分化完成后表達(dá)停止[17]。該蛋白是目前廣泛使用的NSCs特異性標(biāo)記物[1,15]，由神經(jīng)組織分離培養(yǎng)的細(xì)胞，通過細(xì)胞免疫熒光染色認(rèn)為Nestin陽性標(biāo)記細(xì)胞即為NSCs。

本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞免疫熒光結(jié)果表明在小鼠全腦組織分離培養(yǎng)的細(xì)胞中，胎齡12.5 d組NSCs占總細(xì)胞的比例明顯高于其他三組，并約為胎齡18 d組比例的兩倍。胎齡14 d組與18 d組之間也有顯著性差異。在小鼠大腦皮層分離培養(yǎng)的細(xì)胞中，胎齡14 d 組NSCs占總細(xì)胞的比例明顯高于胎齡16 d組和胎齡18 d組。另外，由于胎齡12.5 d時(shí)小鼠的大腦發(fā)育處于初期，大腦體積較小，大腦皮層較薄，消化后所得細(xì)胞量較少且細(xì)胞死亡率較高，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成較大誤差，故本實(shí)驗(yàn)未將其結(jié)果納入分析。Real-time PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠大腦皮層發(fā)育過程中Nestin mRNA的表達(dá)水平變化，結(jié)果顯示胎齡18 d組小鼠的大腦皮層中Nestin mRNA表達(dá)水平顯著低于胎齡較小的其他三組。因此，隨著小鼠胎齡增加，小鼠大腦皮層中的Nestin mRNA表達(dá)量逐漸降低，此結(jié)果與細(xì)胞免疫熒光結(jié)果基本一致。

劉曉梅等[18]通過對(duì)胎齡8.5 d至13.5 d的Nestin-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠胚胎進(jìn)行冰凍切片，觀察發(fā)現(xiàn)Nestin隨著胚胎發(fā)育表達(dá)逐步增強(qiáng)，在胎齡11.5 d 至13.5 d時(shí)最強(qiáng)。尹曉娟等[19]通過Nestin免疫組化技術(shù)分別比較分析了不同胎齡人胎腦室下區(qū)NSCs在形態(tài)和存在方式上的差異，發(fā)現(xiàn)NSCs數(shù)量隨著胎齡的增加而減少。楊蓬勃等[20]通過HE染色和免疫組化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)人胎腦VZ/SVZ內(nèi)含有大量Nestin陽性細(xì)胞，隨著發(fā)育進(jìn)行Nestin免疫反應(yīng)強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)都逐步降低。此三者研究結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果較一致。吳雨嶺等[21]通過Nestin免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)11、15和19 d胎齡的 Wistar大鼠腦組織中Nestin陽性NSCs的分布及比例，發(fā)現(xiàn)隨著胎齡增加腦室室管膜及管膜下區(qū)NSCs逐漸增多，19 d時(shí)Nestin陽性細(xì)胞多達(dá)86.1%±11.72%，此結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果及大多數(shù)已報(bào)道實(shí)驗(yàn)結(jié)果有較大差異。

本實(shí)驗(yàn)通過將分離的腦細(xì)胞短暫貼壁培養(yǎng)后立即進(jìn)行Nestin細(xì)胞免疫熒光染色，能真實(shí)反映所分離腦組織中NSCs數(shù)量及比例，且樣品為單層細(xì)胞，便于統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)可靠性更高。另外，本方法還能檢測(cè)分離腦組織細(xì)胞過程中操作是否合格，是否因操作不足有細(xì)胞團(tuán)塊存在或操作過度有細(xì)胞死亡或細(xì)胞碎片存在等。

綜上所述，在分離培養(yǎng)小鼠NSCs實(shí)驗(yàn)中，我們推薦分離12.5 d胎齡的小鼠全腦或者14 d胎齡的小鼠大腦皮層進(jìn)行培養(yǎng)，以獲得起始純度較高的NSCs，通過快速擴(kuò)增，用于后期實(shí)驗(yàn)。

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Proportion of neural stem cells in brain tissues of miceat different embryonic days

ZHANG Feng-lan1， YANG Lu-jun2, 3， ZHU Hong-mei1， ZHANG Nan-yang1，SHA Xue-fang4， ZHU Ke-ying4， XIAO Zhi-cheng1, 5*

(1.Key Laboratory of Stem Cell And Regenerative Medicine, Institute of Molecular And Clinical Medicine, KunmingMedical University, Kunming 650500, China； 2.Department of Neurosurgery, Baoan People’s Hospital of Shenzhen,Shenzhen 518101； 3.Neurosurgery Institute, Key Laboratory on Brain Function Repair And Regeneration ofGuangdong Province, Department of Neurosurgery, Zhujiang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou510282； 4.Basic Medical College, Kunming Medical University, Kunming 650500； 5.Department of Anatomy AndDevelopmental Biology, Monash University, Clayton, Victoria 3800 Australia)

Objective To understand and compare the proportion of neural stem cells (NSCs) in the whole brain and cerebral cortex of mice at different embryonic days, and provide quantitative data for the later optimization of NSCs isolation and culture. Methods The whole brains (at embryonic 12.5, 14, 16 and 18 days) and cerebral cortex (at embryonic14, 16 and 18 days) were isolated and digested into single cell suspension, and were adherently cultured for 3-4 h.Immunofluorescence staining of Nestin, a NSCs specific marker, was used to statistically analyze the proportion of NSCs in each group.Expression of Nestin mRNA in the cerebral cortex of mice at E12.5, E14, E16, and E18 was detected by real-time fluorescence quantitative PCR. Results The result of immunofluorescence assay showed that there were Nestin-positive cells in the whole brain and cerebral cortex of mice at different embryonic days. In the whole brain,the proportion of NSCs was highest at E12.5 (53.42±1.57%) and lowest at E18(25.96±1.31%), and the proportions at E14 and E16 were placed in the middle among the groups. In the cerebral cortex, the highest proportion of NSCs was at E14 (33.65±0.29%), and the lowest at E18(25.29±0.28%), and the middle at E16 (26.82±0.30%).The result of real-time PCR showed that when the mRNA expression of Nestin in the cerebral cortex was set to 1, the relative mRNA expression of Nestin was 0.83±0.04 at E14, 0.77±0.05 at E16, and 0.44 ±0.05 at E18. Thus, the mRNA expression level of Nestin in the mouse cerebral cortex was gradually decreasing with the increase of embryonic days. Conclusions During the brain development, the proportion of NSCs is gradually decreasing in the whole brain and cerebral cortex of mice with the increase of embryonic days.

Mouse; Embryonic days; Neural stem cells; Brain development; Cerebral cortex

云南省高端人才引進(jìn)計(jì)劃(編號(hào)：20080A004)；云南省干細(xì)胞和再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(編號(hào)：2015DG027)。

張鳳蘭(1986-)，女，博士研究生，研究方向：神經(jīng)干細(xì)胞與miRNAs。Email: FenglanZhang2016@126.com

肖志成(1957-)，男，教授，博士導(dǎo)師，研究方向：神經(jīng)退行性疾病。Email: zhicheng.xiao@monash.edu

研究報(bào)告

R-33

A

1671-7856(2017) 07-0048-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.07.009

2017-01-08