劉祥濤，張瑞，馮進(jìn)輝，儀宏，吳洽慶，朱敦明，馬延和(1.中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所工業(yè)酶國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，天津300308; 2.中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所天津市生物催化技術(shù)工程中心，天津300308)

“一鍋雙酶”法制備L-天冬氨酸的工藝條件優(yōu)化

劉祥濤1，2，張瑞1，2，馮進(jìn)輝1，2，儀宏1，2，吳洽慶1，2，朱敦明1，2，馬延和1，2
(1.中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所工業(yè)酶國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，天津300308; 2.中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所天津市生物催化技術(shù)工程中心，天津300308)

L-天冬氨酸作為一種大宗氨基酸產(chǎn)品，在醫(yī)藥、食品和化工等方面有著廣泛的用途。筆者所在實(shí)驗(yàn)室成員前期已經(jīng)構(gòu)建1株含有順丁烯二酸異構(gòu)酶與L-天冬氨酸氨基裂解酶、且可直接將順丁烯二酸銨轉(zhuǎn)化成L-天冬氨酸銨的工程菌，對(duì)其培養(yǎng)基、發(fā)酵條件以及制備條件進(jìn)行優(yōu)化。得到的優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基:蛋白胨20 g/L，酵母浸粉5 g/L，NaCl 1.45 g/L，富馬酸10 g/L，NH4NO38 g/L，乳糖6 g/L，氨水調(diào)節(jié)pH至7.5。最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件:發(fā)酵罐的轉(zhuǎn)速150 r/min，通氣量1.5 L/min，最佳的接種量0.5%(體積分?jǐn)?shù))。通過(guò)發(fā)酵罐對(duì)優(yōu)化后的培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，得出1 L發(fā)酵液可以轉(zhuǎn)化1 kg順丁烯二酸銨，優(yōu)化后相同培養(yǎng)體積的菌體轉(zhuǎn)化的底物量提高了1倍。為實(shí)現(xiàn)“一鍋雙酶”法制備L-天冬氨酸工藝的規(guī)模放大奠定了基礎(chǔ)。

“一鍋雙酶”法;順丁烯二酸;L-天冬氨酸;發(fā)酵工藝優(yōu)化

L-天冬氨酸作為一種大宗氨基酸產(chǎn)品，在醫(yī)藥、食品和化工等方面有著廣泛的用途［1］。在醫(yī)藥方面，主要作為治療心臟病、肝功能促進(jìn)劑、氨解毒劑、疲勞消除劑和氨基酸輸液的主要成分，也是L-天冬氨酸鹽(鉀、鎂、鈣和鈉鹽)、丙氨酸和天門(mén)冬酰胺等多種小分子藥物的合成原料;在食品工業(yè)方面，L-天冬氨酸是一種良好的營(yíng)養(yǎng)增補(bǔ)劑，添加于各種清涼飲料，是糖代用品阿斯巴甜的主要生產(chǎn)原料;在化工方面，可以作為制造合成樹(shù)脂的原料，大量用于合成環(huán)保材料聚天冬氨酸［2］。

目前，國(guó)內(nèi)工業(yè)生產(chǎn)L-天冬氨酸的工藝如圖1所示:以苯裂解制備順丁烯二酸酐(順酐)，水解為順丁烯二酸(順?biāo)峄蝰R來(lái)酸)為原料，在無(wú)機(jī)催化劑及強(qiáng)酸性條件(pH 1左右)下轉(zhuǎn)化成反丁烯二酸(反酸或富馬酸)［3］;分離純化后的反丁烯二酸在L-天冬氨酸氨基裂解酶和過(guò)量氨的作用下催化生成L-天冬氨酸銨［4］，轉(zhuǎn)化完成的反應(yīng)液用H2SO4中和過(guò)量的氨，并利用L-天冬氨酸在等電點(diǎn)溶解度最低處析出L-天冬氨酸，分離純化得到產(chǎn)品L-天冬氨酸［5－6］。此工藝中，異構(gòu)化和銨的加成反應(yīng)都有諸多缺點(diǎn)，如:順丁烯二酸異構(gòu)化成反丁烯二酸的過(guò)程中需要在高溫、高壓、催化劑以及強(qiáng)酸性條件下進(jìn)行，這一生產(chǎn)工藝過(guò)程中產(chǎn)生大量含反丁烯二酸的強(qiáng)酸性廢水，強(qiáng)酸對(duì)設(shè)備的腐蝕性非常大［7］。

近年來(lái)，有研究者提出兩步生物法催化順丁烯二酸生產(chǎn)L-天冬氨酸［8］，首先利用順丁烯二酸異構(gòu)酶的生物催化法取代化學(xué)異構(gòu)法，在溫和條件下成功地將順丁烯二酸銨轉(zhuǎn)化成反丁烯二酸銨［9］;再利用天冬氨酸裂解酶在溫和的條件下將反丁烯二酸銨轉(zhuǎn)化成L-天冬氨酸銨，然后通過(guò)濃H2SO4等電析出L-天冬氨酸，此法在一定程度上實(shí)現(xiàn)了節(jié)能減排。但是，目前報(bào)道的順丁烯二酸異構(gòu)酶［10－13］大部分存在熱穩(wěn)定性較差、表達(dá)量低、反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)［14］，限制了此類(lèi)菌種在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用［15－17］。同時(shí)，該法需要兩種菌同時(shí)進(jìn)行發(fā)酵，對(duì)現(xiàn)有設(shè)備進(jìn)行改造，而且生產(chǎn)操作繁瑣。

筆者所在實(shí)驗(yàn)室成員通過(guò)多年研究獲得一種穩(wěn)定性及活性較高的順丁烯二酸異構(gòu)酶，并創(chuàng)新性地將順丁烯二酸異構(gòu)酶與L-天冬氨酸氨基裂解酶有效地表達(dá)在同一工程菌中，即“一鍋雙酶”法制備L-天冬氨酸的新工藝，該工藝極大簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝流程，不需要對(duì)現(xiàn)有的設(shè)備條件進(jìn)行改造，直接省去反丁烯二酸的生產(chǎn)環(huán)節(jié)，大幅降低人工、能耗及廢水的排放，為順丁烯二酸異構(gòu)酶的工業(yè)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

本文中，筆者以“一鍋雙酶”法制備L-天冬氨酸的工程菌為研究對(duì)象，利用正交法優(yōu)化該工程菌的培養(yǎng)基與發(fā)酵條件，并對(duì)生產(chǎn)L-天冬氨酸的生產(chǎn)工藝進(jìn)行改進(jìn)，以期為L(zhǎng)-天冬氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)提供基本數(shù)據(jù)。

圖1 L-天冬氨酸生產(chǎn)簡(jiǎn)圖Fig.1 Diagram of L-aspartic acid production

1 材料與方法

1.1 菌種

順丁烯二酸異構(gòu)酶Escherichia coli BL21 (DE3)-p ET24b-Mtil，簡(jiǎn)寫(xiě)為Mtil［18］;L-天冬氨酸氨基裂解酶Escherichia coli BL21(DE3)-Asp，簡(jiǎn)寫(xiě)為AspA，“一鍋雙酶”法工程菌Escherichia coli BL21 (DE3)-p ET24b-Mtil-Asp，簡(jiǎn)寫(xiě)為MA，均構(gòu)建并保存

于中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所工業(yè)酶國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試劑

蛋白胨、酵母浸粉，Oxoid公司;其他分析純?cè)噭瑖?guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 主要儀器

Gel Doc XR+凝膠成像儀、PowerPac basic蛋白電泳儀，Bio-Rad公司;GBJL-5L C型4連發(fā)酵罐，鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)有限公司;BMR-7A發(fā)酵罐，上海傲中生物工程設(shè)備有限公司。

1.4 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10，酵母浸粉5，NaCl 5，瓊脂20。

種子培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨18，酵母浸粉7，NaCl 5，富馬酸10。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨20，酵母浸粉5，NaCl 5，富馬酸10，NH4NO38。

以上培養(yǎng)基都用氨水調(diào)節(jié)pH至7.5后在121℃滅菌20 min。

1.5 底物反應(yīng)液制備

稱(chēng)取順丁烯二酸250 g加入500 mL水，然后濃氨水調(diào)節(jié)pH至8.2，蒸餾水定容至1 L，得順丁烯二酸銨(250 g/L，pH 8.2)溶液。

1.6 實(shí)驗(yàn)方法

1.6.1 菌種生長(zhǎng)量的測(cè)定

取1 mL菌液加入無(wú)菌水稀釋?zhuān)止夤舛扔?jì)測(cè)定600 nm處吸光度。

1.6.2 順丁烯二酸濃度測(cè)定

取出500μL順丁烯二酸水溶液樣品并加入500 μL鹽酸(5 mol/L)酸化，高效液相色譜(HPLC)測(cè)試前樣品再稀釋25倍，過(guò)0.22μm濾膜。HPLC檢測(cè)條件:安捷倫C18柱，流動(dòng)相為30%甲醇-醋酸水溶液(pH 3.0)，流速0.4 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm，柱溫40℃，進(jìn)樣5μL。利用去離子水分別將順丁烯二酸配制成質(zhì)量濃度為0、1、2、4、6、8和10 g/L;以順丁烯二酸濃度為橫坐標(biāo)，以液相順丁烯二酸的峰面積為縱坐標(biāo)制作相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用樣品在HPLC的峰面積得到順丁烯二酸水溶液的質(zhì)量濃度。

1.6.3 薄層層析法(TLC)檢測(cè)發(fā)酵液對(duì)底物轉(zhuǎn)化能力

將培養(yǎng)完成的20 mL菌體加入20 mL反丁烯二酸銨(200 g/L，pH 8.2)，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，42℃進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。在轉(zhuǎn)化4、5和6 h取500μL轉(zhuǎn)化液于1.5 mL EP管中，加入100μL濃鹽酸終止反應(yīng)，再加入500μL乙酸乙酯萃取，離心，取相同體積的萃取液點(diǎn)樣進(jìn)行TLC檢測(cè)。TLC法的展開(kāi)劑，V(20%甲醇)∶V(1，2-二氯乙烷)=1∶4(簡(jiǎn)寫(xiě)為20% MD)，254 nm顯色，粗略估算轉(zhuǎn)化率，轉(zhuǎn)化正常則進(jìn)行下一步轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)［18］。

1.6.4 后處理

取轉(zhuǎn)化完成的轉(zhuǎn)化液1 000 mL加入10 g活性炭，85℃熱處理1 h，過(guò)濾得到澄清液體，然后升溫至80℃［17］，用濃H2SO4調(diào)節(jié)pH至2.9左右，攪拌2 h后，抽濾0.5 h;1倍體積純水淋洗固體L-天冬氨酸后抽濾0.5 h，收集固體。重復(fù)此步驟3次，烘干至恒質(zhì)量。

1.6.5 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的鑒定

烘干后的產(chǎn)物通過(guò)400 MHz核磁共振波譜儀(AVANCE III型，Bruker公司)進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)

依次用滅菌的牙簽挑取LB固體平板上的單菌落于1 000 mL種子培養(yǎng)基中，在200 r/min、37℃條件下培養(yǎng)12 h;培養(yǎng)完成的種子培養(yǎng)液按體積分?jǐn)?shù)0.3%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在200 r/min、37℃條件下培養(yǎng)18 h。發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中每隔3 h取樣測(cè)定蛋白表達(dá)量，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知:Mtil在發(fā)酵培養(yǎng)15 h后蛋白表達(dá)基本到達(dá)峰值，延長(zhǎng)至18 h，Mtil的表達(dá)量基本不變;而AspA表達(dá)量在12 h趨于峰值，綜合考慮發(fā)酵周期設(shè)為15 h。Mtil的等電點(diǎn)為4.97，蛋白分子量為2.67×104;AspA的等電點(diǎn)為5.19，蛋白質(zhì)的分子量為5.23×104。

圖2 “一鍋雙酶”法工程菌目的蛋白表達(dá)分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of protein expression by a"one-pot two-enzyme"process

2.2 工程菌對(duì)底物轉(zhuǎn)化能力的比較

將3種工程菌進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)完成的工程菌分別進(jìn)行底物轉(zhuǎn)化，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知:Mtil對(duì)底物的轉(zhuǎn)化能力與AspA對(duì)底物的轉(zhuǎn)化能力相差近10倍，MA工程菌轉(zhuǎn)化能力受制于Mtil轉(zhuǎn)化能力。而“一鍋雙酶”法進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)時(shí)，順丁烯二酸銨在Mtil作用下生成反丁烯二酸銨，然后在AspA的作用下生成L-天冬氨酸銨，使反應(yīng)向L-天冬氨酸銨方向進(jìn)行，打破了產(chǎn)物反丁烯二酸濃度反饋抑制，使Mtil對(duì)底物的轉(zhuǎn)化能力提高了5倍。

表1 工程菌對(duì)底物轉(zhuǎn)化能力Table 1 Conversion ability of different recombinant strains with different substrate

2.3 發(fā)酵培養(yǎng)的優(yōu)化

為降低發(fā)酵成本，用乳糖代替IPTG為誘導(dǎo)劑，并對(duì)乳糖進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，考察不同質(zhì)量濃度乳糖對(duì)工程菌相對(duì)酶活的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可以看出:當(dāng)乳糖質(zhì)量濃度為6 g/L時(shí)，工程菌的相對(duì)酶活均達(dá)到峰值，但繼續(xù)增加乳糖，相對(duì)酶活變化不顯著。考慮發(fā)酵成本，因此選擇誘導(dǎo)時(shí)乳糖的質(zhì)量濃度為6 g/L。

圖3 乳糖質(zhì)量濃度對(duì)工程菌轉(zhuǎn)化底物能力影響Fig.3 Effect of the lactose on one-pot two-enzyme relative enzyme activity

氮源優(yōu)化時(shí)，選擇的有機(jī)氮源為蛋白胨，而酵母粉也可作為有機(jī)氮源的一部分進(jìn)行考察;無(wú)機(jī)氮源為NH4NO3。利用L9(34)正交試驗(yàn)來(lái)考察氮源對(duì)工程菌相對(duì)酶活的影響，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及方差分析見(jiàn)表2～4。由表2～4的結(jié)果可以分析得出:培養(yǎng)基中氮源對(duì)酶活影響的顯著性從大到小依次為蛋白胨、NH4NO3、酵母提取物。由此可見(jiàn)，該工程菌利用蛋白胨為氮源表達(dá)兩種酶的優(yōu)勢(shì)明顯高于NH4NO3，并且這2種氮源對(duì)工程菌MA的作用高于酵母提取物的。優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基為20 g/L蛋白胨、5 g/L酵母提取物、8 g/L NH4NO3。

表2 氮源的正交試驗(yàn)L9(34)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Results and design of nitrogen source orthogonal experiments

表4 氮源優(yōu)化結(jié)果的方差分析Table 4 Analysis of variance of nitrogen source

優(yōu)化后的培養(yǎng)基在3 L的發(fā)酵規(guī)模下(鎮(zhèn)江東方5 L發(fā)酵罐)對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，結(jié)果及其分析見(jiàn)表5～7。

表5 培養(yǎng)條件的正交試驗(yàn)L9(34)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Results and design of culture conditions orthogonal experiments

表6 培養(yǎng)條件優(yōu)化的極差分析Table 6 Range analysis of culture conditions orthogonal experiments

表7 培養(yǎng)條件的方差分析Table 7 Analysis of culture conditions variance

由表5～7的結(jié)果分析可知:不同發(fā)酵條件對(duì)工程菌培養(yǎng)的影響顯著性從大到小依次為通氣量、轉(zhuǎn)速、接種量。同時(shí)，筆者在純化異構(gòu)酶的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)異構(gòu)酶的活性衰退很大，分析異構(gòu)酶的序列活性中心含有巰基，推測(cè)其抗氧化能力較差［18］。當(dāng)發(fā)酵條件中的溶氧較高時(shí)影響異構(gòu)酶的活性，導(dǎo)致雙酶法中順丁烯二酸異構(gòu)酶活力較差，進(jìn)而影響雙酶法的對(duì)底物的轉(zhuǎn)化能力。優(yōu)化后的發(fā)酵條件為發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速150 r/min，通氣量1.5 L/min，接種量0.5%。

由此得到優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基:蛋白胨20 g/L，酵母浸粉5 g/L，NaCl 5 g/L，富馬酸10 g/L，NH4NO38 g/L，乳糖6 g/L，氨水調(diào)節(jié)pH至7.5。最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件:發(fā)酵罐的轉(zhuǎn)速150 r/min，通氣量1.5 L/min，最佳的接種量0.5%。

2.4 優(yōu)化后培養(yǎng)基發(fā)酵罐驗(yàn)證

搖瓶?jī)?yōu)化得到的培養(yǎng)基在上海傲中BMR-7A型發(fā)酵罐上進(jìn)行了5 L規(guī)模的發(fā)酵，轉(zhuǎn)速為200 r/min，培養(yǎng)溫度與誘導(dǎo)溫度37℃，溶氧控制在20%以上，pH控制在6.0～7.8。培養(yǎng)完成的工程菌，將發(fā)酵完成的發(fā)酵液1 L與順丁烯二酸銨4 L (250 g/L，pH 8.2)投入到轉(zhuǎn)化罐中，在42℃、200 r/min條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)化16 h完成轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表8。由表8可知:與未優(yōu)化前的培養(yǎng)基相比，優(yōu)化后相同培養(yǎng)體積的菌體轉(zhuǎn)化的底物量提高了1倍，轉(zhuǎn)化時(shí)間縮短8 h，L-天冬氨酸的質(zhì)量收率提高了1%。

表8 培養(yǎng)基優(yōu)化前后轉(zhuǎn)化工程菌對(duì)底物轉(zhuǎn)化能力比較Table 8 Comparison the conversion activity after optimization

2.5 產(chǎn)物鑒定

獲得的產(chǎn)物通過(guò)核磁鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖4。1H NMR(400 MHz，D2O)δ3.96(q，J=2.4，4.4 Hz，1H)，2.90(dd，J=4.0，8.0 Hz，2H)。由圖4可見(jiàn)，通過(guò)發(fā)酵得到的產(chǎn)品是L-天冬氨酸。

3 結(jié)論

采用基因數(shù)據(jù)庫(kù)中挖礦方法尋找合適的異構(gòu)酶和天冬氨酸裂解酶基因，構(gòu)建到同一株細(xì)菌中，并有效表達(dá)，使得該工程菌具有使順丁烯二酸異構(gòu)化為反丁烯二酸的能力和合成L-天冬氨酸的能力。表達(dá)完成的工程菌發(fā)酵液不做任何處理，直接加入到順丁烯二酸銨的轉(zhuǎn)化液中，同時(shí)對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化，優(yōu)化后相同培養(yǎng)體積的菌體轉(zhuǎn)化的底物量比較優(yōu)化前提高了1倍。目前在實(shí)驗(yàn)室條件下，可穩(wěn)定實(shí)現(xiàn)1 L發(fā)酵液轉(zhuǎn)化1 kg順丁烯二酸銨，L-天冬氨酸的質(zhì)量收率達(dá)99%。后續(xù)將在工業(yè)生產(chǎn)條件下驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)的相關(guān)結(jié)果，期望本生產(chǎn)工藝后續(xù)將能夠成功實(shí)現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用，充分發(fā)揮其環(huán)保優(yōu)勢(shì)，為提升企業(yè)經(jīng)濟(jì)效應(yīng)發(fā)揮重要作用。

圖4 產(chǎn)物鑒定的核磁譜圖Fig.4 Product identification by1H NMR

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［17］FISCH F，CARLOS M F，MARIE D，et al．A covalent succinylcysteine-like intermediate in the enzyme-catalyzed transformation of maleate to fumarate by maleate isomerase［J］．J Am Chem Soc，2010，132:11455-11457．

［18］劉祥濤，趙青，任杰，等．順丁烯二酸異構(gòu)酶工程菌發(fā)酵條件優(yōu)化［J］．應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2011，17(4):558-562．

(責(zé)任編輯荀志金)

Optimizing of L-aspartic acid production by a"one-pot two-enzyme"process

LIU Xiangtao1，2，ZHANG Rui1，2，F(xiàn)ENG Jinhui1，2，YI Hong1，2，WU Qiaqing1，2，ZHU Dunming1，2，MA Yanhe1，2
(1.National Engineering Laboratory for Industrial Enzymes，Tianjin Institute of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308，China;2.Tianjin Engineering Research Center Of Biocatalytic Technology，Tianjin Institute of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308，China)

L-aspartic acid has been widely used in medicine，food and chemical industries．It is currently produced by a chemoenzymatic process at industrial scale．We have developed a"one-pot two-enzyme" process for the production of L-aspartic acid，which involves a maleate cis-trans isomerase and an laspartic acid amino lyase that are highly co-expressed in Escherichia coli．The fermentation conditions were optimized by orthogonal experimental design to improve the enzyme production．The optimum medium composition was as follows(g/L):tryptone 20，yeast extract 5，NaCl 5，fumaric acid 10，NH4NO38，lactose 6，and pH 7.5．The optimum conditions were as follow:rotational speed 150 r/min，ventilation 1.5 L/min，inoculum concentration 0.5%．The enzyme activity was two times higher than that before optimization，thus enabling the scale-up of the process to ensure the production of l-aspartic acid at industrial scale by this"one-pot two-enzyme"process．

one-pot two-enzyme process;maleic acid;L-aspartic acid;fermentation optimization

TQ922

A

1672－3678(2017)04－0045－06

10.3969/j.issn.1672－3678.2017.04.008

2017－04－21

天津市科技計(jì)劃(13ZCZDSY05200)

劉祥濤(1984—)，男，山東臨沂人，助理研究員，研究方向:生物催化與綠色化工;吳洽慶(聯(lián)系人)，研究員，E-mail:wu_qq@tib．cas．cn