郭超林，丁重陽(yáng)，陸健，顧正華，張梁，石貴陽(yáng)(1．江南大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122; 2．江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122)

阿魏蘑與膠紅酵母共培養(yǎng)中促進(jìn)產(chǎn)漆酶物質(zhì)的初步研究

郭超林1，2，丁重陽(yáng)1，2，陸健1，2，顧正華1，2，張梁1，2，石貴陽(yáng)1，2
(1．江南大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122; 2．江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122)

阿魏蘑在液態(tài)發(fā)酵過(guò)程中經(jīng)膠紅酵母共培養(yǎng)后，漆酶的產(chǎn)量得到提高，但對(duì)其起促進(jìn)作用的物質(zhì)尚不清楚。本文中，筆者首先考察阿魏蘑和膠紅酵母發(fā)酵上清液混合對(duì)漆酶酶活測(cè)定的影響，發(fā)現(xiàn)膠紅酵母并沒(méi)有表達(dá)漆酶的能力，同時(shí)，發(fā)酵上清液的混合會(huì)導(dǎo)致漆酶酶活的下降。因此，排除了兩種微生物發(fā)酵液之間發(fā)生的協(xié)同或促進(jìn)作用對(duì)漆酶酶活的影響。在分別添加高溫滅活和70℃滅活的膠紅酵母后發(fā)現(xiàn)，添加30 g/L的70℃滅活的膠紅酵母，阿魏蘑漆酶酶活增加至6 605 U/L，而高溫滅活未有相應(yīng)的促進(jìn)效果。因此，在共培養(yǎng)中促進(jìn)漆酶合成的活性物質(zhì)存在于酵母中并對(duì)溫度敏感。通過(guò)比較70℃滅活膠紅酵母的添加時(shí)間和添加量后，在阿魏蘑培養(yǎng)第2天添加50 g/L膠紅酵母獲得最高漆酶產(chǎn)量7 579 U/L。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)了膠紅酵母中某種對(duì)熱敏感的物質(zhì)促進(jìn)了阿魏蘑漆酶表達(dá)量的提高，此結(jié)果對(duì)研究漆酶及其他發(fā)酵產(chǎn)物在共培養(yǎng)中表達(dá)量的提高有重要意義。

漆酶;共培養(yǎng);促進(jìn)物質(zhì);熱處理酵母細(xì)胞;Pleurotus ferulae;Rhodotorula mucilaginosa

漆酶(EC 1.10.3.2)是一種含銅的多酚氧化酶，屬于銅藍(lán)氧化酶蛋白家族［1］，被廣泛應(yīng)用于污廢水處理［2］、生物制漿［3］和染料脫色［4］等領(lǐng)域。在自然界中，白腐真菌是漆酶主要合成菌，但是白腐真菌漆酶產(chǎn)量一般較低，尚不能滿足工業(yè)需求?；瘜W(xué)誘導(dǎo)［5－6］以及重組表達(dá)［7］等方式可以提高漆酶產(chǎn)量，但是當(dāng)下已發(fā)現(xiàn)的有效誘導(dǎo)劑一般價(jià)格昂貴或其本身具有毒性［8－9］，后續(xù)要進(jìn)行脫毒處理;重組表達(dá)則存在前期投入大、穩(wěn)定性稍差等問(wèn)題。近年來(lái)，有越來(lái)越多的研究者報(bào)道了通過(guò)微生物共培養(yǎng)來(lái)提高漆酶產(chǎn)量［10－13］。相較于前兩種方法，共培養(yǎng)作為一種促進(jìn)產(chǎn)漆酶的溫和技術(shù)，具有廣闊的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用前景。

課題組之前的研究中［14］，發(fā)現(xiàn)阿魏蘑與膠紅酵母通過(guò)共培養(yǎng)，漆酶酶活達(dá)到約8 000 U/L，較單培養(yǎng)提高了1.2倍左右，但促進(jìn)酶活提高的物質(zhì)尚不清楚。在本研究中，筆者嘗試從發(fā)酵上清液的協(xié)同作用、生物量、促進(jìn)因子等方面的變化，初步探究阿魏蘑與膠紅酵母共培養(yǎng)促進(jìn)產(chǎn)漆酶的物質(zhì)與機(jī)制，為進(jìn)一步通過(guò)共培養(yǎng)促進(jìn)產(chǎn)漆酶的研究提供一定的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

阿魏蘑(Pleurotus ferulae)JM30X與膠紅酵母(Rhodotorula mucilaginosa)JB401，保存于江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA斜面培養(yǎng)基(g/L):馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂20，pH自然。用于阿魏蘑菌種保藏。

YPD液體培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨20，酵母膏10，葡萄糖20，pH自然。用于膠紅酵母種子培養(yǎng)。

麩皮基本培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20，玉米粉10，麩皮粉10，K2SO40.174 2，初始pH 9.0。用于阿魏蘑的種子培養(yǎng)和液體發(fā)酵培養(yǎng)。

1.1.3 主要試劑

酵母膏、蛋白胨，英國(guó)Oxoid公司;葡萄糖、K2SO4等，國(guó)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑有限公司;2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)，BBI生命科學(xué)有限公司;麩皮粉、玉米粉、馬鈴薯，購(gòu)自當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

阿魏蘑種子培養(yǎng):取2塊0.5 cm2大小的菌塊，接種于80 mL種子培養(yǎng)基中，150 r/min、25℃培養(yǎng)7 d。

膠紅酵母種子培養(yǎng):用接種環(huán)劃取適量膠紅酵母，接種于80 mL YPD液體培養(yǎng)基中，200 r/min、30℃培養(yǎng)48 h。

阿魏蘑單培養(yǎng):向150 mL基本培養(yǎng)基中加入體積分?jǐn)?shù)3%的種子培養(yǎng)基，150 r/min、25℃培養(yǎng)7 d。

阿魏蘑與膠紅酵母共培養(yǎng):在阿魏蘑單培養(yǎng)48 h后，接種體積分?jǐn)?shù)3%的膠紅酵母種子，繼續(xù)培養(yǎng)5 d。

1.2.2 發(fā)酵上清液的制備

阿魏蘑單培養(yǎng)、膠紅酵母單培養(yǎng)、阿魏蘑與膠紅酵母共培養(yǎng)結(jié)束后，得到的發(fā)酵液在8 000 r/min條件下離心5 min，即可獲得實(shí)驗(yàn)所用的阿魏蘑上清液、膠紅酵母上清液和共培養(yǎng)上清液;需要無(wú)菌處理的，再經(jīng)過(guò)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾除菌。

1.2.3 生物量的測(cè)定

在發(fā)酵至第7天分別收獲單培養(yǎng)和共培養(yǎng)菌體，先用粗紗布過(guò)濾以除去培養(yǎng)基殘?jiān)凸才囵B(yǎng)發(fā)酵液中的膠紅酵母細(xì)胞，然后用濾紙蘸吸水分。獲得的菌絲體置于提前干燥至恒質(zhì)量的濾紙上，在80℃烘干24 h后再次稱質(zhì)量。

1.2.4 滅活及熱處理膠紅酵母的獲得

培養(yǎng)并收集大量膠紅酵母菌體，將膠紅酵母在121℃高溫滅菌20 min，即獲得滅活膠紅酵母。通過(guò)溫度梯度實(shí)驗(yàn)，研究不同溫度下熱處理1 h膠紅酵母的致死率，以確定能殺死所有酵母的最低溫度。培養(yǎng)并在無(wú)菌條件下收集膠紅酵母菌體，然后將膠紅酵母細(xì)胞在該溫度下熱處理1 h，即獲得熱處理膠紅酵母。

1.2.5 漆酶酶活測(cè)定方法

以ABTS為底物［15］，在1 mL反應(yīng)體系中，含有880μL 0.1 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 4.5)，100μL終濃度1 mmol/L的ABTS底物和20μL稀釋一定倍數(shù)的粗酶液(須使最終的吸光值在0.2～0.8之間)，在30℃下反應(yīng)5 min后，在420 nm下測(cè)定其吸光值(以熱滅活的酶液為空白對(duì)照)。定義每分鐘氧化1μmol ABTS底物所需要的酶量為1個(gè)酶活單位(U)。酶活按式(1)計(jì)算。

式中:A1代表空白對(duì)照的吸光值;A2代表反應(yīng)后的吸光值;t代表反應(yīng)的時(shí)間;ε代表ABTS的摩爾吸光系數(shù)，3.6×104L/(mol·cm)。

2 結(jié)果與討論

2.1 阿魏蘑上清液與膠紅酵母上清液混合后的酶活水平變化

漆酶的酶活水平除了跟表達(dá)量有關(guān)外，還受到反應(yīng)體系中溫度、pH、促進(jìn)劑和抑制劑等的影響，其中已確定Cu2+、Mn2+、Zn2+等金屬離子對(duì)漆酶的活性有明顯的促進(jìn)作用［16－17］。之前研究發(fā)現(xiàn)阿魏蘑的漆酶活力經(jīng)與膠紅酵母共培養(yǎng)后提高了約1.2倍，而促進(jìn)其提高的物質(zhì)和機(jī)制尚不清楚，因此，本文中，筆者首先探究在共培養(yǎng)過(guò)程中，兩種發(fā)酵上清液之間是否存在協(xié)同或促進(jìn)作用，從而致使漆酶酶活水平的提高。

將阿魏蘑和膠紅酵母發(fā)酵上清液按一定的比例混合后，30℃振蕩溫育10 min，測(cè)定漆酶酶活變化，結(jié)果如表1所示。

表1 阿魏蘑上清液與膠紅酵母上清液混合后的漆酶酶活Table 1 Enzyme activity of supernatant mixture of Pleurotus ferulae and Rhodotorula mucilaginosa

由表1可知:膠紅酵母并不能分泌漆酶，當(dāng)阿魏蘑上清液與膠紅酵母上清液以不同比例混合后，漆酶酶活隨著加入膠紅酵母上清液體積的增多，混合液的漆酶酶活呈線性降低的趨勢(shì)。以上結(jié)果說(shuō)明阿魏蘑與膠紅酵母共培養(yǎng)過(guò)程中，并不是兩種微生物發(fā)酵液之間發(fā)生的協(xié)同或促進(jìn)作用導(dǎo)致漆酶酶活的提高，而應(yīng)該是膠紅酵母細(xì)胞與阿魏蘑菌絲體之間或者是某些物質(zhì)與阿魏蘑菌絲體之間的相互作用，最終促進(jìn)阿魏蘑漆酶表達(dá)量的提高。

2.2 單/共培養(yǎng)過(guò)程中阿魏蘑生物量的變化

對(duì)于組成型的微生物漆酶，其表達(dá)量一般跟漆酶生產(chǎn)菌的生物量呈正相關(guān)的關(guān)系。將阿魏蘑菌體干燥后稱質(zhì)量，得到單培養(yǎng)時(shí)阿魏蘑菌體干質(zhì)量為15.1 g/L，共培養(yǎng)時(shí)阿魏蘑菌體干質(zhì)量為14.3 g/L。即共培養(yǎng)時(shí)阿魏蘑菌體質(zhì)量并沒(méi)有增加，且較單培養(yǎng)略少，但相差不大。結(jié)果說(shuō)明共培養(yǎng)時(shí)漆酶產(chǎn)量的提高不是阿魏蘑生物量增加所致，推斷有可能是培養(yǎng)體系中的某些活性物質(zhì)作用于阿魏蘑細(xì)胞，促進(jìn)了其單個(gè)細(xì)胞表達(dá)和分泌漆酶的能力，最終表現(xiàn)為漆酶酶活的提高。

2.3 不同發(fā)酵上清液對(duì)阿魏蘑產(chǎn)漆酶的影響

將制備的膠紅酵母和共培養(yǎng)發(fā)酵上清液用0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌，然后在第2天時(shí)添加到阿魏蘑發(fā)酵培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)5天，發(fā)酵完成后進(jìn)行酶活測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，單純添加膠紅酵母上清液會(huì)抑制阿魏蘑漆酶的合成，酶活降至2 559 U/L，而添加共培養(yǎng)上清液后，漆酶酶活與阿魏蘑單培養(yǎng)時(shí)酶活相近，但也稍有降低，說(shuō)明在發(fā)酵液中不存在促進(jìn)阿魏蘑產(chǎn)漆酶的物質(zhì)。因此，膠紅酵母促進(jìn)阿魏蘑產(chǎn)漆酶的物質(zhì)可能存在于酵母細(xì)胞中。

圖1 添加膠紅酵母與共培養(yǎng)上清液對(duì)漆酶酶活的影響Fig.1 Effects of adding the supernatant of coculture and Rhodotorula mucilaginosa on laccase production

2.4 不同溫度滅活的膠紅酵母菌體對(duì)阿魏蘑產(chǎn)漆酶的影響

為排除膠紅酵母生長(zhǎng)和代謝對(duì)阿魏蘑產(chǎn)漆酶的影響，酵母經(jīng)高溫滅活后添加于單培養(yǎng)48 h的阿魏蘑中，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知:經(jīng)高溫滅活的膠紅酵母不同添加量下，漆酶酶活與阿魏蘑單培養(yǎng)酶活相近，并未顯示相應(yīng)的漆酶產(chǎn)量促進(jìn)作用。這可能是由于酵母中的共培養(yǎng)促進(jìn)物質(zhì)對(duì)高溫較敏感，因此應(yīng)當(dāng)嘗試在較溫和的溫度下熱處理膠紅酵母一定時(shí)間后，再添加至阿魏蘑培養(yǎng)基中，既保證能殺死酵母細(xì)胞，又能在一定程度上減少對(duì)膠紅酵母菌體中活性物質(zhì)的破壞。

圖2 添加不同濕質(zhì)量高溫滅菌膠紅酵母菌體對(duì)漆酶酶活的影響Fig.2 Effects of adding different wet weight Rhodotorula mucilaginosa after high temperature sterilization on laccase production

圖3 不同熱處理溫度對(duì)膠紅酵母的滅活效果Fig.3 Inactivation effects of different heat-treated temperature on Rhodotorula mucilaginosa

將膠紅酵母菌體分別在55、60、65和70℃下水浴處理1 h后，以平板涂布的方式考察不同熱處理溫度的滅活效果，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知:經(jīng)55℃熱處理1 h后，膠紅酵母菌落數(shù)減少50%以上，且隨著溫度的升高，菌落數(shù)迅速降低，當(dāng)70℃熱處理1 h后，可以完全實(shí)現(xiàn)膠紅酵母細(xì)胞的滅活。在70℃下熱處理膠紅酵母1 h后，添加30 g/L的滅活酵母菌體于培養(yǎng)48 h的阿魏蘑，并繼續(xù)培養(yǎng)5 d后進(jìn)行酶活測(cè)定，發(fā)現(xiàn)漆酶酶活提高至6 605 U/L。此結(jié)果表明，在阿魏蘑和膠紅酵母共培養(yǎng)中，阿魏蘑漆酶表達(dá)量的提高主要是由于膠紅酵母細(xì)胞中的某種活性物質(zhì)，同時(shí)此活性物質(zhì)對(duì)溫度敏感，且高溫下該物質(zhì)容易失活。之前的研究中也有類似的結(jié)果，在L.plantarum NC8與一些革蘭氏陽(yáng)性菌共培養(yǎng)產(chǎn)細(xì)菌素NC8的研究中，發(fā)現(xiàn)添加55℃熱處理的革蘭氏陽(yáng)性菌菌體可以誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)菌素NC8，而添加高溫滅菌和無(wú)細(xì)胞上清液則不能誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)菌素［18］。

2.5 熱處理膠紅酵母最佳添加時(shí)間和添加量的研究

為進(jìn)一步提高阿魏蘑的漆酶產(chǎn)量，筆者首先研究了70℃熱處理膠紅酵母的添加時(shí)間對(duì)漆酶產(chǎn)量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知:在不同時(shí)間添加30 g/L的酵母后，阿魏蘑繼續(xù)培養(yǎng)至第7天后發(fā)現(xiàn)，隨著添加時(shí)間的往后推移，漆酶酶活呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在第2天時(shí)酶活水平達(dá)到最高，漆酶酶活約為6 500 U/L，因此選擇在阿魏蘑培養(yǎng)至第2天進(jìn)行熱處理膠紅酵母的添加。

圖4 熱處理膠紅酵母添加時(shí)間對(duì)漆酶酶活的影響Fig.4 Effects of the time of adding Rhodotorula mucilaginosa after heat treatment at 70℃

在阿魏蘑培養(yǎng)至第2天時(shí)，向其培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量的熱處理膠紅酵母，結(jié)果如圖5所示。由圖5可以看出，隨著滅活膠紅酵母添加量的提高，漆酶酶活先是呈逐漸升高的趨勢(shì)，當(dāng)添加50 g/L的滅活膠紅酵母菌體時(shí)，漆酶酶活達(dá)到最高水平，添加量繼續(xù)提高時(shí)漆酶酶活開(kāi)始有所下降。最終確定非活性膠紅酵母最佳添加時(shí)間為阿魏蘑培養(yǎng)至第2天，添加量50 g/L，漆酶酶活可達(dá)到7 579 U/L，約為對(duì)照組的2.1倍，基本達(dá)到了阿魏蘑與膠紅酵母共培養(yǎng)時(shí)的酶活水平。

圖5 熱處理膠紅酵母添加量對(duì)漆酶酶活的影響Fig.5 Effects of the amount of adding Rhodotorula mucilaginosa after heat treatment at 70℃

3 結(jié)論

阿魏蘑上清液與膠紅酵母上清液混合后，隨著膠紅酵母上清液比例的增加，漆酶活力呈線性降低的趨勢(shì)，且共培養(yǎng)后阿魏蘑生物量較單培養(yǎng)略少，因此上清液之間的協(xié)同促進(jìn)作用和阿魏蘑生物量變化都不是致使阿魏蘑漆酶酶活提高的原因。經(jīng)過(guò)70℃熱處理，膠紅酵母菌體對(duì)阿魏蘑產(chǎn)漆酶有顯著的促進(jìn)作用，而經(jīng)高溫滅菌的膠紅酵母則沒(méi)有促進(jìn)作用，說(shuō)明膠紅酵母菌體中含有某種能促進(jìn)阿魏蘑產(chǎn)漆酶的促進(jìn)因子，且該促進(jìn)因子是一種對(duì)熱不穩(wěn)定的物質(zhì)。此外，筆者對(duì)70℃滅活膠紅酵母的添加時(shí)間和添加量進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)在阿魏蘑培養(yǎng)至48 h時(shí)，添加50 g/L的熱處理膠紅酵母，漆酶酶活提高至7 579 U/L。研究結(jié)果為進(jìn)一步明確共培養(yǎng)過(guò)程中具有促進(jìn)作用的物質(zhì)及其促進(jìn)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯管珺)

Compound to enhance laccase production in co-culture of Pleurotus ferulae and Rhodotorula mucilaginosa

GUO Chaolin1，2，DING Zhongyang1，2，LU Jian1，2，GU Zhenghua1，2，ZHANG Liang1，2，SHI Guiyang1，2
(1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology of the Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China;2.National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

Laccase production of Pleurotus ferulae was enhanced by the co-culture with Rhodotorula mucilaginosa and the compound enhancing laccase production was not clear．In this study，no laccase activity was detected in R．mucilaginosa culture broth and no enhanced laccase production was found after mixing culture broth of P．ferulae and R．mucilaginosa．Therefore，enhancement of laccase production in coculture was not brought by simply mixing broth of Pleurotus ferulae and R．mucilaginosa．The results showed that the addition of 30 g/L R．mucilaginosa cells heat-treated by 70℃improved laccase production，which was improved to 6 605 U/L，whereas sterilized cells had no influence on laccase production．The possible compound，which was responsible for enhancing effect in co-culture，was sensitive to temperature．After optimizing adding time and adding amount，the highest laccase production wasobtained by adding 50 g/L treated yeast cells to 2-day cultured P．ferulae，which was 7 579 U/L．Depending on this study，some compounds sensitive to temperature enhanced laccase production of P．ferulae and will be investigated in further research.

laccase;coculture;promoting factor;heat-treated cell;Pleurotus ferulae;Rhodotorula mucilaginosa

Q815

A

1672－3678(2017)04－0040－05

10.3969/j.issn.1672－3678.2017.04.007

2016－03－31

國(guó)家自然科學(xué)基金(31571822)

郭超林(1990—)，男，河南周口人，研究方向:發(fā)酵工學(xué);丁重陽(yáng)(聯(lián)系人)，教授，E-mail:zyding@jiangnan．edu．cn;陸健(聯(lián)系人)，教授，E-mail:jlu@jiangnan．edu．cn