朱麗清，陳泳，冷波，潘裕添(.閩南師范大學(xué)菌物產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)中心，福建漳州363000;.漳州出入境檢驗(yàn)檢疫局，福建漳州363000)

液質(zhì)聯(lián)用檢測果蔬中阿維菌素、甲維鹽的殘留

朱麗清1，陳泳2，冷波1，潘裕添1
(1.閩南師范大學(xué)菌物產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)中心，福建漳州363000;2.漳州出入境檢驗(yàn)檢疫局，福建漳州363000)

建立利用分散固相萃取-高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(QuEChERS-LC/MS/MS)同時測定蔬菜和水果中阿維菌素和甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽(甲維鹽)殘留的方法。均質(zhì)樣品經(jīng)過醋酸乙腈提取，由N-丙基乙二胺(PSA)吸附劑分散固相萃取凈化后，利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分離測定，并對質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明:碰撞氣34 475 Pa、氣簾氣103 425 Pa、霧化氣344 750 Pa、輔助加熱氣172 375 Pa、離子噴霧電壓5 500 V以及去溶劑溫度300℃時，檢測靈敏度最高。對3種蔬菜和水果樣品中添加阿維菌素和甲維鹽，進(jìn)行2個水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個水平重復(fù)6次，3種樣品的平均回收率范圍為81.3%～112.9%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.802%～11.506%，達(dá)到技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)要求。該方法被證實(shí)是穩(wěn)定、高效的，可適用于多種蔬菜水果中阿維菌素和甲維鹽的測定。

分散固相萃取-高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜;阿維菌素;甲維鹽;農(nóng)產(chǎn)品檢測

阿維菌素是一類具有殺蟲、殺線蟲活性的十六元大環(huán)內(nèi)酯化合物，而甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽(甲維鹽)是以阿維菌素為原料經(jīng)過結(jié)構(gòu)修飾而得到的一種高效生物殺蟲劑［1］。因?yàn)樗?dú)特的致毒機(jī)理，使甲維鹽成為高效、廣譜的新型抗生素類的殺蟲劑，同時，由于甲維鹽對線蟲與節(jié)肢動物驅(qū)殺效果顯著，已被廣泛應(yīng)用于果蔬蟲害的防治［2－4］，屬于一種高效低毒生物殺蟲劑［5］。歐盟規(guī)定最大殘留限量值為0.01 mg/kg，我國規(guī)定最大殘留限量值為0.02～0.05 mg/kg［6］。

分散固相萃取(QuEChERS)技術(shù)是由美國學(xué)者于2002年提出的農(nóng)藥殘留快速提取的方法［7］。它能提供高質(zhì)量的農(nóng)藥殘留分析，是一種快速、簡潔、低成本的前處理方法，最近幾年來發(fā)展迅速。經(jīng)多方研究學(xué)者反復(fù)多次實(shí)驗(yàn)證實(shí)QuEChERS法可檢測200多種農(nóng)藥，其中包括含有脂肪的介質(zhì)體系［8－10］。QuEchERS法的主要步驟是:樣品在傳統(tǒng)萃取液乙腈中添加1%醋酸后進(jìn)行浸提，混勻后加入無水MgSO4和醋酸鈉，充分振蕩促使其分層，再將浸提液移到吸附劑(PSA)、MgSO4的離心管后進(jìn)行離心，將離心上清液通過GC/MS(氣質(zhì)聯(lián)用)或LC/MS進(jìn)行測定。

本文中采用分散固相萃取-高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，以創(chuàng)建可以同時測定果蔬中阿維菌素和甲維鹽的方法，以期能適用于果蔬中阿維菌素和甲維鹽的檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器、材料與試劑

API 4000四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國AB公司; 1200 Series液相色譜儀，美國Agilent公司;T25型高速分散機(jī)，德國IKA公司;3-30K型高速冷凍離心機(jī)，Sigma公司;QT-2型旋渦混合器，上海琪特分析儀器有限公司;MilliQ高純水發(fā)生器，美國Millipore公司;XP204型分析天平(可讀性0.1 mg)，瑞士Mettler公司。

毛豆、白花菜和蜜柚3種待測樣品，市售。阿維菌素和甲維鹽標(biāo)準(zhǔn)品(純度均為99%)，Sigma-Aldrich公司;甲酸(色譜純)，美國Fluka公司;無水MgSO4、無水醋酸鈉(優(yōu)質(zhì)純)，美國Waters公司;乙腈(色譜純)，德國Merck公司;乙二胺N-丙基硅烷吸附劑(PSA，粒徑40μm)，美國Waters公司;實(shí)驗(yàn)用水均為高純水。

1.2 試劑配制

1.2.1 單一標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

分別精密稱取阿維菌素0.020 1 g、甲維鹽0.020 8 g標(biāo)準(zhǔn)品于不同的50 mL容量瓶中，用乙腈定容，避光保存，待用。該溶液可在0～4℃存放6個月，質(zhì)量濃度分別為402和416μg/mL。

1.2.2 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

分別準(zhǔn)確移取上述的2個單標(biāo)儲備液124、120 μL于50 mL的容量瓶，采用乙腈定容，稀釋成1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，用于添加回收實(shí)驗(yàn)和制備標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，4℃條件下避光保存。

1.2.3 基質(zhì)匹配溶液的配制

基質(zhì)匹配溶液的配制情況見表1。

表1 基質(zhì)匹配溶液配制Table 1 Matrix matching solution preparation

1.3 方法

1.3.1 制樣

分別取毛豆、白花菜和蜜柚3種待測樣品500 g，使用組織搗碎機(jī)搗碎均勻，放入潔凈的盛樣袋內(nèi)，密封后標(biāo)明標(biāo)記。將待測樣于－4℃條件下冰箱冷凍保藏。

1.3.2 提取及凈化

準(zhǔn)確稱取10.00 g攪碎后的待測樣品，精確至0.01 g，放入50 mL離心管中，加19.8 mL乙腈，0.2 mL醋酸，再加入1.5 g無水醋酸鈉和6 g無水MgSO4，用均質(zhì)器以15 000 r/min高速均質(zhì)1 min后，以3 000 r/min離心5 min。取6 mL上層乙腈提取液于裝有900 mg無水MgSO4和150 mg PSA的離心管中，旋渦混合1 min后，以3 000 r/min離心5 min，取0.75 mL上清液與水1∶1體積比混合均勻。經(jīng)0.2μm微孔濾膜過濾，待測［11］。

1.3.3 優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)

對氣簾氣(CUR)、霧化氣(GS1)、輔助加熱氣(GS2)、離子噴霧電壓(IS)、去溶劑溫度(TEM)和調(diào)節(jié)碰撞氣(CAD)6個參數(shù)分別進(jìn)行優(yōu)化，即改變其中1個參數(shù)時，其他5個參數(shù)不變，最終選擇信號最佳時的參數(shù)值為該參數(shù)的優(yōu)化值。

1.4 儀器條件

1.4.1 HPLC條件

色譜柱CORTECS C18(100 mm×2.1 mm，2.7 μm)，柱溫為35℃，進(jìn)樣量為10μL。

表2 梯度洗脫流動相及流速Table 2 Gradient elution mobile phase and flow rate

1.4.2 MS/MS條件

電噴霧離子源(ESI)，離子噴霧電壓5 500 V;氣簾氣流速15 mL/min;霧化器流速50 mL/min;碰撞氣(N2)流速5 mL/min;輔助加熱氣流速25 mL/min;去溶劑溫度300℃;正離子模式;動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(Dynamic MRM)方法采集，質(zhì)譜采集速率100 ms/轉(zhuǎn)，其他參數(shù)見表3。

表3 阿維菌素和甲維鹽的母離子、子離子及碰撞能量和去簇電壓Table 3 Avermectin and emamectin's mother ion，subion，impact energy and cluster voltage

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

ESI離子源為軟電離方式，阿維菌素和甲維鹽在ESI離子源內(nèi)與H+、NH4+等結(jié)合形成準(zhǔn)分子離子峰。因?yàn)榧装被⒕S菌素在自然界不穩(wěn)定，經(jīng)過化學(xué)修飾后是以甲維鹽的形式相對穩(wěn)定存在，甲維鹽分子量為1 008.24［12］。本實(shí)驗(yàn)對標(biāo)準(zhǔn)品甲維鹽進(jìn)行了母離子掃描(MS scan)獲得了一級質(zhì)譜圖，在掃描圖里沒有發(fā)現(xiàn)［M+H］(m/z為1 009.2)的離子峰，這是由于甲維鹽在水介質(zhì)中已經(jīng)完全解離成甲氨基阿維菌素(C19H75NO13，分子量為886.4)與苯甲酸鹽(C7H6O2，分子量為122)，因此本實(shí)驗(yàn)是以甲氨基阿維菌素為檢測目標(biāo)。甲氨基阿維菌素是以準(zhǔn)分子離子峰［M-C7H5O2+H］(m/z為886.4)的形式存在。實(shí)驗(yàn)對阿維菌素也進(jìn)行了母離子掃描(MS scan)獲得一級質(zhì)譜圖，得知阿維菌素的準(zhǔn)分子離子峰為［M+NH4+］(m/z為890.6)。

離子源去溶劑氣體溫度、離子噴霧電壓等因素對阿維菌素和甲維鹽的離子加合物形態(tài)有較大的影響，為此本實(shí)驗(yàn)通過優(yōu)化了去溶劑氣溫度、離子噴霧電壓等參數(shù)，為使母離子強(qiáng)度達(dá)到最高，結(jié)果見圖1。

由圖1(a)可知，當(dāng)碰撞氣(CAD)選擇34 475 Pa時，阿維菌素和甲維鹽的檢出信號最高。由圖1 (b)可知，當(dāng)氣簾氣(CUR)選擇103 425 Pa時，阿維菌素和甲維鹽的檢出信號最高。由圖1(c)可知，當(dāng)霧化氣(GS1)選擇344 750 Pa時，阿維菌素和甲維鹽的檢出信號最強(qiáng)。由圖1(d)可知，對于甲維鹽，當(dāng)離子噴霧電壓(IS)為4 500 V時，其信號值最高，但是阿維菌素的信號值卻是在IS為5 500 V時最高。由于甲維鹽在IS為5 500 V時的信號值與4 500 V時的信號值相差不大，而阿維菌素卻有顯著差異，綜合考慮，實(shí)驗(yàn)最終選擇了IS為5 500 V。由圖1(e)可知，當(dāng)去溶劑溫度(TEM)為200℃時，阿維菌素的信號值最高，但甲維鹽的信號值卻最低，綜合考慮到兩種物質(zhì)的檢出信號，實(shí)驗(yàn)最終選擇TEM為300℃，雖然這個時候兩種物質(zhì)信號值均不是最高，但是跟最大值的差距不大。由圖1(f)可知，當(dāng)輔助加熱氣(GS2)選擇172 375 Pa時，阿維菌素和甲維鹽的檢出信號最高。由圖1可得最優(yōu)參數(shù)組合為CAD為34 475 Pa，CUR為103 425 Pa，GS1為344 750 Pa，IS為5 500 V，TEM為300℃，GS2為172 375 Pa。

2.2 線性范圍與檢出限

對空白毛豆、白花菜和蜜柚進(jìn)行基質(zhì)配標(biāo)，制得不同濃度的5種阿維菌素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按本實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測定，以3倍空白基質(zhì)信噪比計算出方法的檢出限，以10倍信噪比計算方法定量下限。阿維菌素檢出限為0.4μg/kg，甲維鹽的檢出限為0.9 μg/kg。分別以各化合物定量離子的峰面積對濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到阿維菌素和甲維鹽的回歸方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)(r)，見表4。由表4可知，在各自的定量下限至200μg/L時，目標(biāo)物的峰面積(Y)與其質(zhì)量濃度的線性關(guān)系良好，r均達(dá)到0.998 7以上。2.3本方法的平均回收率與精密度

圖1 碰撞氣(CAD)，氣簾氣(CUR)，霧化氣(GS1)，去溶劑溫度(TEM)，離子噴霧電壓(IS)和輔助加熱氣(GS2)對阿維菌素和甲維鹽檢出信號的影響Fig.1 Effects of CAD，CUR，GS1，TEM，IS and GS2 for avermectin and emamectin detection signal

表4 阿維菌素和甲維鹽的線性方程、相關(guān)系數(shù)(r)、檢出限和定量下限Table 4 Avermectin and emamectin's linear equation，correlation coefficient(r)，idetection limit and quantification offline

以毛豆、白花菜和蜜柚3種果蔬作為空白基質(zhì)進(jìn)行了2個水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)(n=6)，它們的添加水平均為10、20μg/kg，平均回收率和精密度結(jié)果見表5。由表5可知，阿維菌素和甲維鹽的平均回收率為81.3%～112.9%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為 1.802%～11.506%。

圖2為2種化合物在白花菜中10μg/kg添加水平的提取離子色譜圖。由圖2可以看出，空白樣品的背景并未干擾到目標(biāo)分析物的測定，并不影響實(shí)際樣品中阿維菌素和甲維鹽的定性和定量分析。

表5 阿維菌素和甲維鹽在水果、蔬菜中的平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 5 Avermectin and emamectin in fruits，vegetables，standard addition recoveries and relative standard deviation(n=6)

圖2 甲維鹽的白花菜基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液(10μg/kg)的提取離子色譜Fig.2 Extracted ion chromatogram of a matrix-matched standard solution at 10μg/kg prepared in cleome for emamectin and avermectin

3 結(jié)論

采用乙腈高速勻漿提取樣品，PSA吸附劑凈化，于加熱電噴霧離子源正離子模式采集、三重四級桿質(zhì)譜儀選擇性反應(yīng)監(jiān)測下，對果蔬中阿維菌素和甲維鹽藥物殘留進(jìn)行測定。對質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，碰撞氣34 475 Pa、氣簾氣103 425 Pa、霧化氣344 750 Pa、輔助加熱氣172 375 Pa、離子噴霧電壓5 500 V、去溶劑溫度300℃時檢測靈敏度最高。在對3種蔬菜和水果樣品中添加阿維菌素和甲維鹽，進(jìn)行2個水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個水平重復(fù)6次，3種樣品的平均回收率范圍達(dá)到81.3%～112.9%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.802%～11.506%。該方法前處理簡便，靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度均高，各種指標(biāo)符合殘留監(jiān)測的相關(guān)要求，可用于果蔬中阿維菌素和甲維鹽的檢測。

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(責(zé)任編輯周曉薇)

Determination of avermectin and emamectin residues in vegetables and fruits by QuEChERS-LC/MS/MS

ZHU Liqing1，CHEN Yong2，LENG Bo1，PAN Yutian1
(1．The Engineering Technological Center of Mushroom Industry，Minnan Normal University，Zhangzhou 363000，China; 2．Zhangzhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Zhangzhou 363000，China)

We developed a method to determine avermectin and emamectin residues in vegetables and fruits by QuEChERS-LC/MS/MS．Samples were extracted by acetonitril with 1%acetate，followed by purifying with dispersive solid phase extraction using PSA．Avermectin and emamectin in samples were determined by LC/MS/MS．The conditions of mass spectrometry was optimized as following:CAD at 34 475 Pa，CUR at103 425 Pa，GS1(nebulizer gas)at344 750 Pa，GS2(heater gas)at172 375 Pa，IS (ion spray voltage)at5 500 V，and TEM at300℃．Avermectin and emamectin in two levels were spiked into 3 vegetables or fruits and determined(6 replicates of each level)．The average recovery ranged from 81.3%to 112.9%，the precisions(RSD)from 1.802%to 11.506%，meeting the requirements of technical standards．This method was proved to be robust，efficientand competent to determine avermectin and emamectin residues in fruits and vegetables．

QuEChERS-LC/MS/MS;avermectin;emamectin;detection of agricultural products

TS255.7

A

1672－3678(2017)04－0028－06

10.3969/j.issn.1672－3678.2017.04.005

2016－10－20

朱麗清(1991—)，女，福建龍巖人，研究方向:化學(xué)生物學(xué);潘裕添(聯(lián)系人)，教授，E-mail:xmpyt@sina．com