張奇茹，丁重陽，周哲敏，顧正華，張梁，石貴陽(.江南大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫2422; 2.江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫2422)

葡萄糖-1-磷酸對靈芝多糖合成的影響

張奇茹1，2，丁重陽1，2，周哲敏1，顧正華1，2，張梁1，2，石貴陽1，2
(1.江南大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122; 2.江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122)

在以葡萄糖為唯一碳源進(jìn)行靈芝液態(tài)發(fā)酵時，通過添加不同濃度的代謝中間產(chǎn)物葡萄糖-1-磷酸，研究其對靈芝胞外多糖產(chǎn)量、單糖組成、合成途徑相關(guān)酶的影響，從而確定影響靈芝多糖單糖組成的關(guān)鍵酶。結(jié)果顯示，添加葡萄糖-1-磷酸對靈芝多糖產(chǎn)量和多糖的單糖組成并無明顯影響。在檢測的3種靈芝多糖合成關(guān)鍵酶中，葡萄糖-1-磷酸的添加抑制磷酸葡萄糖變位酶(PGM)、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶(PGI)的酶活，對磷酸甘露糖異構(gòu)酶(PMI)無明顯影響。此外，通過相關(guān)性分析后發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵過程中半乳糖和甘露糖比例的變化分別與PGM和PGI、PMI具有相關(guān)性。本文結(jié)果對實(shí)現(xiàn)靈芝多糖代謝的靈活調(diào)控提供有益的參考。

靈芝;胞外多糖;液態(tài)發(fā)酵;葡萄糖-1-磷酸

靈芝(Ganoderma lucidum)是一種名貴的食藥用真菌，具有重要的保健功能和對多種疾病的預(yù)防效果，衛(wèi)生部已經(jīng)批準(zhǔn)其為食品新資源，并成為研究和開發(fā)的熱點(diǎn)藥食用真菌之一。靈芝多糖是其主要的活性成分，可以從液體發(fā)酵的發(fā)酵液、菌絲體及子實(shí)體中獲得，具有抗腫瘤、降血壓、增強(qiáng)免疫力和抗氧化等活性［1－4］。

2012年，單核靈芝菌株(G．lucidum strain 260125-1)全基因序列［5］的公開，為靈芝主要活性物質(zhì)如多糖等的合成途徑及其調(diào)控機(jī)制的研究提供基礎(chǔ)。由于固體栽培受到諸多條件的限制，而液體發(fā)酵具有不受季節(jié)影響、培養(yǎng)周期短、成本低、有效活性成分相對更容易提取等優(yōu)點(diǎn)，使得液體發(fā)酵成為獲取真菌多糖的主要手段［6－8］。近十年來，通過液態(tài)發(fā)酵技術(shù)獲得生物活性物質(zhì)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于保健品的開發(fā)與制備［9－10］。目前，國內(nèi)外側(cè)重于多糖的分離提取、結(jié)構(gòu)的鑒定、生物活性和發(fā)酵優(yōu)化等方面的研究［11－15］。利用不同碳源進(jìn)行靈芝液態(tài)發(fā)酵時，靈芝胞外多糖的主要單糖組分為甘露糖、半乳糖和葡萄糖，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，各組分的比例隨之發(fā)生改變，葡萄糖的比例不斷減少。此外，靈芝合成途徑的相關(guān)酶酶活可影響多糖中單糖的比例［16－17］。因此，本文通過添加葡萄糖代謝途徑中的代謝中間產(chǎn)物葡萄糖-1-磷酸(G-1-P)，研究其對靈芝多糖單糖組成的影響，從而考察靈芝多糖合成過程中影響單糖比例的關(guān)鍵酶。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株

靈芝(G.lucidum)，購買于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏于江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20，無氨基酵母(YNB)5，胰蛋白胨5，MgSO4·7H2O 2，KH2PO43; pH 6.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20，無氨基酵母(YNB)5，胰蛋白胨5，MgSO4·7H2O 2;實(shí)驗(yàn)組在種子培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上分別添加0.3、0.6 g/L的G-1-P，對照組不添加;pH 6.0。

培養(yǎng)基滅菌條件:110℃、20 min，其中葡萄糖單獨(dú)滅菌，條件相同。

1.1.3 主要試劑

常用的基本試劑均為市售國產(chǎn)分析純，培養(yǎng)基所用胰蛋白胨(tryptone)為英國Oxoid公司產(chǎn)品，無氨酵母蛋白(YNB)為拜爾迪公司，檢測酶活所用藥品均購自Sigma公司。

1.1.4 主要儀器

氣相色譜儀，日本島津公司;酶標(biāo)儀，美國Bio-Rad公司;冷凍干燥機(jī)，日本日立公司;UV2100型紫外可見光分光光度計，上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 液體發(fā)酵培養(yǎng)

種子培養(yǎng):向裝有80 mL培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中接入4塊0.5 cm×0.5 cm大小的活化菌種，在150 r/min、30℃條件下培養(yǎng)10 d。發(fā)酵培養(yǎng):向裝有150 mL培養(yǎng)液的500 mL三角瓶中接入濕質(zhì)量大約為0.5 g的菌體，在150 r/min、30℃下培養(yǎng)10 d。

1.2.2 胞外多糖的測定

發(fā)酵液離心后取上清，與4倍體積95%乙醇充分混勻，置于4℃冰箱中過夜，10 000 r/min離心10 min，去上清液，加適量的水溶解，苯酚-H2SO4法［18］測定。

1.2.3 還原糖的測定

取發(fā)酵液上清，適當(dāng)稀釋后，用3，5-二硝基水楊酸(DNS)法［19］測定。

1.2.4 胞外粗多糖的提取

將發(fā)酵液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀適當(dāng)濃縮后，加0.45倍體積工業(yè)酒精，充分?jǐn)嚢?0 min，目的是除去蛋白;然后加2.25倍體積工業(yè)酒精，攪拌20 min，靜置于4℃冰箱過夜，目的是醇沉粗多糖;除去酒精，待酒精揮發(fā)完全后加入適量的去離子水溶解，10 000 r/min離心10 min，上清冷凍干燥后即為靈芝胞外粗多糖粉。

1.2.5 單糖組成的測定

水解:稱取40 mg靈芝粗多糖于水解管中，加1 mol/L的H2SO42 mL，置于105℃下水解8 h，用0.8 g BaCO3中和至中性，離心洗滌2次，收集上清液冷凍干燥，即為游離單糖樣品。

衍生化:稱取上述干燥單糖樣品10 mg，加入10 mg的鹽酸羥胺，并加入肌醇內(nèi)標(biāo)1 mg，再加0.5 mL吡啶，于90℃恒溫水浴鍋保持30 min，冷卻后加入乙酸酐0.5 mL，再在水浴鍋保持30 min，冷卻后即可進(jìn)行氣相(GC)分析。

氣相色譜條件:檢測器為氫火焰離子鑒定器(FID);氣化室溫度260℃;檢測器溫度250℃; OV1701毛細(xì)管柱起始溫度120℃，保持3 min后以10℃/min速度升溫至195℃，保留0.1 min，然后以3℃/min速度升溫至240℃，保留10 min。

單糖組分分析:以內(nèi)標(biāo)法計算出各單糖含量，見式(1)。

式中:Ai為單糖樣品峰面積;AIi為樣品中加入肌醇內(nèi)標(biāo)峰面積;AIs為標(biāo)樣中加入肌醇內(nèi)標(biāo)峰面積;As為某單糖標(biāo)樣峰面積;Ws為某單糖標(biāo)樣的質(zhì)量(mg); WIs為標(biāo)樣中加入的肌醇內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量(mg);WIi為樣品中加入的肌醇內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量(mg);W為稱取糖樣品的質(zhì)量(mg)。

1.2.6 多糖代謝途徑相關(guān)酶的測定

粗酶液的提取:液氮充分研磨靈芝菌體后，加入pH 6.5細(xì)胞提取緩沖溶液(20 mmol/L的K3PO4緩沖液，其中含有1 mmol/L二硫蘇糖醇、10 mmol/L MgCl2和50 mmol/L NaCl)充分混勻后低溫離心，上清液用來測定靈芝多糖合成途徑的關(guān)鍵酶酶活。

蛋白濃度的測定:采用考馬斯亮藍(lán)法測定酶液中的蛋白濃度。

酶活的測定:在反應(yīng)溫度為30℃、波長為340 nm的條件下用酶標(biāo)儀檢測。以反應(yīng)體系中每分鐘增加或減少1 nmol的NAD(P)H定義為1個酶活單位(U)。各相關(guān)酶的總反應(yīng)體系均為250μL，以向體系中加入30μL的粗酶液作為反應(yīng)開始。酶活計算見式(2)。

式中:ΔA/Δt為每分鐘吸光值的變化率;V總為反應(yīng)體系總體積(250μL);ε為NAD(P)H的摩爾消光系數(shù)，6.22×103L/(mol·cm);d為吸收光徑(1 cm); V酶為反應(yīng)體系中酶液體積(30μL)。

磷酸葡萄糖變位酶(phosphoglucomutase，PGM)測定體系:50 mmol/L三乙醇胺緩沖液(pH7.2)、5 mmol/L MgCl2、4 U葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、0.4 mmol/L NADP+、1.4 mmol/L葡萄糖-1-磷酸。

磷酸葡萄糖異構(gòu)酶(phosphoglucose isomerase，PGI)測定體系:50 mmol/L磷酸鉀鹽緩沖液(pH6.8)、5 mmol/L MgCl2、4 U葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、0.4 mmol/L NADP+、5 mmol/L果糖-6-磷酸。

磷酸甘露糖異構(gòu)酶(phosphomannose isomerase， PMI)測定體系:50 mmol/L MOPS(pH7.0)、10 mmol/L甘露糖-6-磷酸、1 mmol/L CoCl2、1 mmol/L NADP+、4 U磷酸葡萄糖異構(gòu)酶、4 U葡萄糖-6-磷酸脫氫酶。

2 結(jié)果與討論

靈芝具有多種功能性成分，而多糖是其中最為重要的一種。在不同的調(diào)控條件下，決定多糖性質(zhì)的關(guān)鍵因素是酶，在多糖的合成中，由PGM催化葡萄糖-6-磷酸(glucose 6-phosphate，G-6-P)生成葡萄糖-1-磷酸(glucose 1-phosphate，G-1-P)，在G-1-P的基礎(chǔ)上，經(jīng)過相關(guān)酶的催化，從而形成多糖單糖組成中的半乳糖、葡萄糖等，由此說明G-1-P是多糖合成中的中心代謝產(chǎn)物。因此，本實(shí)驗(yàn)在以葡萄糖為唯一碳源液態(tài)發(fā)酵靈芝的過程中，添加了中心代謝產(chǎn)物G-1-P，以此考察其對靈芝多糖產(chǎn)量、單糖組成及合成途徑關(guān)鍵酶的影響。

2.1 G-1-P對靈芝產(chǎn)多糖的影響

G-1-P對靈芝產(chǎn)多糖的影響如圖1所示。圖1 (a)為葡萄糖與不同濃度的G-1-P混合，此條件下靈芝胞外多糖的產(chǎn)量先增加后減少，多糖產(chǎn)量的下降可能是由于培養(yǎng)基中的營養(yǎng)匱乏導(dǎo)致消耗自身生成的多糖。在發(fā)酵的第6天，對照組胞外多糖產(chǎn)量為0.416 g/L，而添加0.3 g/L和0.6 g/L的G-1-P條件下，靈芝多糖產(chǎn)量分別為0.379 g/L和0.359 g/L。與對照組相比，G-1-P的添加對產(chǎn)量并無明顯影響。在發(fā)酵過程中對碳源的消耗如圖1(b)所示，在不同的培養(yǎng)條件下對碳源的利用并無差異。

2.2 G-1-P對靈芝多糖單糖組成的影響

G-1-P的添加沒有提高胞外多糖的產(chǎn)量，同時對單糖組成中各組分的比例沒有明顯影響。Lee等［20］在不同條件下培養(yǎng)裂蹄木層孔菌(Phellinus linteus)，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基的變化使多糖單糖組成發(fā)生改變。以某一單糖為唯一碳源液態(tài)發(fā)酵靈芝時，該種單糖在靈芝多糖的單糖組成中所占的比例均超過80%［16］，以混合碳源培養(yǎng)靈芝時，培養(yǎng)基中的初始碳源為靈芝多糖的主要組分［17］。本文中，筆者以葡萄糖和不同濃度的G-1-P發(fā)酵靈芝，并研究其對胞外多糖單糖組成影響，結(jié)果如表1所示。由表1可以發(fā)現(xiàn)，多糖中的單糖組成并未發(fā)生明顯變化，其中甘露糖、葡萄糖和半乳糖是其主要單糖組分。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，靈芝胞外多糖中葡萄糖的比例不斷下降，而甘露糖和半乳糖的比例不斷提高，阿拉伯糖和木糖比例較少且在發(fā)酵中變化不大，此結(jié)果與之前的研究一致［16－17］。在之前的研究中發(fā)現(xiàn)，不同的轉(zhuǎn)速和溫度條件下葡萄糖的比例始終在80%以上［21］，這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相符。

圖1 靈芝液體深層發(fā)酵過程中的胞外多糖、還原糖含量Fig.1 Content of exopolysaccharrides and reducing sugar during submerged fermentation of G．lucidum

表1 G-1-P對靈芝胞外多糖單糖組成的影響

Table 1 Effects of G-1-P on the monosaccharide composition of exopolysaccharide during submerged fermentation of G．lucidum

發(fā)酵條件發(fā)酵時間/ d w(單糖)/%阿拉伯糖木糖甘露糖葡萄糖半乳糖對照3 0.14±0.01 0.09±0.02 0.56±0.02 98.45±0.40 0.77±0.16 4 0.12±0.03 0.16±0.04 1.50±0.10 97.27±0.28 0.12±0.09 5 0.11±0.01 0.12±0.01 4.96±0.32 90.41±0.60 4.40±0.30 6 0.04 0.08±0.02 4.34±0.41 91.97±0.36 3.56±0.04 7 0.23 0.52±0.08 8.06±0.30 86.94±0.50 4.25±0.01 0.3 g/L G-1-P 3 0.13±0.03 0.09 0.74±0.09 97.87±0.50 1.17±0.11 4 0.75 0.09 1.42±0.07 95.58±0.09 2.15±0.06 5 0.32±0.10 0.08 4.05±0.10 92.20±0.70 3.35±0.41 6 0.14±0.08 0.07 7.05±0.16 87.10±0.41 5.64±0.21 7 0.31±0.06 0.06 8.69±0.25 84.06±0.38 6.87±0.27 0.6 g/L G-1-P 3 0.29±0.06 0.11 0.63±0.08 98.87±0.29 0.50±0.10 4 0.25±0.01 0.11 2.24±0.11 94.32±0.38 3.43±0.08 5 0.16 0.11 3.22±0.20 94.03±0.40 2.74±0.20 6 0.09 0.09 8.27±0.49 86.10±0.16 5.45±0.60 7 0.22±0.02 0.20 9.61±0.15 84.05±0.91 5.93±0.18

2.3 G-1-P對靈芝多糖合成途徑關(guān)鍵酶比酶活的影響

在不同的調(diào)控條件下決定多糖性質(zhì)的關(guān)鍵因素是酶，發(fā)酵條件的變化可能導(dǎo)致靈芝多糖中單糖比例的變化，而這一變化主要是通過調(diào)節(jié)多糖合成酶的酶活實(shí)現(xiàn)。在之前的研究中發(fā)現(xiàn)，PGM酶活的變化與靈芝多糖中半乳糖比例正相關(guān)，PGI和PMI酶活與單糖組成中甘露糖比例正相關(guān)［17，21］。因此，本文中筆者通過添加不同量的G-1-P檢測發(fā)酵過程中PGM、PGI和PMI酶活的變化，結(jié)果如表2所示。表2結(jié)果表明，在不同的發(fā)酵條件下，PGM、PGI、PMI的比酶活隨著發(fā)酵的進(jìn)行而提高，當(dāng)培養(yǎng)基中加入G-1-P后PGM、PGI的比酶活略低于對照組，對PMI的影響不大，而PGM與多糖的產(chǎn)量間正相關(guān)［22－23］，因此，G-1-P的添加對靈芝胞外多糖的產(chǎn)量無顯著影響。

表2 G-1-P對多糖合成途徑關(guān)鍵酶的影響Table 2 Effects G-1-P on phosphoglucomutase and phosphoglucose isomerase and phosphomannose isomerase activities during submerged fermentation of G.lucidum

圖2 G-1-P對靈芝多糖的單糖比例與相關(guān)酶比酶活的相關(guān)性的影響Fig.2 Relationship between mole percentages of mannose and galactose of EPS and activities of related enzymes under the addition of G-1-P

2.4 G-1-P對靈芝多糖的單糖比例與合成途徑相關(guān)酶的相關(guān)性的影響

Li等［24］在研究微生物產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes)多糖產(chǎn)量與相關(guān)酶的比酶活關(guān)系時，認(rèn)為二者之間的相關(guān)系數(shù)超過0.5時，就說明兩者之間具有相關(guān)性，因此可以通過相關(guān)系數(shù)的分析確定靈芝多糖合成過程中影響多糖中單糖比例變化的酶。在不同的pH、溫度、轉(zhuǎn)速條件下，PGM和PGI的比酶活分別與半乳糖和甘露糖的摩爾比例具有相關(guān)性［21］。在利用混合碳源發(fā)酵靈芝時，葡萄糖和半乳糖混合作為碳源條件下，靈芝多糖的單糖組成中甘露糖的摩爾百分?jǐn)?shù)與PMI、PGI相關(guān)，而葡萄糖和甘露糖作為碳源條件下，半乳糖的摩爾百分?jǐn)?shù)與PGM相關(guān)［17］。在本文中，G-1-P對靈芝多糖的單糖比例與合成途徑相關(guān)酶的相關(guān)性如圖2所示。由圖2可知:以葡萄糖為唯一碳源，添加一定濃度的G-1-P后，單糖組成中甘露糖的摩爾百分?jǐn)?shù)與PMI、PGI比酶活的相關(guān)系數(shù)分別為0.882、0.854，表明PMI、PGI與靈芝多糖中甘露糖的比例相關(guān)，半乳糖的摩爾百分?jǐn)?shù)與PGM的比酶活的相關(guān)系數(shù)為0.650，說明PGM與靈芝多糖中半乳糖比例相關(guān)。從單糖比例與相關(guān)酶相關(guān)性的研究中，得出PGI、PMI、PGM是影響單糖組成和比例的關(guān)鍵酶。

3 結(jié)論

靈芝多糖是靈芝主要活性物質(zhì)之一，發(fā)酵過程中，培養(yǎng)條件細(xì)微的變化都會對靈芝菌體生長和多糖的合成產(chǎn)生影響。在以葡萄糖為唯一碳源液態(tài)發(fā)酵靈芝的過程中，不同濃度G-1-P的添加對靈芝多糖產(chǎn)量和單糖組成并無明顯影響;檢測多糖合成途徑的3種關(guān)鍵酶酶活時發(fā)現(xiàn)，G-1-P的添加抑制PGM、PGI的表達(dá)，對PMI無明顯影響;通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，PGM、PGI、PMI是影響單糖組成的關(guān)鍵酶。此結(jié)果對實(shí)現(xiàn)靈芝多糖代謝的靈活調(diào)控提供了有益的參考。

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(責(zé)任編輯管珺)

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Effects of glucose-1-phosphate on the biosynthesis of Ganoderma lucidum polysaccharide

ZHANG Qiru1，2，DING Zhongyang1，2，ZHOU Zhemin1，GU Zhenghua1，2，ZHANG Liang1，2，SHI Guiyang1，2
(1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology of the Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China;2.National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

Effects of glucose-1-phosphate(G-1-P)on the biosynthesis of Ganoderma lucidum polysaccharide(GLP)were studied with glucose as carbon source and differentconcentrations ofglucose-1-phosphate．Polysaccharide production，monosaccharide composition and GLP synthesis related enzymes were analyzed to determine key enzymes that influenced the monosaccharide composition of GLP．Results showed that the addition of G-1-P had no influence on polysaccharide production and monosaccharide composition of GLP．The addition of G-1-P inhibited the activities of phosphate glucose mutase(PGM) and glucose phosphate isomerase(PGI)，but had no obvious effect on the activity of mannose phosphate isomerase(PMI)．Correlation analysis show that activity of PGM was correlated with the mole percentage of galactose，whereas activities of PGI and PMI were correlated with the mole percentage of mannose.This study provided the reference to the regulation of the metabolism of GLP．

Ganoderma lucidum;exopolysaccharide;submerged fermentation;glucose-1-phosphate

TS219

A

1672－3678(2017)04－0009－06

10.3969/j.issn.1672－3678.2017.04.002

2016－03－31

國家自然科學(xué)基金(31271918);國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)(2012AA021505)

張奇茹(1991—)，女，河南南陽人，研究方向:發(fā)酵工學(xué);丁重陽(聯(lián)系人)，教授，E-mail:zyding@jiangnan．edu．cn;周哲敏(聯(lián)系人)，教授，E-mail:zhmzhou@jiangnan．edu．cn