曾文慧，鐘俊鴻，劉炳榮，李秋劍

木質(zhì)素增量取食對臺灣乳白蟻消化系統(tǒng)的影響

曾文慧，鐘俊鴻，劉炳榮，李秋劍*

(廣東省生物資源應(yīng)用研究所，廣東省動物保護與資源利用重點實驗室，廣東省野生動物保護與利用公共實驗室，廣州 510260)

木質(zhì)素代謝是白蟻消化木質(zhì)纖維素的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。本文利用木質(zhì)素增量喂食臺灣乳白蟻CoptotermesformosanusShiraki，通過測定其取食量、體內(nèi)酚氧化酶含量、纖維素酶活性的變化及后腸微生物群落16s rRNA基因Illumina HiSeq高通量測序比較分析來研究木質(zhì)素取食對低等白蟻消化系統(tǒng)的影響。結(jié)果表明：木質(zhì)素取食組內(nèi)源性(前腸/唾液腺)酚氧化酶含量的顯著大于大于對照組，內(nèi)源及外源性纖維素酶活性均小于對照組，尤其BG酶活性顯著小于對照組；1%木質(zhì)素對乳白蟻取食有一定的抑制作用，其后腸細菌多樣性及豐度較對照組有所下降，但無顯著的組間群落結(jié)構(gòu)差異；Metastat、LDA(LDA Effect Size)及組間T-檢驗屬水平群落差異分析顯示，乳白蟻后腸核心菌群(相對豐度>1%)Dysgonomonas屬、弧菌屬在木質(zhì)素取食組中相對豐度顯著小于對照組，CandidatusAzobacteriodes屬相對豐度則顯著大于對照組，它們在木質(zhì)素增量取食引起的細菌群落變化中起關(guān)鍵作用。

臺灣乳白蟻；酚氧化酶；纖維素酶；腸道微生物群落；16S rRNA基因高通量測序

臺灣乳白蟻CoptotermesformosanusShiraki廣泛分布于我國南方地區(qū)，是一種偏好以木質(zhì)纖維素為主食的低等白蟻。木質(zhì)纖維素是植物細胞壁的核心成分，主要由約50%纖維素、25%半纖維素以及約20%木質(zhì)素構(gòu)成。臺灣乳白蟻通過以下兩個系統(tǒng)來消化木質(zhì)纖維素：1)前腸/唾液腺及中腸組成的內(nèi)源性消化系統(tǒng)；2)后腸鞭毛蟲以及共生細菌群落組成的外源性消化系統(tǒng)(Nakashima, 2002；Brune, 2014；Karl and Scharf, 2015)。其中，降解纖維素酶主要包括以下幾種：內(nèi)切葡聚糖酶endo-β-1,4-glucanase(EC.3.2.1.4，簡稱EG)，纖維二糖水解酶β-1，4-cellobiohydrolase(EC.3.2.1.91，簡稱CBH)以及β-糖苷酶β-glucosidase(EC.3.2.1.21，簡稱BG)(Zhouetal., 2007)。木質(zhì)素在低等白蟻腸道中未檢測到大量的降解，而主要以苯環(huán)支鏈氧化、甲氧基的去甲基化以及木質(zhì)素的空間結(jié)構(gòu)重排等修飾形式來促進纖維素、半纖維素與消化酶的接觸(Lietal., 2012)。涉及木質(zhì)素代謝酶類稱為木質(zhì)素酶/酚氧化酶(phenoloxidase，PO)，是一種含銅的酶的總稱，能夠催化單酚羥化成二酚(如多巴)，并把二酚氧化成醌(劉麗萍等，2013)。值得引起注意的是，白蟻體內(nèi)木質(zhì)素代謝起始于唾液腺，唾液腺中下唇腺所分泌的主要成分為1，4-苯二酚(對苯二酚)的誘食信息素，不僅屬于酚氧化酶即木質(zhì)素酶底物的一種，亦能夠促進白蟻聚集，增加其取食量(Reinhardetal., 1997；Reinhard and Kaib, 2001；Reinhardetal., 2002a)。

到目前為止，只在美洲散白蟻ReticulitermesflavipesKollar 轉(zhuǎn)錄組序列中克隆并表達出了酚氧化酶活性的蟲漆酶基因RflacA以及RflacB(Tartaretal., 2009；Coyetal., 2010；Qiuetal., 2015)。白蟻食物中木質(zhì)素含量對臺灣乳白蟻取食量、消化系統(tǒng)影響還鮮有研究。本實驗通過木質(zhì)素含量的差異取食，一方面，研究由此引起的對酚氧化酶濃度、白蟻取食量、相關(guān)纖維素酶活力的響應(yīng)；另一方面，由于白蟻取食狀態(tài)是其后腸微生物群落結(jié)構(gòu)的重要影響因子(Mikaelyanetal., 2014；Otanietal., 2014；Rahmanetal., 2015)，實驗亦對后腸細菌群落結(jié)構(gòu)進行了16S rRNA高通量測序，以此研究木質(zhì)素取食對后腸細菌群落的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗白蟻

供試白蟻工蟻取自本實驗飼養(yǎng)的五個獨立的臺灣乳白蟻巢。供試工蟻在28℃，相對濕度70%±5%條件下，以蛭石保濕饑餓72 h均一化腸道、減小原始誤差，選擇個體大小相近的3-4齡幼蟲進行試驗。

1.2 主要試劑

本實驗選用主要試劑包括：羧甲基纖維素鈉(CMC-Na，天津福晨化學(xué)試劑)，葡萄糖(Glucose，廣州化學(xué)試劑)，濾紙(雙圈定性濾紙，直徑9 cm)，木質(zhì)素(lignin，Genview)，微晶纖維素(microcellulose，Genview)，電泳瓊脂糖(agarose，Genview)，對硝基苯-8-D-纖維二糖苷(p-NPC，Sigma)，對硝基苯酚(p-NP，Genview)，牛清血蛋白組分V(BSA，Albumin，F(xiàn)raction V，Genview)，3,5-二硝基水楊酸(DNS，Genview)，考馬斯亮藍G-250(Coomassie brilliant blue G-250，Genview)。

1.3 實驗方法

1.3.1 乳白蟻的誘導(dǎo)喂養(yǎng)

(1)取腸道均一化后的五巢白蟻均分別放置于鋪有雙蒸水或1%木質(zhì)素濕潤的雙層濾紙培養(yǎng)皿中，在28℃，相對濕度70%±5%條件下避光培養(yǎng)12 d，每天補充雙蒸水0.5 mL，每皿放入乳白蟻0.40 g，以供取食量分析及以及腸道微生物群落總DNA的提?。?(2) 隨機選取腸道均一化后的3巢白蟻均分別放置于雙蒸水瓊脂糖平板(1%微晶纖維素，1% 瓊脂糖)及木質(zhì)素瓊脂糖平板(1%微晶纖維素，1%瓊脂糖，1%木質(zhì)素)中，在28℃，相對濕度70%±5%條件下避光培養(yǎng)3 d，每皿放入乳白蟻0.25g以供提取粗酶液。

1.3.2 纖維素酶粗酶液制取

取瓊脂糖平板培養(yǎng)乳白蟻，每皿各25頭置于0.9%(W/V)滅菌生理鹽水中漂洗凈，在實體解剖鏡下將白蟻腸道解剖，分成前腸/ 唾液腺，表皮以及后腸三部分，轉(zhuǎn)移至醋酸鈉緩沖液(SAB，0.1 M，pH5.6)中冰浴研磨；使用冷凍離心機(Sigma，3K15)將勻漿液在12000 rpm，4°C下冷凍離心(Sigma，3K15)15 min，離心兩次，取上清即為粗酶液用于昆蟲酚氧化酶酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)；同方法解剖白蟻腸道，分成前腸/唾液腺+中腸與后腸兩部分，制取粗酶液用于白蟻纖維素酶活性測定。每組3巢平行。

1.3.3 蛋白質(zhì)濃度測定

采用考馬斯亮藍法進行測定。將粗酶液按一定的比例進行稀釋，取50 μL稀釋后粗酶液，加入250 μL考馬斯亮藍G-250顯色試劑，多功酶標儀測定OD595，用BSA制作標準曲線求蛋白質(zhì)含量(Zengetal., 2016)。

1.3.4纖維素酶活力及昆蟲酚氧化酶濃度測定

(1)β-1,4-內(nèi)切葡聚糖酶(EG)以及β-糖苷酶(BG)活力的測定，分別以120 μL 1% CMC與120 μL 1%水楊苷(salicine)為底物，酶液12 μL，37℃反應(yīng)60 min，采用DNS顯色法，使用多功能酶標儀(Victor 3 Multi-label Microplate Reader，Perkin Elmer，美國)在540 nm測定光吸收值以葡萄糖為標準物計算產(chǎn)物還原糖含量。EG/BG酶活力U定義為，每毫克蛋白質(zhì)在37℃，pH5.6反應(yīng)條件下分解1% CMC/1%水楊苷，每分鐘可以產(chǎn)生還原糖的量，表示為U/mmol(Zengetal., 2016)。(2)纖維二糖水解酶(CBH)活力測定：以120 μL 1mmolpNPC底物，酶液12 μL，37℃反應(yīng)60 min，加入120 μL Na2CO3(0.6 mol/L)溶液終止反應(yīng)，使用酶標儀測定OD405，從p-NP標準曲線求得p-NP含量，計算酶活力單位。CBH酶活力U定義為：每毫克蛋白質(zhì)在37°C，pH 5.6反應(yīng)條件下分解pNPC，每分鐘可以產(chǎn)生p-NP的量，表示為U/mmol(Zengetal., 2016)；(3)參照昆蟲酚氧化酶(PO)ELISA試劑盒(上海江萊科技)實驗手冊，采用雙抗體一步夾心法，HPP標記檢測抗體，底物TMB顯色，使用酶標儀測定OD450光吸收值，計算樣品酚氧化酶濃度。以雙蒸水組為對照組，計算纖維素酶相對活力(%)以及酚氧化酶相對濃度(%)。每組3巢平行。

1.3.5 取食量測定

將蒸餾水與1%木質(zhì)素組白蟻啃食12 d的濾紙用蒸餾水洗凈，放置烘箱中60°C，18 h過夜干燥，稱量干燥后的濾紙重量。每組5巢平行。

1.3.6 腸道微生物群落16s RNA測序分析

取濾紙喂養(yǎng)12 d的乳白蟻工蟻，每皿20頭置于0.9%(W/V)滅菌生理鹽水中漂洗凈，去除頭胸部，使用TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0試劑盒(天津，中國)提取腹部腸道微生物群落總DNA。將達到測序標準的DNA樣品依托測序公司(諾禾致源，北京)對腸道細菌16s rRNA 基因V4區(qū)域進行PCR擴增、文庫構(gòu)建以、Illumina HiSeq高通量測序及后續(xù)數(shù)據(jù)分析。測序原始數(shù)據(jù)經(jīng)過拆分、拼接、過濾、去嵌合體最終得到有效數(shù)據(jù)。基于有效數(shù)據(jù)對97%一致性的OTUs(Operational Taxonomic Units )進行聚類和物種分類分析，并將OUTs和物種注釋結(jié)合，對OTUs進行豐度、Alpha多樣性指數(shù)等分析，同時對物種注釋在各個分類水平上進行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計分析、樣本間群落結(jié)構(gòu)差異進行比較。以上分析主要通過FLASH V1.2.7、QiimeV1.7.0、R軟件、UCHIME Algorithm、Uparse v7.0.1001、RDP Classifier 、Version 2.2 和MUSCLE Version 3.8.31計算程序以及Gold database、GreenGene數(shù)據(jù)庫完成。每組3巢平行。

1.3.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0(SPSS Inc.Chicago，IL，美國)軟件對酶活力、ELISA、取食量的結(jié)果差異均采用LSD-t檢驗(LSD，α=0.05)。所有誤差線為均值的標準誤差(SEM)。

依托測序公司諾進行了以下組間物種差異統(tǒng)計學(xué)分析：MetaStat、LEfSe(LDA Effect Size)以及t檢驗分析組間微生物群落中顯著差異物種，非參數(shù)檢驗ANOSIM (Analysis of similarities)和MRPP(Multi-response permutation procedure)來分析兩組白蟻微生物整體群落組成的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 木質(zhì)素取食對臺灣乳白蟻濾紙取食量的影響

分別用雙蒸水和木質(zhì)素溶液浸潤的濾紙喂食臺灣乳白蟻12 d后，取食量統(tǒng)計結(jié)果表明，1%木質(zhì)素與雙蒸水對照組乳白蟻對濾紙的取食量分別為0.04±0.003(mg/d·g白蟻)與0.02±0.008(mg/d·g白蟻)，1%木質(zhì)素表現(xiàn)出了對乳白蟻濾紙取食的抑制作用，但無統(tǒng)計學(xué)顯著性(圖1)。

圖1 木質(zhì)素對臺灣乳白蟻濾紙取食量的影響Fig.1 Effect of lignin on filter paper feeding amount of Coptotermes formosanus注：數(shù)值為平均值±標準誤差。Note: Error bars represent standard error of the mean (SEM).

2.2 木質(zhì)素取食對臺灣乳白蟻消化酶的影響

昆蟲酚氧化酶的ELISA實驗結(jié)果表明：1%木質(zhì)素取食組酚氧化酶濃度在前腸/唾液腺為雙蒸水對照組的160.71%±16.71%，顯著大于對照組；其后腸酚氧化酶濃度則顯著小于對照組，為對照組的58.65%±10.81%；表皮酚氧化酶濃度兩組之間未見顯著性差異(圖2)。

纖維素酶活力測定結(jié)果表明：前腸/唾液腺+中腸與后腸的EG、BG及CBH活力均小于對照組。其中，木質(zhì)素取食組BG活性在兩組之間存在顯著差異，其前腸/唾液腺+中腸BG酶活性為對照的62.1%±7.1%，后腸為對照的33.8%±7.0%(圖3)。

2.3 木質(zhì)素取食對臺灣乳白蟻腸道細菌群落的影響

2.3.1 樣品細菌群落豐度及多樣性分析

6個乳白蟻后腸微生物群落樣品經(jīng)測序共獲得475497條16S rRNA基因V4高變區(qū)有效序列，6個樣品測序覆蓋率均達到99%以上，說明被測序深度足夠覆蓋樣品的核心細菌群落。將序列以97%的相似性歸并后得到OUT數(shù)量顯示，對照組細菌種類大于木質(zhì)素取食組。其次，對照組菌群豐度指數(shù)Shannon、Simpson、Chao及ACE均表明雙蒸水對照組菌群豐度和多樣性略高于木質(zhì)素取食組(表1)。

圖2 木質(zhì)素對臺灣乳白蟻酚氧化酶濃度的影響Fig.2 Effect of lignin on phenoloxidase concentration of Coptotermes formosanus注：數(shù)值為平均值±標準誤差，以雙蒸水處理組為對照(100%)。*(P<0.05)，表示木質(zhì)素取食組與對照組之間存在顯著差異(獨立樣品t-檢驗)，下同。Note: Error bars represent standard error of the mean (SEM), the double distilled water treated group was the negative control (100%).Data with the “*” (P<0.05) indicate the significance between two groups (independent samples t- test), the same below.

圖3 木質(zhì)素對臺灣乳白蟻纖維素酶活力的影響Fig.3 Effect of lignin on cellulase activity of Coptotermes formosanus注：EG、BG與CBH分別為內(nèi)切葡聚糖酶，β-糖苷酶以及纖維二糖水解酶縮寫。Note: The endo-β-1, 4-glucanase, β-1, 4-cellobiohydrolase and β-glucosidase are abbreviated to EG, BG and CBH.

表1 樣本細菌群落豐度及多樣性指數(shù)預(yù)測Table 1 The estimated richness and alpha diversity of sampling bacteria community

注：HO為雙蒸水處理組，Lig為1%木質(zhì)素取食組。香濃指數(shù)、辛普森指數(shù)、趙氏菌種豐富度指數(shù)、ACE指數(shù)越大表明群落多樣性越高。Note: Double distilled treated samples are labeled as HO, 1% lignin feeding samples are labeled as Lig.The higher Shannon, Simpson, Chao 1and ACE index are, the higher richness of the sample is.

2.3.2 細菌群落組成整體結(jié)構(gòu)比較

乳白蟻后腸細菌群落結(jié)構(gòu)組間差異Anosim(表2)及MRPP(表3)統(tǒng)計分析均表明，雙蒸水對照組與木質(zhì)素取食組的組內(nèi)擺動性小于組間差異，但組間群落結(jié)構(gòu)均未表現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)顯著差異。

表2 微生物群落結(jié)構(gòu)組間差異Anosim統(tǒng)計學(xué)分析Table 2 Anosim difference analysis of microbial community constructure between groups

注：R-value介于(-1,1)之間，R-value大于0，說明組間差異顯著，R-value小于0，說明組內(nèi)差異大于組間差異，統(tǒng)計分析的可信度用P-value 表示，P小于0.05表示統(tǒng)計具有顯著性。Note:R-value ranges from-1 to 1, with a value greater than 0 indicate significant with-group difference.R-value less than 0 indicate the within-group difference is greater than the with-group difference.P-value less than 0.05 indicate the statistical significant.

2.3.3 組間顯著差異細菌群落統(tǒng)計分析

以屬水平為目標，分析具有組間顯著差異的細菌群落。Metastat分析結(jié)果顯示，以群落相對百分含量大于0.5%為豐度閾值，對照組Dysgonomonas屬及弧菌屬相對豐度顯著大于木質(zhì)素組(表4)；LDA分析(顯著差異閾值LDA值大于4)結(jié)果亦顯示，Dysgonomonas屬在照組中的豐度顯著大于木質(zhì)素取食組，CandidatusAzobacteriodes屬則顯著小于木質(zhì)素取食組(圖4)；組間屬水平T-檢驗分析(P<0.05)結(jié)果顯示，對照組、弧菌屬、耶爾森菌屬及西瓦式菌屬相對豐度顯著大于木質(zhì)素組(圖5)。

表3 微生物群落結(jié)構(gòu)組間差異MRPP統(tǒng)計學(xué)分析Table 3 MRPP difference analysis of microbial community constructure between groups

注：Observe delta值越小說明組內(nèi)差異小，Expect delta值越大說明組間差異大。A值大于0說明組間差異大于組內(nèi)差異，A值小于0說明組內(nèi)差異大于組間差異。P-值小于0.05說明差異顯著。Note: Delta is the weighted mean within-group distance.The A value is the chance-corrected with-group agreement, ranging from 0 to 1, with higher value indicating higher with-group homogeneity.P-values less than 0.05 are deemed statistically significant.

表4 組間屬水平Metastat分析Table 4 Metastat analysis between groups in genus level

注：平均值表示該屬在樣品屬水平的相對豐度，篩選閾值為P<0.05，屬水平豐度大于0.5%。組1為蒸餾水對照組，組2為木質(zhì)素取食組。Note: The mean of group indicates the relative richness of this genus, the screening threshold arePvalue less than 0.05 and relative richness greater than 0.5%.Group 1 is negative control (distilled water), group 2 is lignin feeding group.

圖4 組間屬水平LEfSe分析Fig.4 LDA Effect Size analysis between groups in genus level注：HO、Lig分別表示蒸餾水對照組與木質(zhì)素取食組。顯著差異閾值LDA值大于4。Note: Distilled water control and lignin feeding group are labeled with HO and Lig, respectively.LDA value greater than 4 is the screening threshold.

圖5 組間屬水平T-檢驗分析Fig.5 T- test analysis between groups in genus level注：HO、Lig分別表示蒸餾水對照組與木質(zhì)素取食組。差異顯著閾值，P<0.05。Note: Distilled water control and lignin feeding group are labeled with HO and Lig, respectively.P value less than 0.05 is the screening threshold.

3 結(jié)論與討論

臺灣乳白蟻不僅是我國南方地區(qū)森林及城市中分布最廣泛及破壞力最為強大的白蟻種類，因其對木質(zhì)纖維素的高效降解能力，亦使其成為研究食木白蟻木質(zhì)纖維素降解系統(tǒng)的模式白蟻種類。天然木質(zhì)纖維素的重要組成部分—木質(zhì)素氧化分解相關(guān)的酚氧化酶可能涉及白蟻取食、免疫等多種生理功能(Reinhardetal., 2002a；龐秋香，2008)。

木質(zhì)素是一種分子結(jié)構(gòu)中含有氧代苯丙醇或其衍生物結(jié)構(gòu)單元的芳香性高聚物。低等白蟻木質(zhì)素的降解起始于唾液腺，并在進入后腸之前即完成了一系列苯環(huán)氧化修飾，解聚化等修飾過程(Sharyetal., 2007；Keetal., 2010；Lietal., 2012)。本研究中1%木質(zhì)素取食誘導(dǎo)了臺灣乳白蟻唾液腺/前腸中酚氧化酶濃度顯著高于對照組，后腸酚氧化酶濃度則顯著小于對照組。目前發(fā)現(xiàn)的白蟻酚氧化酶均來源于唾液腺分泌(Reinhardetal., 2002a，2002b)，因此酚氧化酶上游底物木質(zhì)素含量的增加自然促進了唾液腺酚氧化酶的分泌。唾液腺中的誘食信息素(phagostimulating pheromone)對苯二酚亦為酚氧化酶的底物，被認為來源于食物，但所需濃度極低；唾液腺中多余的對苯二酚以熊果苷形式儲存，并被BG酶所誘導(dǎo)釋放(Itakuraetal., 1997；Coyetal., 2010；Dittmer and Kanost, 2010)。本研究中，內(nèi)源性(前腸/唾液腺+中腸)與外源性(后腸)纖維素酶BG與CBH活性均顯著小于對照組。唾液腺中BG酶活力的下降可能導(dǎo)致白蟻自身釋放的對苯二酚量的下降。由于木質(zhì)素的代謝副產(chǎn)物，以及包括對苯二酚在內(nèi)的多種單酚/多酚類物質(zhì)能夠被酚氧化酶催化形成生理毒性苯醌類物質(zhì)(Keetal., 2011)。因此BG酶分泌的減少可能是白蟻自身對苯醌類毒理物質(zhì)的代謝應(yīng)激，同理亦導(dǎo)致了木質(zhì)素取食組的取食量下降。取食是白蟻后腸微生物群落豐度與結(jié)構(gòu)的重要影響因子之一，取食量下降直接會影響后腸微生物的數(shù)量與種類(Otanietal., 2014；Mikaelyanetal., 2015)。腸道細菌群落16s rRNA高通量測序分析結(jié)果顯示，木質(zhì)素取食組后腸細菌群落豐度及多樣性小于蒸餾水對照組，而乳白蟻后腸共生微生物是其木質(zhì)纖維素代謝酶類的主要提供者(Brune and Dietrich, 2015)，這則可能是導(dǎo)致后腸3種纖維素酶活性出現(xiàn)了不同程度下降的原因。

乳白蟻后腸的細菌及古細菌承擔(dān)了聚合物降解、氫代謝、氧氣合成、等糖酵解等代謝功能為共生鞭毛蟲及白蟻提供了生存所需能量，并通過固氮等作用合成大量營養(yǎng)成份及活性物質(zhì)(Brune and Dietrich, 2015)。綜合Metastat、LDA及組間T-檢驗在屬水平的細菌群落差異分析結(jié)果，CandidatusAzobacteriodes屬、Dysgonomonas屬、弧菌屬、耶爾森菌屬及西瓦式菌屬為木質(zhì)素取食組與蒸餾水對照取食組腸道微生物群落差異的標記性菌屬。擬桿菌門(Bacteroides)是乳白蟻后腸絕對優(yōu)勢菌群，通常能占到整個腸道細菌量的75%以上。而CandidatusAzobacteriodes與Dysgonomonas則為擬桿菌門核心菌群(Nodaetal., 2005; Inoueetal., 2015)本研究中，CandidatusAzobacteriodes屬在蒸餾水對照組的相對豐度(55.7%)顯著小于在木質(zhì)素取食組中的相對豐度(66.8%)。CandidatusAzobacteroides屬不僅是臺灣乳白蟻最重要的固氮酶者亦能夠合成大量的氨基酸以及各種營養(yǎng)因子(Hongohetal., 2008；Brune, 2014)，并且在其基因組中發(fā)現(xiàn)了大量糖基水解酶基因(Brune and Dietrich, 2015)。Dysgonomonas屬亦具有固氮及營養(yǎng)因子合成能力(Hussenederetal., 2009；Inoueetal., 2015；Pramonoetal., 2015)，它在蒸餾水對照組中的相對豐度(6.7%)顯著大于在木質(zhì)素取食組中的相對豐度(2.2%)。但是到目前為止，只在后腸共生密螺旋體屬Treponema中發(fā)現(xiàn)了苯環(huán)降解相關(guān)基因(Lucey and Leadbetter, 2014)。本實驗中兩組白蟻后腸密螺旋體屬細菌的豐度并無顯著差異。因此木質(zhì)素在經(jīng)過前腸/唾液腺、中腸的支鏈修飾后，在后腸是如何影響CandidatusAzobacteriodes與Dysgonomonas等核心菌群的豐度還需要進一步的研究?；【鷮倥c耶爾森菌屬均屬于變形菌門Proteobacteria，對pH值非常敏感(Nackeetal., 2011；Makondeetal., 2015)，但木質(zhì)素取食是否會引起腸道內(nèi)pH值的變化還未有研究。

綜上所述，本研究通過乳白蟻木質(zhì)素含量差異取食實驗，結(jié)果表明木質(zhì)素增量取食可以引起內(nèi)源性(前腸/唾液腺)酚氧化酶含量的顯著增加，內(nèi)源及外源性纖維素酶活性的下降，特別是BG酶的大幅度下降；1%木質(zhì)素對乳白蟻取食有一定的抑制作用，同時伴隨后腸細菌群落豐度與多樣性的下降；乳白蟻后腸核心菌群(相對豐度>1%)CandidatusAzobacteriodes、Dysgonomonas以及弧菌屬的相對豐度在木質(zhì)素含量差異取食中出現(xiàn)了顯著差異，它們對白蟻取食中木質(zhì)素含量改變引起的細菌群落變化起關(guān)鍵的作用。

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The effect of incremental lignin feeding on digestive system ofCoptotermesformosanusShiraki

ZENG Wen-Hui, ZHONG Jun-Hong, LIU Bing-Rong, LI Qiu-Jian*

(Guangdong Key Laboratory of Animal Conservation and Resource Utilization, Guangdong Public Laboratory of Wild Animal Conservation and Utilization, Guangdong Institute of Applied Biological Resources, Guangzhou 510260, China)

The lignin metabolism is one of the key steps in lignocelluloses digestion of termites.The effect of incremental lignin feeding on the digestive system of lower termiteCoptotermesformosanusShiraki was investigated by comparative assays of the feeding amount, the phenoloxidase concentration, the cellulase activity and the 16s rRNA gene Illumina HiSeq sequencing of symbiotic bacteria community.The results showed that the concentration of the endogenous (foregut/salivary gland) phenoxidase was significantly higher in lignin feeding group; the activities of both the endogenous and exogenous (hindgut) cellulases were lower in lignin feeding group, especially the β-glucosidase activity was significantly lower in lignin feeding group.The 1% (W/V) lignin had feeding inhibition onC.formosanus, and the estimated richness and diversity of bacteria community was comparatively lower in lignin feeding group, but no significant difference was showed in bacteria community structure between groups.The bacteria community difference between groups was statistically analyzed by Metastat、LDA Effect Size and T-test methods.And the result of dominant bacteria population (relative abundance > 1%) in genus level ofC.formosanushindgut suggested that the relative abundances of genusDysgonomonaandVibrowere significantly higher in lignin feeding group; the relative abundance of genusCandidatusAzobacteriodeswas significantly lower in lignin feeding group.These three bacteria genera played key role in symbiotic bacteria community variation induced by incremental lignin feeding.

CoptotermesformosanusShiraki; phenoloxidase; cellulase; intestinal symbiont; 16S rRNA gene Illumina HiSeq;

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廣東省自然科學(xué)基金(2015A030313817)；廣東省科學(xué)院科技發(fā)展專項(2017GDASCX-0107)

曾文慧，1984年，女，江西人，碩士，助理研究員，研究方向為白蟻生理生化與分子生物學(xué)， E-mail: zengwenhuigz@hotmail.com

*通訊作者Author of correspondence，E-mail: Liqj73@aliyun.com

Received: 2016-12-21；接受日期Accepted: 2017-01-18

Q965;S433

A

1674-0858(2017)03-0632-08