劉 寧，張統(tǒng)書，李忠洲，段立佳，李帥強(qiáng)，董 輝*，叢 斌*

滯育及不同蟲態(tài)下亞洲玉米螟內(nèi)參基因的篩選

劉 寧1，張統(tǒng)書1，李忠洲2，段立佳1，李帥強(qiáng)1，董 輝1*，叢 斌1*

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，沈陽 110161;2.撫順出入境檢驗(yàn)檢疫局，撫順113006)

篩選出滯育狀態(tài)下以及不同蟲態(tài)下亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis(Guenée)的實(shí)時熒光定量PCR(RT-qPCR)最穩(wěn)定內(nèi)參基因，本結(jié)果為研究不同蟲態(tài)及滯育1個月，滯育2個月，滯育3個月和滯育4個月的亞洲玉米螟目的基因表達(dá)水平提供參考依據(jù)。本文以不同蟲態(tài)及滯育狀態(tài)下的亞洲玉米螟為試驗(yàn)材料，應(yīng)用RT-qPCR技術(shù)檢測β-actin，18SrRNA，EF1-α和RPS3共4個候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性水平，結(jié)合geNorm，Normfinder，BestKeeper和RefFinder軟件分析各候選內(nèi)參基因在不同處理下的表達(dá)穩(wěn)定性。結(jié)果表明，在亞洲玉米螟不同蟲態(tài)中，4個候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性大小排序?yàn)?8SrRNA>EF1-α>β-actin>RPS3；滯育1個月，滯育2個月，滯育3個月和滯育4個月的亞洲玉米螟，穩(wěn)定性大小排序?yàn)棣?actin>EF1-α>18SrRNA>RPS3。18SrRNA和β-actin可分別作為不同蟲態(tài)和滯育狀態(tài)下的亞洲玉米螟基因表達(dá)水平分析試驗(yàn)中的內(nèi)參基因。

亞洲玉米螟；內(nèi)參基因；RT-qPCR；18SrRNA；β-actin

實(shí)時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitative reverse transcription-PCR，RT-qPCR)是一種檢測mRNA表達(dá)豐度的可靠技術(shù)，該技術(shù)憑借其高靈敏度，運(yùn)算精度與適用范圍廣等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用(Iktenetal., 2016；Normannetal., 2016)。然而，RNA的產(chǎn)量，完整性及其質(zhì)量，酶的活性和PCR擴(kuò)增效率等方面的差異性變化均可對目的基因特異性表達(dá)的真實(shí)CT值造成影響(崔淼等，2014；Yangetal., 2016)。因此，進(jìn)行RT-qPCR試驗(yàn)時選擇較為穩(wěn)定表達(dá)的管家基因作為內(nèi)參基因?qū)δ康幕虮磉_(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化與校正是至關(guān)重要的(Lordetal., 2010；Silvaetal., 2016)。在很多研究中，參與基本細(xì)胞流過程的傳統(tǒng)管家基因通常作為內(nèi)參基因，例如肌動蛋白(Actin)、微管蛋白(Tubulin)、延伸因子(EF1-a)和3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)等(王佳等，2014；潘暢等，2016)。一個理想的內(nèi)參基因在不同試驗(yàn)條件下，不同組織類型和各發(fā)育階段中均穩(wěn)定表達(dá)(Lietal., 2016; Youetal., 2016)。然而，大量研究結(jié)果表明，這些被廣泛使用的管家基因在不同試驗(yàn)條件下，其表達(dá)量具有顯著差異性(Sunetal., 2016；Wrzesińskaetal., 2016)。故選擇內(nèi)參基因時，需要對其進(jìn)行嚴(yán)格的分析與評估(Wieczoreketal., 2013)。近幾年來，geNorm(Vandesompeleetal., 2002)，BestKeeper(Pfaffletal., 2004)，NormFinder(Andersenetal., 2004)和RefFinder(Xieetal., 2011)軟件廣泛應(yīng)用于內(nèi)參基因的篩選與評估分析中(肖翠等，2012)。geNorm對所有內(nèi)參基因進(jìn)行表達(dá)穩(wěn)定性評估(M值)，其中M<1.5的內(nèi)參基因被認(rèn)為較穩(wěn)定(Ongetal., 2016)。NormFinder與geNorm工作原理相同，根據(jù)穩(wěn)定度篩選出最優(yōu)的一個內(nèi)參基因。BestKeeper在變異分析的基礎(chǔ)之上對內(nèi)參基因進(jìn)行穩(wěn)定性評估，標(biāo)準(zhǔn)誤(SD)或者變異系數(shù)(CV)越小，則認(rèn)為該基因穩(wěn)定性越強(qiáng)。RefFinder是一個在線綜合分析軟件，整合了geNorm，BestKeeper，NormFinder和Delta CT方法，計算出穩(wěn)定性等級的平均值，穩(wěn)定性平均等級指數(shù)越小越穩(wěn)定。近來，國內(nèi)外研究學(xué)者均用上述分析方法對多種昆蟲的內(nèi)參基因穩(wěn)定性進(jìn)行評估與篩選(陳芳等，2014)，例如二斑葉螨Tetranychusurticae(周興隆等，2015)，絲光綠蠅Luciliasericata(Bagnalletal., 2010)，褐飛虱Nilaparvatalugens(Yuanetal., 2014)，棉鈴蟲Helicoverpaarmigera(Zhangetal., 2015)等。

亞洲玉米螟是我國玉米種植上的常發(fā)性害蟲，以老熟幼蟲形態(tài)滯育越冬，在翌年作為蟲源造成嚴(yán)重危害。結(jié)合分子、基因等研究方法，探索亞洲玉米螟發(fā)生發(fā)展機(jī)制具有良好的研究前景，利用RT-qPCR技術(shù)對亞洲玉米螟基因表達(dá)(郭建青，2013；陳鵬等，2014)分析研究已有報道，但對內(nèi)參基因的篩選仍未空白。為確保目的基因表達(dá)水平的準(zhǔn)確性，需引入內(nèi)參基因作為參照。本研究選取了不同蟲態(tài)(卵、幼蟲、蛹和成蟲)及不同滯育狀態(tài)下(滯育1個月，滯育2個月，滯育3個月和滯育4個月)的亞洲玉米螟共8份試驗(yàn)材料，利用RT-qPCR技術(shù)檢測了β-actin，18SrRNA，EF1-α和RPS3共4個內(nèi)參基因在不同蟲態(tài)以及不同滯育狀態(tài)下的亞洲玉米螟中表達(dá)水平，并應(yīng)用geNorm，Normfinder，BestKeeper和RefFinder軟件分析了各候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性，篩選出最適的內(nèi)參基因，在亞洲玉米螟后續(xù)的相關(guān)基因表達(dá)的研究中，為其選擇合適的內(nèi)參基因提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試蟲源

不同滯育狀態(tài)下試蟲：于2016年10月至2017年1月期間滯育1個月，滯育2個月，滯育3個月和滯育4個月的亞洲玉米螟，從沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田剖桿采集，每次試驗(yàn)選擇3頭大小一致的幼蟲，用于分析不同滯育狀態(tài)下候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性(3次生物學(xué)重復(fù))。

不同蟲態(tài)試蟲：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飼養(yǎng)，溫度為26℃±1℃，相對濕度為75%±5%，光周期為16 L∶8 D。分別收集亞洲玉米螟卵(產(chǎn)卵后12 h)、幼蟲(5th)、蛹(化蛹后1 d)及成蟲(羽化后3 d)用于分析不同蟲態(tài)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性(3次生物學(xué)重復(fù))。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 亞洲玉米螟總RNA的提取及檢測

按照Trizol說明書提取各個處理的亞洲玉米螟總RNA。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA完整性，并用Thermo公司的核酸蛋白檢測儀NanoDrop2000檢測總RNA濃度與純度(所有樣本RNA均滿足條件：A260/230>2.0，2.0>A280/260>1.8)。參照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒說明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。

1.2.2 亞洲玉米螟候選內(nèi)參基因表達(dá)引物設(shè)計

根據(jù)Gene bank(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫內(nèi)亞洲玉米螟相關(guān)信息，篩選出4個候選內(nèi)參基因β-actin(KT366041.1)，18SrRNA(GU205787.1)，EF1-α(KC966937.1)，RPS3(EU275206.2)。通過Primer Premier 5.0軟件設(shè)了計實(shí)時熒光定量PCR(Quantitative Real-Time PCR，RT-qPCR)特異性引物，引物均由上海生物工程有限公司合成(表1)。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Primer pairs used for PCR

1.2.3 候選內(nèi)參基因的表達(dá)量檢測

利用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)，采用SYBR GreenⅡ染料法，在Bio-Rad CFX96 PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增、熔解曲線的分析，總反應(yīng)體系20 μL，包括2×SYBR Premix Ex TaqⅡ10 μL，上下游引物各0.8 μL，去除RNA酶ddH2O 7.6 μL，cDNA模板0.8 μL。每個反應(yīng)設(shè)3個復(fù)孔，擴(kuò)增程序采用兩步法：95℃預(yù)變性30 s；然后95℃變性10 s，60℃退火延伸40 s，共40個循環(huán)。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

將cDNA原液依次稀釋5、52、53、54、55、56倍作為模板。按照1.2.4反映體系及程序進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對各引物的擴(kuò)增效率進(jìn)行分析。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用軟件geNorm(Vandesompeleetal., 2002)，BestKeeper(Pfaffletal., 2004)，Normfinder(Andersenetal., 2004)軟件及在線軟件RefFinder評估與分析亞洲玉米螟各候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞洲玉米螟內(nèi)參基因引物特異性驗(yàn)證

以亞洲玉米螟cDNA為模板進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，所得擴(kuò)增產(chǎn)物長度與預(yù)期一致。進(jìn)一步對4個內(nèi)參基因進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)，所有內(nèi)參基因的溶解曲線均為單一峰，表明引物無非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象，故RT-qPCR的結(jié)果真實(shí)可靠。

2.2 亞洲玉米螟內(nèi)參基因的CT值分析

比較不同蟲態(tài)及滯育狀態(tài)下亞洲玉米螟4個內(nèi)參基因的CT值，它們的表達(dá)水平均存在一定的變化(圖1)，該結(jié)果說明，不同蟲態(tài)及不同滯育狀態(tài)可能影響這些候選內(nèi)參基因的表達(dá)量。不同蟲態(tài)的亞洲玉米螟四個候選內(nèi)參基因β-actin、18SrRNA、RPS3和EF1-α的CT值變化范圍分別為22.11-25.95、12.11-16.46、22.44-28.51和30.35-33.39，EF1-α的CT值變異程度最小(ΔCT=3.04；CV=0.030)，RPS3的CT值變異程度最大(ΔCT=6.03；CV=0.081)(圖1 A)；不同滯育狀態(tài)下的亞洲玉米螟中4個候選內(nèi)參基因β-actin、18SrRNA、RPS3和EF1-α的Ct值變化范圍分別為26.03-26.80、15.41-16.33、24.59-28.63和31.18-33.18，β-actin的CT值變異程度最小(ΔCT=0.77；CV=0.011)，RPS3的Ct值變異程度最大(ΔCT=2.00；CV=0.067)(圖1 B)。

圖1 不同蟲態(tài)(A)及滯育狀態(tài)下(B)亞洲玉米螟4個候選內(nèi)參基因CT值的比較 Fig.1 CT values of four candidate reference genes in different stages (A) and different diapause stages,i.e.,collected from October to January (B) of Ostrina furnacalis

2.3 候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性評估

2.3.1 geNorm軟件評估結(jié)果

應(yīng)用genorm軟件評估4個候選內(nèi)參基因β-actin、18SrRNA、RPS3和EF1-α的表達(dá)穩(wěn)定度M值，并由大到小進(jìn)行排序，亞洲玉米螟不同蟲態(tài)為RPS3(1.201)>EF1-α(0.993)>β-actin(0.974)>18SrRNA(0.875)(圖2 A)；不同滯育狀態(tài)的亞洲玉米螟為RPS3(1.572)>18SrRNA(1.244)>β-actin(1.010)>EF1-α(0.966)(圖2 B)，該結(jié)果表明，18SrRNA在不同蟲態(tài)中表達(dá)最穩(wěn)定，EF1-α在不同滯育狀態(tài)下表達(dá)最穩(wěn)定。

圖2 應(yīng)用geNorm軟件分析不同蟲態(tài)(A)及不同滯育狀態(tài)亞洲玉米螟(B)各內(nèi)參的表達(dá)穩(wěn)定度值(M)Fig.2 Expression stability values (M) of reference genes in different stages (A) and different diapause stages,i.e.,collected from October to January (B) of Ostrina furnacalis analyzed by geNorm

2.3.2 Normfinder軟件評估結(jié)果

應(yīng)用Normfinder軟件評估4個候選內(nèi)參基因β-actin、18SrRNA、RPS3和EF1-α的表達(dá)穩(wěn)定度，候選內(nèi)參基因在亞洲不同蟲態(tài)玉米螟中的穩(wěn)定度排序?yàn)椋?8SrRNA(0.348)>β-actin(0.423)>EF1-α(0.489)>RPS3(0.569)；不同滯育狀態(tài)的亞洲玉米螟為：EF1-α(0.177)>β-actin(0.379)>18SrRNA(0.581)>RPS3(0.782)。在不同蟲態(tài)中，18SrRNA表達(dá)最穩(wěn)定，在不同月份下，EF1-a為最優(yōu)內(nèi)參基因，與geNorm軟件分析結(jié)果一致(表2)。

2.3.3 BestKeeper軟件評估結(jié)果

應(yīng)用BestKeeper軟件評估4個候選內(nèi)參基因結(jié)果顯示SD值(表3)，亞洲玉米螟不同蟲態(tài)，EF1-α<β-actin<18SrRNA

2.3.4 綜合評估結(jié)果

綜合上述3種軟件及在線軟件RefFinder的評估結(jié)果表明，不同蟲態(tài)中選擇18SrRNA為最優(yōu)內(nèi)參基因(表4)，不同月份滯育下選擇β-actin為最優(yōu)內(nèi)參基因(表5)。

表2 應(yīng)用NormFinder軟件分析亞洲玉米螟內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性Table 2 Expression stability of reference genes of Ostrinia furnacalis by NormFinder

3 結(jié)論與討論

亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis(Guenée)做為玉米上的主要害蟲，多年來一直有大量報道，RT-qPCR技術(shù)在亞洲玉米螟目的基因表達(dá)分析研究中得到了廣泛應(yīng)用(郭建青，2013；陳鵬等，2014)。為了明確亞洲玉米螟目的基因的表達(dá)水平，必須引入內(nèi)參基因?qū)δ康幕蜻M(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，由于，目的基因表達(dá)量會受內(nèi)外界的多種因素影響，如RNA完整性及反轉(zhuǎn)錄效率等(Pfaffletal., 2004；Wrzesińskaetal., 2016)。也有研究表明，在柑橘大實(shí)蠅中，RPL32在不同發(fā)育階段和不同溫度處理中表達(dá)最穩(wěn)定，在不同溫度下和一個γ輻射處理下理想表達(dá)的基因是GAPDH，G6PDH和RPL32(Lüetal., 2014)；β-actin在感染細(xì)菌的蜜蜂中表達(dá)穩(wěn)定，而在感染真菌的赤擬谷盜中不穩(wěn)定表達(dá)(Lordetal., 2010)；β-actin和18SrRNA在蝗蟲發(fā)育階段中穩(wěn)定表達(dá)，然而，在抵低壓缺氧條件下表達(dá)水平發(fā)生改變(Zhaoetal., 2012)。周曉慧(2014)研究表明，在碦西茄干旱和鹽脅迫條件下EF1-α和GAPDH表達(dá)穩(wěn)定性最好，TUA和18SrRNA在碦西茄不同組織中表達(dá)最穩(wěn)定。因此篩選出在特定試驗(yàn)條件下表達(dá)穩(wěn)定性好的內(nèi)參基因是非常關(guān)鍵的。

表3 應(yīng)用BestKeeper軟件分析亞洲玉米螟內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性Table 3 Expression stability of reference genes of Ostrinia furnacalis by BsetKeeper

表4 4個候選內(nèi)參基因不同蟲態(tài)的穩(wěn)定性等級排序Table 4 Overall stability rank of four candidate reference genes of different stages

表5 4個內(nèi)參基因不同滯育狀態(tài)的表達(dá)穩(wěn)定性Table 5 Overall stability rank of four candidate reference genes of different diapause stages

在本試驗(yàn)中，選擇了4個亞洲玉米螟候選內(nèi)參基因。根據(jù)geNorm、NormFinder、BestKeeper及RefFinder軟件綜合評估了4個候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。在不同蟲態(tài)的亞洲玉米螟試驗(yàn)中，4個候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性等級綜合排名為，18SrRNA(rank=1.32)>EF1-α(rank=1.73)>β-actin(rank=2.21)>RPS3(rank=4.00)，18SrRNA是表達(dá)穩(wěn)定性最好的基因，其次是EF1-α，RPS3被認(rèn)為穩(wěn)定性最差。然而，geNorm和Normfinder軟件分析均顯示18SrRNA是表達(dá)穩(wěn)定性最好的基因，M值最小，BestKeeper分析表明EF1-α的SD=0.83<1，其它3個候選內(nèi)參基因的SD值均大于1，EF1-α穩(wěn)定性最好。在不同滯育狀態(tài)下的亞洲玉米螟試驗(yàn)中，4個候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性等級綜合排名為β-actin(rank=1.41)>EF1-α(rank=1.73)>18SrRNA(rank=2.06)>RPS3(rank=4.00)，β-actin表達(dá)穩(wěn)定性最好，18SrRNA和EF1-α穩(wěn)定性次之，RPS3最不穩(wěn)定。然而，geNorm和Normfinder軟件分析均顯示EF1-α表達(dá)最穩(wěn)定，M值最小，BestKeeper軟件分析僅RPS3的SD值大于1，其余3個候選內(nèi)參基因SD值均小于1，但β-actin的SD值最小，表達(dá)最穩(wěn)定。geNorm與NormFinder程序算法需要將數(shù)據(jù)CT值轉(zhuǎn)化為Q=2ΔCT值方法，然而BestKeeper軟件直接輸入CT值進(jìn)行計算分析。3種軟件分析結(jié)果之間的差異可能是由于應(yīng)用不同數(shù)據(jù)分析導(dǎo)致。因此，本文研究結(jié)果需要通過RefFinder軟件進(jìn)行綜合評估，從而得到綜合排名指數(shù)，排名指數(shù)越小，說明該基因越穩(wěn)定。

本文研究結(jié)果表明，亞洲玉米螟不同蟲態(tài)中，18SrRNA表達(dá)穩(wěn)定性最好，RPS3穩(wěn)定性最差；在不同滯育狀態(tài)下，β-actin表達(dá)穩(wěn)定性最好，RPS3穩(wěn)定性最差。這些結(jié)果依據(jù)上述3種不同軟件及在線軟件RefFinder綜合分析得到。因此，在亞洲玉米螟不同蟲態(tài)試驗(yàn)中選擇18SrRNA作內(nèi)參基因；在不同滯育狀態(tài)下，可選擇β-actin作最適內(nèi)參基因。本研究結(jié)果可為亞洲玉米螟生長發(fā)育及滯育等過程的分子機(jī)理研究提供參考依據(jù)。

References)

Andersen CL, Jensen JL, ?rntoft TF.Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data: A model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization, applied to bladder and colon cancer data sets [J].CancerResearch, 2004, 64 (15): 5245-5250.

Bagnall NH, Kotze AC.Evaluation of reference genes for real-time PCR quantification of gene expression in theAustraliansheepblowfly, Lucilia cuprina [J].MedicalandVeterinaryEntomology, 2010, 24 (2): 176-181.

Chen F, Lu YY.Selection of reference genes inPhenacoccussolenopsis(Hemiptera:Pseudococcidae) under heat stress [J].ActaEntomologicaSinica, 2014, 57 (10): 1146-1154.[陳芳, 陸永躍.熱脅迫下棉花粉蚧內(nèi)參基因的篩選[J].昆蟲學(xué)報, 2014, 57 (10): 1146-1154]

Chen P, Qu MB, Yang J.Cloning and expression of two laccase genesOfLac1 andOfLac2 from the insectOstriniafurnacalis[J].ScientiaAgriculturaSinica, 2014, 47 (7): 1341-1350.[陳鵬, 屈明博, 楊君.亞洲玉米螟兩種漆酶基因OfLac1和OfLac2 cDNA的克隆及基因表達(dá)[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014, 47 (7): 1341-1350]

Cui M, Liu XJ, Li T,etal.Selection of reference genes on different days during the development of the fifth-instar nymph ofLocustamigratoriawith quantitative real-time PCR [J].ChineseJournalofAppliedEntomology, 2014, 51 (3): 733-740.[崔淼, 劉曉健, 李濤, 等.五齡飛蝗不同發(fā)育時間實(shí)時熒光定量PCR內(nèi)參基因的篩選[J].應(yīng)用昆蟲學(xué)報, 2014, 51 (3): 733-740]

Guo JQ.Cloning and Expression Analysis of Glycogen Phosphorylase Gene inOstriniafurnacalis(Guenée) (Lepidoptera: Crambidae) [D].Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences Master Dissertation, 2013.[郭建青.亞洲玉米螟糖原磷酸化酶基因的克隆及表達(dá)分析[D].北京: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2013]Ikten C, Ustun R, Catal M,etal.Multiplex real-time qPCR assay for simultaneous and sensitive detection of phytoplasmas in sesame plants and insect vectors [J].PLoSONE, 2016, 11 (5): e0155891.

Li J, Jia H, Han X,etal.Selection of reliable reference genes for gene expression analysis under abiotic stresses in the Desert Biomass Willow,Salixpsammophila[J].FrontiersinPlantScience, 2016, 7 (131): 1505.

Lord JC, Hartzer K, Toutges M,etal.Evaluation of quantitative PCR reference genes for gene expression studies inTriboliumcastaneumafter fungal challenge [J].JournalofMicrobiologicalMethods, 2010, 80 (2): 219-221.

Lü ZC, Wang LH, Dai RL,etal.Evaluation of endogenous reference genes ofBactrocera(Tetradacus)minaxby gene expression profiling under various experimental conditions [J].FloridaEntomologicalSociety, 2014, 97 (2): 597-604.

Normann KR, Berland ?ystese KA, Berg JP,etal.Selection and validation of reliable reference genes for RT-qPCR analysis in a large cohort of pituitary adenomas [J].MolecularandCelluarEndocrinonogy, 2016, 437 (C): 183-189.

Ong OTW,Young LJ,Old JM.Valuation of reference genes for gene expression in red-tailed Phascogale (Phascogalecalura) liver, lung, small intestine and spleen [J].PeerJ., 2016, 4: e2552.

Pan C, Zhang YH, Pang H,etal.Selection of the reference genes for gene expression studies inCryptolaemusmontrouzieriMulsant by qRT-PCR [J].JouranlofEnviromentalEntomology, 2016, 38 (2): 261-270.[潘暢, 張宇宏, 龐虹.孟氏隱唇瓢蟲qRT-PCR分析中內(nèi)參基因的篩選[J].環(huán)境昆蟲學(xué)報, 2016, 38 (2): 261-270]

Pfaffl MW, Tichopad A, Prgomet C,etal.Determination of stable housekeeping genes,differentially regulated target genes and sample integrity: Bestkeeper-excel-based tool using pair-wise correlations [J].Biotechnol.Lett., 2004, 26 (6): 509-515.

Silva PRAD, Vidal MS, Soares CDP,etal.Selection and evaluation of reference genes for RT-qPCR expression studies onBurkholderiatropicastrain Ppe8, a sugarcane-associated diazotrophic bacterium grown with different carbon sources or sugarcane juice [J].AntonievanLeeuwenhoek, 2016, 109 (11): 1493-1502.

Sun HP, Li F, Ruan QM,etal.Identification and validation of reference genes for quantitative real-time PCR studies inHederahelixL [J].PlantPhysiologyandBiochemistry, 2016, 108: 286-294.

Vandesompele J, De Preter K, Pattyn F,etal.Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes [J].GenomeBiology, 2002, 3 (7): 1-12.

Wang J, Zhao J,Liu YH.Evaluation of endogenous reference genes inBactroceraminax(Diptera:Tephritidae) [J].ActaEntomologicaSinica, 2014, 57 (12): 1375-1380.[王佳, 趙靜, 劉映紅.柑橘大實(shí)蠅內(nèi)參基因的評估[J].昆蟲學(xué)報, 2014, 57 (12): 1375-1380]

Wieczorek P, Wrzesińska B,Obr?palska-St?plowska A.Assessment of reference gene stability influenced by extremely divergent disease symptoms inSolanumycopersicumL [J] .JournalofVirologicalMethods, 2013, 194 (1-2): 161-168.

Wrzesińska B,Kierzek R,Obr?palska-St?plowska A.Evaluation of six commonly used reference genes for gene expression studies in herbicide-resistantAvenafatuabiotypes [J].WeedResearch, 2016, 56 (4): 284-292.

Xiao C, Yan JW, Long GY,etal.Stability evaluation of reference genes in citrus [J].JournalofFruitScience, 2012, 29 (6): 978-984.[肖翠, 嚴(yán)佳文, 龍桂友, 等.柑橘內(nèi)參基因的穩(wěn)定性評價[J] .果樹學(xué)報, 2012, 29 (6): 978-984]

Xie F, Sun G, Stiller JW,etal.Genome-wide functional analysis of the cotton transcriptome by creating an integrated EST database [J].PLoSONE, 2011, 6 (11): e26980.

Yang CX, Preisser E, Zhang HJ,etal.Selection of reference genes for RT-qPCR analysis inCoccinellaseptempunctatato assess un-intended effects of RNAi transgenic plants [J] .FrontiersinPlantScience, 2016, 7: e53006.

You YH, Zhang L, Li PM,etal.Selection of reliable reference genes for quantitative real-time PCR analysis in plum (PrunussalicinaLindl) under different postharvest treatments [J].ScientiaHorticulturae, 2016, 210: 285-293.

Yuan M, Lu YH, Zhu X,etal.Selection and evaluation of potential reference genes for gene expression analysis in the brown planthopper,Nilaparvatalugens(Hemiptera:Delphacidae) using reverse-transcription quantitative PCR [J].PLoSONE, 2014, 9 (1): e86503.

Zhang SD, An SH, Li Z,etal.Identification and validation of reference genes for normalization of gene expression analysis using qRT-PCR inHelicoverpaarmigera(Lepidoptera:Nocidae) [J].Gene, 2015, 555 (2): 393-402.

Zhao DJ, Guo K, Kang L.Identification of condition-specific reference genes from microarray data for locusts exposed to hypobaric hypoxia [J].FederationofEuropeanBiochemicalSocieties, 2012, 8 (1): 235-240.

Zhou XH, Liu J, Zhuang Y.Selection of appropriate reference genes inSolanumaculeatissimumfor quantitative gene expression studies under different experimental conditions [J].ActaHorticulturaeSinica, 2014, 41 (8): 1731-1738.[周曉慧, 劉軍, 莊勇.喀西茄內(nèi)參基因?qū)崟r熒光定量PCR表達(dá)穩(wěn)定性評價[J].園藝學(xué)報, 2014, 41 (8): 1731-1738]

Zhou XL, Yang SY, Hao Y,etal.Selection of the most suitable reference genes and expression profiling ofCYP392Asubfamily genes in the multi-pesticide resisitant strain ofTetranychusurticae(Acari: Tetranychidae) [J].ActaEntomologicaSinica, 2015, 58 (11): 1229-1236.[周興隆, 楊順義, 郝雨,等.二斑葉螨多重抗性品系最優(yōu)內(nèi)參基因的篩選及CYP392A亞家族基因的表達(dá)分析[J].昆蟲學(xué)報, 2015, 58 (11): 1229-1236]

Selection of the reference genes inOstriniafurnacalis(Guenée) under diapause and different insect states

LIU Ning1, ZHANG Tong-Shu1, LI Zhong-Zhou2,DUAN Li-Jia1, LI Shuai-Qiang1, DONG Hui1*, CONG Bin1*

(College of Plant Protection, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161, China；2.Entering/Leaving Country Examination Quarantine Bareau of Funshun City,Fushun 113006,Liaoning Province, China)

Selecting the suitable reference genes inOstriniafurnacalis(Guenée) under different diapause stages and different stages, this result provides an accurate reference for future study of the different diapause stages, i.e., collected from October to January, and different stages ofOstriniafurnacalis(Guenée) in the experiment of the level of gene expression.In the study, by the method of RT-qPCR,Ostriniafurnacalis(Guenée) as experimental material, the mRNA levels of four candidate reference genes such asβ-actin, 18SrRNA,EF1-aandRPS3 were assessed; Three software-based approaches (geNorm, Normfinder and BestKeeper) and one web-based comprehensive tool (RefFinder) were used to analyze the expression stability of these genes under different treatments.According to the comprehensive rank of RefFinder, the expression stability of above four candidate reference genes were 18SrRNA>EF1-a>β-actin>RPS3 from different stages ofOstriniafurnacalis(Guenée); the expression stability of above four candidate reference genes wereβ-actin>EF1-a>18SrRNA>RPS3 from different diapause stages, i.e., collected from October to January ofOstriniafurnacalis(Guenée).18SrRNAandβ-actincan be respectively uesd as a reference gene for different stages and different diapause stages ofOstriniafurnacalis(Guenée) in the experiment of the level of gene expression.

Ostriniafurnacalis; reference genes; RT-qPCR; 18SrRNA;β-actin

劉寧，張統(tǒng)書，李忠洲,等.滯育及不同蟲態(tài)下亞洲玉米螟內(nèi)參基因的篩選[J].環(huán)境昆蟲學(xué)報，2017,39(3):611-617.

農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201303026)；國家重點(diǎn)研發(fā)計劃(2016YFD0300704)

劉寧，女，1991年生，遼寧人，碩士研究生，研究方向?yàn)楹οx生物防治與昆蟲分子生態(tài)學(xué)，E-mail：13940434836@139.com

*通訊作者Author for correspondence，E-mail: biocontrol@163.com; bin1956@163.com

Received: 2017-01-22；接受日期Accepted: 2017-03-19

Q963;S433.4

A

1674-0858(2017)03-0611-07