胡 亞，羅 嫚，王 宇,3，王 濤，尚小麗，張迎春，修江帆,4*，吳建偉,4

家蠅GNBP3基因克隆及感染白色念珠菌后的表達(dá)

胡 亞1,2，羅 嫚1，王 宇1,3，王 濤1，尚小麗1，張迎春1，修江帆1,4*，吳建偉1,4

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴陽 550004；2.畢節(jié)市第一人民醫(yī)院，貴州畢節(jié)551700；3.貴州省疾病預(yù)防控制中心，貴陽 550004；4.貴州博康生物工程有限公司，貴陽 550004)

對家蠅GNBP3基因進(jìn)行克隆及生物信息學(xué)分析，并對該基因在感染白色念珠菌Candidaalbicans后的表達(dá)情況進(jìn)行研究。從構(gòu)建的家蠅Muscadomestica幼蟲cDNA質(zhì)粒文庫中篩選到GNBP3基因，克隆并運(yùn)用生物信息學(xué)方法對該基因及其編碼蛋白進(jìn)行預(yù)測和分析。白色念珠菌注射感染家蠅幼蟲并收集標(biāo)本，逆轉(zhuǎn)錄，通過熒光定量PCR檢測感染樣本中GNBP3基因的表達(dá)情況，結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。研究結(jié)果表明，GNBP3基因ORF全長1473 bp，編碼490個(gè)氨基酸，理論分子量為55.8 kDa，等電點(diǎn)為6.85；感染后不同時(shí)間點(diǎn)，感染組與對照組比較，在3 h、12 h、36 h、48 h GNBP3 mRNA的表達(dá)明顯增高，兩組比較有顯著性差異(P<0.05)，而24 h表達(dá)差異性最?。桓腥竞蟛煌M織中感染組與對照組比較，3 h和12 h時(shí)，在體壁、血淋巴、脂肪體中的表達(dá)量升高，具有顯著性差異(P<0.05)；24 h時(shí)，在血淋巴中的表達(dá)量較對照組高，而在唾液腺和脂肪體中的表達(dá)量呈下降趨勢，均具有顯著性差異(P<0.05)；48 h，在血淋巴和脂肪體中表達(dá)量較對照組高，在中腸的表達(dá)量較對照組低，均具有顯著性差異(P<0.01)。成功克隆GNBP3基因且在家蠅感染白色念珠菌后GNBP3的表達(dá)水平隨時(shí)間的推移呈現(xiàn)先升高后降低再升高的趨勢，在各組織中以在免疫組織(血淋巴、脂肪體)中的表達(dá)顯著增高，推測其在真菌識別過程中發(fā)揮潛在作用。

GNBP3；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；感染；mRNA水平；家蠅

昆蟲的先天性免疫包括細(xì)胞和體液免疫兩類，細(xì)胞和體液初始免疫反應(yīng)的第一步是識別病原物，這需要模式識別受體(PRR)對病原微生物的病原相關(guān)分子模式(PAMPs)進(jìn)行識別，分別依靠血細(xì)胞和脂肪體產(chǎn)生以及分泌抗菌因子發(fā)揮免疫效應(yīng)(Kounatidis and Ligoxygakis, 2012; Kuratas, 2014)。真菌是昆蟲病原微生物最大的一類，約有60%的昆蟲疾病是由病原真菌所致(宋肖玲和李國霞，2002；候成香等，2012)。真菌細(xì)胞壁是昆蟲識別真菌的靶位置，在昆蟲中革蘭氏陰性菌識別蛋白-3(GNBP3)能夠識別真菌細(xì)胞壁成分，β-1，3葡聚糖是真菌細(xì)胞壁的關(guān)鍵成分，也是GNBP3的識別成分，GNBP3識別真菌細(xì)胞壁中的β-1，3葡聚糖，完成免疫系統(tǒng)對侵入真菌的識別(Elchamyetal., 2008; Hoffmannetal, 2008; Buchonetal., 2009; Mishimaetal, 2009; Lindsay and Wasserman, 2014)，也是真菌在侵染宿主的每一個(gè)階段都會受到宿主免疫抵抗的原因。如在果蠅(Matskevichetal., 2010; Fullaondoetal., 2011)、黃粉蟲(Leeetal., 2009)中，GNBP3結(jié)合β-1,3葡聚糖參與抗真菌防御，提示其在對病原體識別過程中發(fā)揮重要作用。

家蠅Muscadomestica是世界性廣泛分布的昆蟲，隸屬于昆蟲綱雙翅目Diptera環(huán)裂亞目Cyclorrhapha蠅科Muscidae蠅屬，其體表可攜帶多種病原體而自身并不受害，這一特性歸功于其具有強(qiáng)大的先天性免疫系統(tǒng)(修江帆等，2014；彭傳林等，2015；王宇等，2015)。家蠅基因組和轉(zhuǎn)錄組(Jeffreyetal., 2014)研究表明GNBP3是信號通路上游模式識別受體參與昆蟲先天性免疫應(yīng)答反應(yīng)及其對真菌的識別，從而宿主對真菌產(chǎn)生免疫抵抗，而有關(guān)GNBP3在家蠅感染后的表達(dá)狀況國內(nèi)外研究報(bào)道較少(修江帆等，2014)，對GNBP3在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮何作用已成為迫切解決的問題?；虮磉_(dá)的定量檢測已經(jīng)是分子生物學(xué)研究課題中的重要手段，當(dāng)研究大多數(shù)基因時(shí)，不同的檢測方法所得到的結(jié)果差異較大，通過實(shí)時(shí)熒光定量檢測細(xì)胞中mRNA的濃度，則可以更精確地反映基因表達(dá)的狀況(彭海英等，2015；易健明等，2015)。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real time Q-PCR)檢測家蠅感染白色念珠菌Candidaalbicans后GNBP3的表達(dá)狀況，為進(jìn)一步探討家蠅先天性免疫系統(tǒng)對真菌的識別機(jī)制提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物材料與菌種

家蠅由貴州醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)教研室常規(guī)飼養(yǎng)；白色念珠菌由貴州醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)教研室保存。宿主菌感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；載體pMD 18-T購自TakaRa公司。

1.1.2 主要試劑和儀器

限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、rTaq酶、MiniBEST小量質(zhì)粒抽提純化試劑盒，DNA Maker DL 2000，總RNA提取試劑TRIzol Reagent、PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTM II(Perfect Real Time)試劑盒、氯仿、異丙醇、DEPC水均購自TakaRa公司；去RNA酶EP管、PCR耗材(美國sigma公司)；所用引物由上海生工生物工程公司合成。PCR擴(kuò)增儀(德國Eppendorf公司)，冷凍高速離心機(jī)(美國德國Eppendorf公司)，核酸定量分析儀(GeneQuant公司)、顯微超微量注射儀(美國)，ABI PRISM 7300 Fast real time PCR System(美國)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本制備

以白色念珠菌作為感染源，通過顯微超微量注射儀注射家蠅幼蟲(2齡后期)，注射濃度為1×1010CFU/mL，注射體積為210 nL，設(shè)置為感染組，并注射等體積PBS緩沖液設(shè)為對照組，感染后3 h、6 h、12 h、24 h、36 h、48 h標(biāo)本及感染后3 h、12 h、24 h、48 h等時(shí)間點(diǎn)的家蠅幼蟲不同組織(體壁、馬氏管、脂肪體、中腸、唾液腺、血淋巴、氣管)標(biāo)本進(jìn)行收集。

1.2.2 總RNA的提取及cDNA合成

對所收集標(biāo)本，按照TakaRa公司TRIzol說明書提取總RNA，總RNA經(jīng)電泳檢測，GeneQuant公司核酸定量分析儀測定A260/280比值(1.8≤A260/A280≤2.1)及濃度，以1 μg總RNA為模板，按照cDNA合成試劑盒說明書分別合成cDNA第一鏈，放于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI公布的家蠅基因組GNBP3基因預(yù)測序列和內(nèi)參基因GAPDH的基因序列，運(yùn)用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)基因克隆引物(K-F、K-R)、GNBP3基因及內(nèi)參GAPDH基因的實(shí)時(shí)熒光引物。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其序列如下：

GNBP3 K-F:5′—CGCGGATCCCCACCAAGCT ATGAAGT—3′

GNBP3 K-R:5′—CCGCTCGAGTTAAACAGAA AATAC—3′

GNBP3 F: 5′—CAGACGAGAAATGATGGAGGA C—3′

GNBP3 R:5′—TATTGCGATAAGTTGTGTGC—3′

GAPDH F:5′—CAGGAGGCATTGCTGATGAT—3′

GAPDH R:5′—GAAGGCTGGGGCTCATTT—3′

1.2.4 pMD18-T/GNBP3克隆載體的構(gòu)建

從家蠅幼蟲cDNA質(zhì)粒文庫中篩選到GNBP3基因，以上述家蠅3齡幼蟲cDNA為模板，應(yīng)用基因克隆引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：94℃，5 min預(yù)變性；94℃ 30 s ，57℃ 30 s，72℃ 1 min ，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。取PCR產(chǎn)物檢測：2%的瓊脂糖凝膠電泳。用DNA凝膠回收試劑盒，純化PCR產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，涂布于Amp+抗性的LB固體培養(yǎng)基平板培養(yǎng)，次日挑單克隆進(jìn)行PCR鑒定，擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，送生物公司測序。

1.2.5 生物信息學(xué)分析

利用瑞士生物信息學(xué)研究所的蛋白分析專家系統(tǒng)(Expert Protein Analysis System, ExPASy, http://ca.expasy.org/)提供的生物信息學(xué)工具分析家蠅GNBP3基因的特點(diǎn)；運(yùn)用NCBI Blast對基因序列進(jìn)行同源比對，用ProtParam分析蛋白等電點(diǎn)、分子質(zhì)量；ProtScale分析蛋白質(zhì)的疏水性；SignaIP 4.1分析信號肽位點(diǎn)；免疫表位數(shù)據(jù)庫分析資源IEDB Analysis Recource網(wǎng)站(http://tools.immuneepitope.org/tools/bcell/iedb_input)分析抗原表位。

1.2.6 熒光定量PCR

取上述家蠅幼蟲(2齡后期)感染后不同時(shí)間點(diǎn)(3 h、6 h、12 h、24 h、36 h、48 h)及感染后3 h、12 h、24 h、48 h等時(shí)間點(diǎn)的家蠅幼蟲不同組織(體壁、馬氏管、脂肪體、中腸、唾液腺、血淋巴、氣管)(PBS對照組及白色念珠菌感染組)cDNA(1∶10稀釋)為模板，GAPDH為內(nèi)參基因，按照Takara SYBR Premix Ex TaqTM II(Perfect Real Time)試劑盒說明，使用ABI PRISM 7300(ABI，USA)進(jìn)行real-time PCR，每個(gè)樣品重復(fù)3次，每組3個(gè)重復(fù)。反應(yīng)體系為：2×SYBR premix EX Taq II 10 μL、上游引物(10 μmol/L)0.8 μL、下游引物(10 μmol/L)0.8 μL、ROX Reference Dye(50×)0.4 μL、cDNA 1.0 μL，加無RNA酶的水(RNase Free dH20)補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，確認(rèn)real-time PCR的溶解曲線和擴(kuò)增曲線。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理及分析

采用GAPDH作為內(nèi)參照，用GAPDH的拷貝數(shù)作為校正基數(shù)，實(shí)驗(yàn)獲得各樣本中GNBP3的Ct(cycle threshold)值，與同樣本中GAPDH的Ct值相減，即獲得該樣本中GNBP3的△Ct值；以PBS對照組中的GNBP3與GAPDH的差值△Ct值作為校正，得出△△Ct(感染組△Ct-PBS對照組△Ct)值，按目的基因表達(dá)量= 2-△△Ct計(jì)算各感染樣本中GNBP3 mRNA的相對表達(dá)含量。采用Graphpad prism 6統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并繪制柱狀圖，應(yīng)用方差分析進(jìn)行組間比較，P<0.05時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 家蠅pMD18-T/GNBP3克隆載體構(gòu)建

選用克隆引物進(jìn)行PCR鑒定重組質(zhì)粒，結(jié)果見圖1，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行測序鑒定，確定插入片段鏈接方向正確。

圖1 pMD18-T/GNBP3重組質(zhì)粒PCR鑒定Fig.1 Identification of pMD18-T/GNBP3 by PCR amplification注：M，DL2000；1-2，克隆重組質(zhì)粒PCR。Note: Marker, DL2000; 1-2, PCR Product of cloning plasmid.

2.2 生物信息學(xué)分析

該cDNA序列ORF長為1473 bp，編碼490個(gè)氨基酸(圖2)。預(yù)測家蠅GNBP3蛋白的理論分子量為55884.6 Da，等電點(diǎn)為6.85。運(yùn)用Signal P結(jié)果顯示該編碼蛋白存在信號肽序列，位于1-27位氨基酸之間，因此判定該編碼蛋白為分泌型蛋白。運(yùn)用Smart軟件分析GNBP3的功能結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)了它的功能結(jié)構(gòu)域位于第352位到第422位氨基酸，推測此蛋白可能具有能與β-1,3葡聚糖結(jié)合并在信號通路中發(fā)揮作用的功能。通過NCBI的Alignment在線分析工具對家蠅GNBP3基因的cDNA序列進(jìn)行比對分析，結(jié)果顯示GNBP3基因?qū)儆讦缕暇厶荊H 16超家族，具有層粘連蛋白G保守結(jié)構(gòu)域，與果蠅具有高度同源性，其高達(dá)99%，具有識別β-1,3葡聚糖的功能(圖3)。

2.3 熒光PCR產(chǎn)物分析

根據(jù)Real time PCR原理，每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閩值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，以Ct值表示，其與反應(yīng)體系中目的基因cDNA的實(shí)際拷貝數(shù)直接相關(guān)且呈反比，因此以Ct值來反映目的基因cDNA起始含量，即Ct值越低，實(shí)際拷貝數(shù)越高，從而達(dá)到定量檢測的目的。本實(shí)驗(yàn)顯示，所有樣本中GNBP3 cDNA顯示指數(shù)增長，并達(dá)到平臺期，其擴(kuò)增曲線為一組典型的S型曲線，CT值線性范圍為15-30(圖4)。通過設(shè)置復(fù)孔取平均值，得到各樣本中目的基因擴(kuò)增的Ct值作為GNBP3的定量判定。在熔解曲線中均可見單一的峰，產(chǎn)物特異性好(圖5)。

2.4 感染組與對照組GNBP3 mRNA水平

2.4.1 感染后不同時(shí)間點(diǎn)

白色念珠菌感染后，家蠅GNBP3基因在感染后36 h表達(dá)量最高，比正常組上調(diào)了17.661倍，具有顯著性差異(P<0.05)，其次是3 h、12 h、48 h，其表達(dá)量較正常組分別上調(diào)了8.082倍、4.986倍、3.569倍，均具有顯著性差異(P<0.05)，其中在。而在感染后6 h、24 h表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其中24 h表達(dá)量差異性最小，隨時(shí)間變化家蠅GNBP3基因表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低再升高的趨勢(圖6)。

2.4.2 感染后不同組織

根據(jù)家蠅幼蟲感染白色念珠菌后不同時(shí)間點(diǎn)GNBP3基因的表達(dá)情況，選擇3 h、12 h、24 h、48 h時(shí)間點(diǎn)，分析感染后GNBP3基因在各組織(馬氏管、體壁、血淋巴、氣管、唾液腺、脂肪體、中腸)中的表達(dá)情況。3 h時(shí)，在血淋巴中的表達(dá)量最高，比對照組上調(diào)了6.38倍，具有顯著性差異(P<0.05)，其次是在脂肪體和體壁中，分別比對照組上調(diào)了2.2506倍和1.697倍，均具有顯著性差異(P<0.05)；12 h時(shí)，在體壁中的表達(dá)量最高，比對照組上調(diào)了7.155倍，具有顯著性差異(P<0.05)，其次是在脂肪體和血淋巴中，其表達(dá)量較對照組分別上調(diào)了4.6295倍和2.739倍，均具有顯著性差異(P<0.05)；24 h時(shí)，在血淋巴中的表達(dá)量最高，比對照組上調(diào)了9.679倍，具有極顯著性差異(P<0.0001)，而在唾液腺和脂肪體中的表達(dá)量呈下降趨勢，分別下調(diào)了3.292倍和2.366倍，均具有顯著性差異(P<0.05)；48 h，在血淋巴和脂肪體中表達(dá)量較對照組分別升高了2.583倍和3.207倍，均具有極顯著性差異(P<0.0001)，在中腸的表達(dá)量較對照組下降了2.892倍，具有顯著性差異(P<0.01)?？傮w表達(dá)量呈先升高后降低再升高的趨勢(圖7)。

圖2 GNBP3基因開放閱讀框cDNA序列及對應(yīng)編碼的氨基酸序列Fig.2 cDNA sequence of GNBP3 and the amino acid sequence encoded by the ORF

圖3 Alignment檢索結(jié)果Fig.3 Alignment result

圖4 GNBP3擴(kuò)增曲線Fig.4 The amplification of GNBP3注：A，感染后不同時(shí)間點(diǎn)；B，感染后3 h不同組織；C，感染后12 h不同組織；D，感染后24 h不同組織；E，感染后48 h不同組織。Note: A, Time post infection; B, Different tissues at 3 h postinfection; C, Different tissues at 12 h postinfection; D, Different tissues at 24 h postinfection; E, Different tissues at 48 h postinfection.

圖5 GNBP3溶解曲線Fig.5 The melting curve of GNBP3注：A，感染后不同時(shí)間點(diǎn)；B，感染后3 h不同組織；C，感染后12 h不同組織；D，感染后24 h不同組織；E，感染后48 h不同組織；Note: A, Time post infection; B, Different tissues at 3 h postinfection; C, Different tissues at 12 h postinfection; D, Different tissues at 24 h postinfection; E, Different tissues at 48 h postinfection.

圖6 GNBP3在感染后不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)Fig.6 The expression of GNBP3in different time after Canidia albicans infection注：*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.0001。

3 結(jié)論與討論

在基因表達(dá)的相對定量評估中最常用的方法為CT比較法。此方法假設(shè)PCR的擴(kuò)增效率為1，在靶基因同內(nèi)對照基因擴(kuò)增效率相同的情形下，直接通過公式2-△CT或2-△△CT進(jìn)行計(jì)算。在CT值比較法中，2-△CT和2-△△CT方程式的選用應(yīng)根據(jù)不同的研究目的。本研究主要通過檢測同一樣本經(jīng)過不同處理方式對靶基因表達(dá)的影響則選用公式2-△△CT，即2-△△CT= 2-((CT靶基因-CT內(nèi)對照基因)實(shí)驗(yàn)組-(CT靶基因-CT內(nèi)對照基因)對照組)。本研究應(yīng)用相對定量實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，選擇GAPDH作為內(nèi)參基因?qū)δ康幕蜻M(jìn)行校正，成功檢測了GNBP3 mRNA在家蠅幼蟲感染后不同時(shí)間點(diǎn)及不同組織中的表達(dá)，直觀的反應(yīng)了表達(dá)水平的不同。

圖7 GNBP3在感染后不同組織中的表達(dá)Fig.7 The expression of GNBP3 in different tissues after Candida albicans infection注：*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.0001；malpighian tubes,馬氏管；epidermis，體壁；haemolymph,血淋巴；trachea，氣管；salivary gland，唾液腺；fat body，脂肪體；intestine，腸道。

革蘭氏陰性菌識別蛋白-3(GNBP3)作為昆蟲先天性免疫病原識別因子，參與昆蟲先天性免疫應(yīng)答，其能夠識別真菌細(xì)胞壁中的β-1,3葡聚糖完成免疫系統(tǒng)對侵入體液中真菌的識別。家蠅孳生于雜亂菌叢的環(huán)境中傳播疾病，是重要的媒介昆蟲，其強(qiáng)大的免疫防御系統(tǒng)得到很多研究者的關(guān)注，而有關(guān)GNBP3在家蠅中的表達(dá)情況在國內(nèi)外研究報(bào)道中知之甚少。但對于其他昆蟲如黑腹果蠅(Quintinetal., 2013)、黑粉蟲(Zhongetal., 2013)、蝗蟲(Wangetal., 2013)、家蠶(Takahasietal., 2009)已有關(guān)于GNBP3參與免疫應(yīng)答的相關(guān)報(bào)道，但主要是闡述其參加TOLL信號通路，而對GNBP3在宿主感染情況下的表達(dá)研究很少，而對于家蠅GNBP3基因及其感染后表達(dá)水平的研究，到目前仍未見相關(guān)研究報(bào)道。本研究從家蠅幼蟲cDNA文庫中篩選到GNBP3基因序列，并成功克隆了GNBP3基因。通過注射白色念珠菌感染家蠅幼蟲，應(yīng)用qPCR檢測GNBP3的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與對照組比GNBP3表達(dá)量為：36 h>3 h>6 h>12 h>48 h>24 h，其表達(dá)隨時(shí)間的推移呈現(xiàn)先升高后降低再升高的狀態(tài)，當(dāng)機(jī)體受到真菌感染后，GNBP3應(yīng)激性增高參與機(jī)體免疫應(yīng)答，而后機(jī)體GNBP3表達(dá)量增高引起其他效應(yīng)分子對它的負(fù)調(diào)控使其含量降低，隨著真菌在機(jī)體內(nèi)繁殖，再次引起GNBP3高表達(dá)識別真菌引起下游免疫應(yīng)答反應(yīng)；在感染后不同組織中GNBP3的表達(dá)各有差異，3 h時(shí)，其表達(dá)量為：血淋巴>脂肪體>體壁>腸道>馬氏管>唾液腺>氣管；12 h時(shí)，其表達(dá)量為：體壁>脂肪體>血淋巴>唾液腺>氣管>馬氏管>腸道；24 h時(shí)，其表達(dá)量為：血淋巴>氣管>腸道>馬氏管>脂肪體>體壁>唾液腺；48 h時(shí)，其表達(dá)量為：脂肪體>血淋巴>馬氏管>唾液腺>氣管>體壁>腸道。有研究表明昆蟲抵御外界病原菌入侵是利用昆蟲表皮、組織間體液、血細(xì)胞及免疫器官等共同協(xié)同完成，保護(hù)自身免受微生物侵害。其中脂肪體和血淋巴是昆蟲的主要免疫器官，參與昆蟲的免疫應(yīng)答反應(yīng)，在家蠅感染白色念珠菌后，在血淋巴中GNBP3的表達(dá)始終呈現(xiàn)高表達(dá)，其次是在脂肪體中，在真菌感染最初GNBP3在體壁中的表達(dá)也相對增高。這說明GNBP3參與了家蠅先天性免疫系統(tǒng)對真菌的識別，而對于家蠅先天性免疫系統(tǒng)對真菌的識別機(jī)制需進(jìn)一步研究。此次研究將為今后家蠅先天性免疫系統(tǒng)對真菌的識別機(jī)制研究提供依據(jù)和參照，為進(jìn)一步探討家蠅先天性免疫系統(tǒng)提供新的思路。本研究成功克隆了GNBP3基因及檢測了GNBP3 mRNA在家蠅幼蟲感染后不同時(shí)間點(diǎn)及不同組織中的表達(dá)，直觀的反應(yīng)了其表達(dá)水平的差異。推測GNBP3在抵抗真菌感染的免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用。

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Cloning and expression pattern ofGNBP3 gene under the fungal infection inMuscadomestica

HU Ya1，2, LUO Man1, WANG Yu1,3, WANG Tao1,SHANG Xiao-Li1, ZHANG Ying-Chun1, XIU Jiang-Fan1,4*,WU Jian-Wei1,4

(1.Basic Medical College, Medical University of Guizhou, Guiyang 550004, China; 2.Bijie First Municipal People’s Hospital,Bijie 551700,Guizhou Province,China；3.Guizhou Provincial Center for Disease Control and Prevention, Guiyang 550004, China; 4.Bokang Biological Engineering Company Limited of Guizhou, Guiyang 550004, China)

To cloning and research the expression pattern ofGNBP3 Gene inMuscadomesticalarvae infected byCandidaalbicans.TheGNBP3 gene which was isolated fromM.domesticacDNA library was analyzed by the bioinformatics methods.M.domesticalarvae infectionC.albicansand collect specimens,total RNA was extracted from these samples and reverse transcription for cDNA,the expressions ofGNBP3 were detected by real-time fluorescent quantitative PCR．Laboratory data were then analysed statistically.The results indicated that the full-length ofGNBP3 gene was 1473 bp,encoding 490 amino acid.The molecular weight 55.8 kDa and pI of 6.85.Different time points after infection, infection group GNBP3 mRNA expression increased obviously in 3 h, 12 h and 36 h, 48 h compared with control group,comparing the two groups have a significant difference(P<0.05),and 24 h express different minima;Infection group different tissue compared with control group,express in the body wall, hemolymph and blood fat body volume significantly increased in 12 h, 3 h(P<0.05);Higher expression in the haemolymph, but low amount of expression in the salivary glands and the fat body than the control group of 24 h, have significant difference(P<0.05);Expressed in the hemolymph and blood fat body quantity higher,but low expression of intestinal amount than those of the control group in 48 h, all have significant difference(P<0.01).TheM.domesticaGNBP3 gene was successfully purified and analyzed by the bioinformatics methods.M.domesticalarvae infectionC.albicans,GNBP3 expression levels decrease with the passage of time after the first increase and then the trend of rise,the expression significantly increased in immunohistochemical (hemolymph and blood fat body),presumably play in the process of identifying the potential role of fungus.

GNBP3; real-time fluorescent quantitative PCR; infect; MRNA expression levels;Muscadomestica

胡亞，羅嫚，王宇,等.家蠅GNBP3基因克隆及感染白色念珠菌后的表達(dá)[J].環(huán)境昆蟲學(xué)報(bào)，2017,39(3):596-604.

國家自然科學(xué)基金(81360254)；貴州省科技廳省校合作項(xiàng)目(黔科合LH字〔2014〕7076號)；貴州省衛(wèi)生計(jì)生委科學(xué)技術(shù)項(xiàng)目(gzwjkj2014-2-100)；貴州省科學(xué)技術(shù)基金(黔科合J字〔2013〕2042號)

胡亞，女，碩士研究生，研究方向?yàn)獒t(yī)學(xué)昆蟲免疫及應(yīng)用，E-mail: hooyaa@126.com

*通訊作者Author for correspondence, E-mail: xiujiangfan@163.com; wjw@gmc.edu.cn

Received: 2016-04-26；接受日期Accepted: 2016-06-30

Q963

A

1674-0858(2017)03-0596-09