田航宇，俞 丹，邢文溪，李 明

斜紋夜蛾Cyp10基因的克隆及表達載體構建

田航宇，俞 丹，邢文溪，李 明*

(云南大學生命科學學院，云南省高校動物遺傳多樣性和進化重點實驗室，昆明 650091)

親環(huán)蛋白10(Cyclophilin 10, Cyp10)是親環(huán)蛋白家族成員之一，這是一類廣泛存在于真核及原核生物內的蛋白家族，其共性是都具有肽基脯氨酰順反異構酶(Peptidyl-prolyl cis-trans isomerases, PPIase)活性。有研究表明，Cyp10可能參與了腫瘤細胞凋亡蛋白胞質分布的調控，但在昆蟲先天免疫中的作用沒有見到報道。本研究以斜紋夜蛾Spodopteralitura為研究對象，以寄生后斜紋夜蛾血細胞轉錄組數據中發(fā)現的特異cyp10序列為基礎，通過RT-PCR克隆出了cyp10基因，通過生物信息學方法對此序列進行開放閱讀框分析(Open Reading Frame, ORF)和序列同源性比對，發(fā)現cyp10基因ORF全長486 bp，編碼161個氨基酸，具有肽基脯氨酰順反異構酶家族標簽序列：YNGSLFHRNIKGFIVQTG，因此確定為親環(huán)蛋白基因家族成員。構建了包括ORF全長編碼區(qū)的原核表達載體pET32a-Cyp10及真核表達載體pIZT/V5-His-Cyp10，經Western blot證明，pET32a-Cyp10和pIZT/V5-His-Cyp10可分別在大腸桿菌和鱗翅目昆蟲細胞系(Hi5, Sf9和Spli221)中表達，蛋白分子量分別是26 kDa和22 kDa。之后以細胞免疫熒光定位法探索Cyp10在家蠶細胞BmN內的分布, 發(fā)現Cyp10主要分布于細胞質內。這些結果為進一步探索Cyp10在昆蟲先天免疫中的作用奠定了一定基礎。

斜紋夜蛾；Cyp10；克??；表達；免疫熒光

親環(huán)蛋白(Cyclophilin, Cyp)于1984年在牛胸腺中被發(fā)現，又稱為環(huán)孢素A結合蛋白(Handschumacheretal., 1984)。目前已被發(fā)現和克隆的親免素有130多種異構體(Galatetal., 1999)。最早被發(fā)現和提純的親環(huán)蛋白是親環(huán)蛋白A(Cyclophilin, CypA)，其也是迄今為止研究最為廣泛的親環(huán)蛋白家族成員。親環(huán)蛋白作為免疫抑制劑環(huán)孢素A(CsA)的受體，除具有肽基脯氨酰順反異構酶(PPLase)活性和作為分子伴侶外，在輔助蛋白質折疊(Iveryetal., 2000)、參與細胞凋亡(Leeetal., 1999)和細胞信號傳導(Jinetal., 2000)等方面起著重要作用。親環(huán)蛋白在進化上高度保守，廣泛存在于真核生物和原核生物中(Kolerskyetal., 1986)。

親環(huán)蛋白10(Cyclophilin10, Cyp10)作為親環(huán)蛋白家族成員之一，又被稱為PPIL3 (peptidylproly isomerase-like 3)、CypJ等(Zhouetal., 2001)，與CypA相比具有40%的同源性(Huetal., 2005)。有研究表明，Cyp10參與腫瘤細胞中凋亡蛋白Apoptin的調控，它可以通過調節(jié)凋亡蛋白的構象和核質分布，來參與腫瘤細胞凋亡的調節(jié)(De-Huaetal., 2008)。為了探討Cyp10是否在昆蟲的先天免疫中也參與了昆蟲血細胞的凋亡，本研究以鱗翅目昆蟲斜紋夜蛾Spodopteralitura為研究對象，以斜紋夜蛾被雙斑側溝繭蜂Microplitisbicoloratus寄生后的血細胞轉錄組數據為基礎，通過設計特異引物和RT-PCR法從寄生后斜紋夜蛾血細胞中克隆獲得了cyp10基因，測序后通過BLAST及同源比對，確認為斜紋夜蛾cyps基因家族成員，并且與同為鱗翅目的大紅斑蝶Danausplexippus的Cyp10高度同源，因 此被命名為Cyp10。隨后便構建了原核表達載體pET32a-Cyp10和真核表達載體pIZT/V5-His-Cyp10，分別轉入大腸桿菌和昆蟲細胞系中，通過Western blot檢測，結果表明分別獲得了表達蛋白，并通過免疫細胞定位發(fā)現了Cyp10在細胞的分布情況，這些都為進一步探究Cyp10在昆蟲先天免疫中的作用奠定了一定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗昆蟲及細胞

本實驗室所用實驗昆蟲為斜紋夜蛾，蟲蛹及飼料配方均來自于中山大學有害生物控制與資源利用國家重點實驗室。High Five、Spli221細胞系由中山大學有害生物控制與資源利用國家重點實驗室細胞培養(yǎng)室贈送；Sf9細胞系由云南省出入境檢驗檢疫局動檢處惠贈，以上細胞系均由本實驗室進行培養(yǎng)，傳代和凍存。培養(yǎng)所需的培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的Hyclone TNM-FH昆蟲培養(yǎng)基。在不含二氧化碳的27℃細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。12孔板中細胞密度約90%時進行轉染，48 h后在熒光顯微鏡下通過觀察熒光鑒別轉染是否成功。72 h后提取總蛋白進行Western blot檢測。

1.1.2 菌株、載體和試劑

大腸桿菌DH5α和BL21均購于北京全式金生物技術有限公司；昆蟲原核表達載體pET-32a及真核表達載體pIZT/V5-His均為實驗室保存；pMD19-T載體，Taq DNA polymerase及限制性內切酶均購自于Takara公司；RNA提取試劑盒(RNAisoTM Plus)、PCR產物回收試劑盒(Agarose Gel DNA Purification Kit)購于大連寶生物有限公司；質粒提取試劑盒(E.Z.N.A Plasmid Mini Kit I與Endo-free Plasmid Mini Kit II)均購于OMEGA生物公司；GADPH抗體，蛋白Marker、HRP偶聯(lián)的山羊抗鼠二抗購于碧云天公司；超敏化學發(fā)光試劑盒(protein biology)購于Thermo公司；His抗體購于abcam公司；V5抗體購于Invitrogen公司。其它試劑均為分析純(A.R)。轉染試劑X-tremegene HP DNA Transfection Reagent(06366236001)購于Roche公司；熒光染料Propidium iodide (PI)購于Roche公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計和合成

本研究所用的引物是根據轉錄組測序所得到的斜紋夜蛾cyp10的序列，由本實驗研究人員通過Primer Primer 5設計帶酶切位點的引物送昆明晨綠公司合成。具體序列及說明見表1，用于后續(xù)原核，真核表達載體的構建。

1.2.2 總RNA的提取及cDNA的轉錄合成

提取一定量的4齡的斜紋夜蛾血淋巴，通過Trizol法提取總RNA。取1 ug RNA通過逆轉錄試劑盒合成cDNA。

1.2.3cyp10基因的PCR擴增

根據實驗室的PCR反應步驟，設置反應體系為15 μL，取1 μg cDNA為模板，30個循環(huán)，Tm值為55℃，進行cyp10的擴增及凝膠電泳檢測，結果擴增目的片段大小與轉錄組測序結果一致，通過膠回收試劑盒回收DNA，后與pMD19-T載體連接，轉化大腸桿菌DH5α，藍白斑篩選，挑選白色菌落進行菌落PCR鑒定正確后送昆明擎科公司測序分析。

1.2.4 生物信息學分析

利用在線工具ExPASy ProtParam tool分析蛋白理化性質，在線BLAST工具對預測的蛋白質氨基酸序列進行同源性比對；用BioEdit對測序結果進行比對分析，用TMHMM Sever 2.0進行在線跨膜結構域的預測，SMART分析結構域，MEGA 6.06進行遺傳距離分析，并用NJ法構建系統(tǒng)進化樹。

1.2.5 斜紋夜蛾Cyp10的原核表達載體構建

取經測序成功的E-pMD-19-Cyp10菌夜，加A+抗性過夜培養(yǎng)，用試劑盒提取質粒，根據設計的相應酶切位點對T載體質粒進行雙酶切(Cyp10：BamHI/XhoI),用同樣的酶對原核表達載體pET32a進行雙酶切。之后將T載體上的目的基因片段和原核表達載體片段進行回收，T4連接酶16℃過夜連接。轉化大腸桿菌克隆菌株DH5α，挑選白色菌落雙酶切鑒定。鑒定成功后擴大培養(yǎng)，提質粒轉化大腸桿菌表達菌株BL21，用于原核表達。

1.2.6 斜紋夜蛾Cyp10的真核表達載體構建

取經測序成功的E-pMD-19-Cyp10菌夜，加A+抗性過夜培養(yǎng)，用試劑盒提取質粒，根據設計的相應酶切位點對T載體質粒進行雙酶切(cyp10：EcoRI/NotI)，用同樣的酶對真核表達載體pIZT/V5-His進行雙酶切。之后將T載體上的目的基因片段和真核表達載體片段進行回收，T4連接酶16℃過夜連接。轉化大腸桿菌克隆菌株DH5α，挑選白色菌落雙酶切鑒定。鑒定成功后過夜培養(yǎng)鑒定連接正確的菌夜，通過無內毒素質粒提取試劑盒提取質粒，用于真核細胞系的轉染和表達。

1.2.7 重組蛋白的表達及檢測

原核表達中，將重組質粒pET32a-cyp10轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，在含有100 mg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37℃震蕩培養(yǎng)至OD600=0.5。加入IPTG誘導至終濃度為0.5 mmol/L，搖床培養(yǎng)5 h，誘導蛋白表達。8000 rpm離心5 min收集菌體，加入PBS冰上超聲破碎，至溶液呈清亮為止，加入5×SDS樣品緩沖液，100℃煮沸10 min。SDS-PAGE電泳檢測。

真核表達中，瞬時轉染昆蟲細胞72 h后，熒光顯微鏡檢測GFP，確定pIZT/V5-His-CyP10轉染成功，之后提取細胞總蛋白，用BCA法定量蛋白濃度。

取50 μg蛋白上樣電泳，300 mA轉膜100 min 5%脫脂牛奶溫室封閉1 h后，一抗原核表達用His標簽抗體(1∶1000)；真核表達用V5標簽抗體(1∶2000)；二抗都用山羊抗鼠(1∶1000)進行孵育，最后用Tanon 5200曝光顯影。

1.2.8 免疫細胞熒光定位

將家蠶BmN細胞接種于12孔板，72 h后，用PBS洗細胞，3.7 %甲醛室溫固定15 min，0.2% TritonX-100處理細胞10 min。4%牛奶封閉1 h后，加入一抗V5標簽抗體(1∶1000)孵育1 h。PBST(PBS+0.05%Tween-20)洗兩次(10 min×2)，再加入二抗Alexa Fluor? 568 Goat Anti-Rabbit lgG(H+L)(1∶2000)孵育1 h。1×PBS洗兩次(5 min×2)，加入鬼筆環(huán)肽稀釋40倍(1×PBS配制)，37℃孵育30-60 min。1×PBS洗一次(5 min)。加入DAPI(終濃度為300 nmol/L)室溫孵育5 min。熒光顯微鏡觀察。

2 結果與分析

2.1 斜紋夜蛾cyp10基因的克隆

通過對寄生后斜紋夜蛾血細胞轉錄組測序結果的分析，獲得了cyp10基因cDNA的預測序列。以此為模板，設計特異性引物(表1)，以提取斜紋夜蛾血細胞mRNA反轉錄獲得的cDNA為模板，PCR擴增獲得了一條490 bp的特異性片段(圖1)。通過NCBI在線ORF查找工具，找到了特異的cyp10基因序列，根據ORF設計了帶有酶切位點的引物(表1)，為后面表達載體的構建做準備。

圖1 斜紋夜蛾中cyp10基因的PCR擴增產物Fig.1 PCR product of cyp10 in Spodoptera litura

表1 本研究所用到的引物Table 1 Primers used in this study

2.2 斜紋夜蛾cyp10基因的亞克隆及測序鑒定

將上述獲得的斜紋夜蛾cyp10克隆片段用試劑盒回收，與pMD19-T克隆載體連接，轉化EscherichiacoliDH5α，通過藍白斑篩選陽性克隆，挑選陽性克隆擴大培養(yǎng)，菌液PCR鑒定，與PCR擴增產物的大小一致。把連接好可能正確的pMD19-T-Cyp10菌液送去公司進行測序，之后用BioEdit軟件對得到測序全長結果與原序列進行對比，完全正確。斜紋夜蛾cyp10基因序列ORF長為486 bp，編碼161個氨基酸。 氨基酸序列 (如圖2)。

2.3 斜紋夜蛾Cyp10的生物信息學分析

通過ExPASy ProtParam tool預測分子量大小為18 kDa，分子式是C795H1220N212O243S8。經過在線軟件TMHMM 2.0預測，它沒有跨膜結構域，初步斷定其不屬于膜蛋白。通過TargetP 1.1進行亞細胞定位預測，發(fā)現Cyp10定位不在線粒體。使用PROSITE數據庫(http://www.expasy.org/prosite)對Cyp10蛋白結構功能域進行分析發(fā)現， Cyp10蛋白第6-154氨基酸之間是高度保守的結構功能域-PPIase cyclophilin-type，即親環(huán)蛋白家族成員共有的典型結構域，該結構功能域具有肽基脯氨酰順反異構酶活性(PPIase)。再通過PROSITE motif搜索預測Cyp10保守功能位點，發(fā)現Cyp10蛋白保守功能位點是37-54位的氨基酸序列：YNGSLFHRNIKGFIVQTG(圖2紅色箭頭處)，即，親環(huán)蛋白家族標簽序列。用DISPHOS 1.3預測Cyp10蛋白磷酸修飾位點，發(fā)現有五個蘇氨酸修飾位點可能存在(圖2藍色箭頭處)，代表該蛋白質在翻譯后可能會進行修飾。

用DNAman軟件對斜紋夜蛾Cyp10氨基酸序列與其它已經報道的物種的Cyp10氨基酸序列進行同源性比對，結果表明斜紋夜蛾Cyp10與無脊椎動物中的大紅斑蝶Cyp10(GenBank登錄號：EHJ72048.1)，家蠶BombyxmoriPPIL3(GenBank登錄號：XP_004928560.1)，脊椎動物中的人類HomosapiensPPIL3b(GenBank登錄號:NP_570981.1)，斑馬魚PoissonzèbrePPIL3(GenBank登錄號: NP_001002146.1)高度同源，并且它們都有親環(huán)蛋白家族共同的標簽序列YNGSLFHRNIKGFIVQTG。因此，確定我們克隆的基因為斜紋夜蛾親環(huán)蛋白家族成員。

2.3 斜紋夜蛾Cyp10系統(tǒng)進化樹的構建與分析

從NCBI網站下載其它已經報道的部分物種的親環(huán)蛋白基因序列，運用MEGA 6.0軟件Test Neighbor joining Tree方法進行系統(tǒng)進化樹的分析(圖3)，結果表明斜紋夜蛾Cyp10(綠色版塊帶星號)與同為鱗翅目的家蠶的PPIL3最為接近，之后與大紅斑蝶，小菜蛾聚到一起，最后與達氏按蚊，豌豆長管蚜及人體虱同屬一大支；而與斑馬魚及人類親緣性較遠。預示斜紋夜蛾Cyp10可能與家蠶PPIL3的功能相近。

2.4 斜紋夜蛾Cyp10基因的原核表達

將擴增出來的目的片段回收純化后，分別用BamHI和XhoΙ酶切Cyp10；連接到相同酶切回收后的原核表達載體pET-32a上，熱激轉化E.coliDH5α，獲得pET-32a-Cyp10。對重組質粒進行雙酶切鑒定，切出目的條帶(圖4 A)與預期大小一致，將陽性克隆測序，序列比對結果正確，表明pET-32a-Cyp10原核表達載體構建成功(圖4 B)。將構建好的pET-32a-Cyp10質粒轉入大腸桿菌表達菌株BL21(DE 3)中，37℃過夜培養(yǎng)。經過驗證，加入IPTG誘導，終濃度為0.5 mmol/L ，誘導培養(yǎng)5 h， Western blot檢測融合蛋白6 His標簽，在25-35 kDa出現目的條帶，與預期結果相符(圖4 C)，GADPH為內參。由此證明斜紋夜蛾Cyp10能在原核表達系統(tǒng)中表達，原核表達載體構建成功。

圖2 斜紋夜蛾Cyp10與其它物種的同源比對Fig.2 Multiple sequence alignment of Cyp10 from Spodoptera litura with those from other species注：實心箭頭指示的是親環(huán)蛋白家族標簽序列；空心箭頭指示的是磷酸化位點。大紅斑蝶，EHJ72048.1；家蠶，XP_004928560.1；人類，NP_570981.1；斑馬魚，NP_001002146.1。Note: The solid arrow indicates the tag sequence of Cyclophilin protein family; the hollow arrow indicates the phosphorylation sites.Danaus plexippus, EHJ72048.1; Bombyx mori, XP_004928560.1; Homo sapiens, NP_570981.1); Danio rerio, NP_001002146.1.

圖3 斜紋夜蛾Cyp10與其他物種Cyps的系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic analysis based on amino acid sequences of SpliCyp10 protein and other insect cyclophilin proteins

圖4 重組質粒pET-32a-CyP10在大腸桿菌BL21(DE3)中的原核表達Fig.4 Prokaryotic expression of pET-32a-CyP10 in BL21 (DE3)注：A，重組質粒pET-32a-Cyp10的雙酶切鑒定；B，Cyp10原核表達結構及組成融合蛋白的表達量；C，Western blot檢測Cyp10融合蛋白的表達；M，低分子標準蛋白；GADPH，內參蛋白。Note: A, The identification of pET-32a-Cyp10 by double enzyme digestion; B, The prokaryotic expression structure and fusion protein molecular weight of Cyp10; C, Expression of fusion protein His-Cyp10-His determined by Western blot; M, protein mark; GADPH, inter control protein.

2.5 斜紋夜蛾Cyp10基因的真核表達

圖5 重組質粒pIZT-Cyp10在High Five, Sf9 and Spli221細胞中的真核表達Fig.5 Eukaryotic expression of pIZT-Cyp10 in High Five, Sf9 and Spli221 cells注：A，重組質粒pIZT-Cyp10的雙酶切鑒定；B，SpliCyp10真核表達結構以及融合蛋白表達量；C，Cyp10轉染High Five，Sf9 and Spli221細胞系48 h后熒光觀察GFP表達；D，Western blot檢測Cyp10-V5-His在High Five, Sf9 and Spli221中融合蛋白表達。GADPH，內參蛋白；Bar=20 μm。Note：A, The identification of pIZT-Cyp10 by double enzyme digestion; B, The eukaryotic expression structure and fusion protein molecular weight of Cyp10; C, Cyp10 tranfected in High Five, Sf9, Spli221 cells 48 h, showed the expression of GFP; D, Expression of fusion Protein Cyp10-V5-His determined by Western blot in High Five, Sf9 and Spli221 cells.GADPH, inter control protein; Bar=20 μm.

為進一步研究Cyp10的功能，本研究構建了pIZT/V5-His-Cyp10的真核表達載體。將擴增出來的目的片段回收純化后，均用EcoRI和NotI酶切Cyp10，連接到相同酶切回收后的真核表達載體pIZT/V5-His上，熱激轉化E.coliDH5α，獲得pIZT/V5-His-Cyp10。對重組質粒進行雙酶切鑒定，切出的條帶(圖5 A)與預期大小一致，將陽性克隆測序，序列比對結果正確，表明pIZT/V5-His-Cyp10真核表達載體構建成功。將驗證正確的質粒轉入斜紋夜蛾Spli221細胞，粉紋夜蛾High Five細胞及草地貪夜蛾Sf9細胞系中表達。72 h后，在熒光顯微鏡下可看到明顯的熒光(圖5 C)。GFP蛋白為真核質粒pIZT/V5-His上的自帶蛋白，有熒光說明轉染成功。然后用識別載體本身表達的V5序列標簽抗體進行western blot實驗，發(fā)現Cyp10均在15 kDa-25 kDa有特異性條帶(圖5 D)，與預期的22 kD基本一致，且轉染空質粒的沒有條帶。

2.6 亞細胞定位

Cyp10在家蠶BmN細胞內的定位如圖6紅色熒光所示，由圖可知Cyp10主要分布于細胞質且靠近細胞核。經鬼筆環(huán)肽處理后細胞骨架發(fā)藍色熒光，DAPI處理后細胞核發(fā)藍色熒光，Merge為疊加圖片。

圖6 Cyp10免疫細胞熒光定位Fig.6 The localization of Cyp10 in BmN cells注：綠色熒光為細胞骨架，藍色熒光為細胞核，紅色熒光為pIZT/V5-His-Cyp10。Note: Green fluorescence is cytoskeleton, blue fluorescence is nucleus, red fluorescence is pIZT/V5-His-Cyp10.

3 結論與討論

目前，對親環(huán)蛋白的研究主要集中在脊椎動物，特別是人類的相關疾病，例如：動脈粥樣硬化(Satohetal., 2008)，HIV-1病毒的復制(Towers, 2007)和炎性疾病的發(fā)生等，且以親環(huán)蛋白A的功能研究較多。而在無脊椎動物中，親環(huán)蛋白的研究較少。對于Cyp10的研究，目前主要在其分子克隆上，如人胚胎腦PPIL3的分子克隆(Zhouetal., 2001)等。而其生物學功能的研究，目前很少有見報道，De-Hua等(2008)發(fā)現PPIL3可能與凋亡蛋白Apoptin的折疊和細胞內分布相關，這提示其可能參與了細胞凋亡。

細胞凋亡是核酸內切酶催化下染色質DNA降解的過程，而這一過程與一系列基因的激活、表達以及調控有關(Domingos and Steller, 2007)，有研究表明親環(huán)蛋白具有核酸酶活性(Montagueetal., 1994)，且參與了T細胞的自然凋亡，但具體調控機制尚不清楚。而在上述轉染實驗過程中，轉染了pIZT/V5-His-Cyp10的幾種昆蟲細胞均出現了不同程度的凋亡現象，對照組沒有這種現象，預示Cyp10可能參與了細胞的凋亡過程。

本研究以斜紋夜蛾為研究對象，研究其被雙斑側溝繭蜂寄生后的免疫反應，已有研究報道雙斑側溝繭蜂攜帶的PDV病毒會使宿主細胞凋亡(Luo and Pang, 2006)，因此我們推測此過程是否與親環(huán)蛋白的表達有關。我們以斜紋夜蛾血細胞轉錄組數據中發(fā)現的特異cyp10序列為基礎，從斜紋夜蛾血細胞中克隆達到了cyp10基因，確定了其編碼區(qū)大小為486 bp，并且通過生物信息學分析了Cyp10的理化性質及預測了結構功能域。同源比對確定從斜紋夜蛾血細胞中克隆的cyp10為斜紋夜蛾親環(huán)蛋白家族成員，具有肽基脯氨酰順反異構酶活性，并且與鱗翅目昆蟲大紅斑蝶的cyp10高度同源，因此命名為Cyp10。系統(tǒng)進化樹的分析發(fā)現， Cyp10與家蠶PPIL3親緣性最為接近，而與脊椎動物人或斑馬魚的親緣性較遠，預示Cyp10可能與家蠶PPIL3功能相近，由于相關文獻報道較少，所以Cyp10的具體功能還需深入探究，為此我們構建了原核表達載體和真核表達載體。

本文成功構建的原核表達載體pET32a-Cyp10主要用于后期Cyp10特異性抗體的制備，方便以后Cyp10的功能研究。而成功構建的真核表達載體pIZT/V5-His-Cyp10及在昆蟲細胞系中的成功表達，為進一步探索Cyp10在昆蟲先天免疫中的作用奠定了一定基礎。在將Cyp10轉染進入到真核細胞的過程中需要合適的載體。本實驗所選擇的真核細胞表達載體pIZT/V5-His是一種帶有GFP的載體，篩選標記簡單，是一種進行基因轉染、表達的理想載體。質粒轉染細胞后在特定的波長下發(fā)綠色熒光，為確定Cyp10是否轉染成功提供了直觀的標記靶位。圖5C中的綠色熒光說明成功轉染了pIZT/V5-His空載和pIZT/V5-His-Cyp10。

原核生物蛋白表達沒有翻譯后的修飾過程，表達量即為自身。而真核生物表達的蛋白的翻譯表達常伴隨著磷酸化，去磷酸化等多種修飾途徑，故表達的蛋白大小可能與預測的有差異。由于前面對斜紋夜蛾Cyp10蛋白磷酸修飾位點的預測，發(fā)現有五個可能存在的蘇氨酸修飾位點(圖2)，代表該蛋白質在翻譯后可能會進行修飾。通過Western blot發(fā)現pIZT/V5-His-Cyp10在High Five和Spli221細胞中的分子量稍微低于預測的大小22 kDa，特別是在Spli221細胞中，但在Sf9細胞中蛋白分子量接近22 kD。因此推測Cyp10在High Five和Spli221細胞中可能發(fā)生了修飾。

真核表達載體構建成功后，為進一步探究Cyp10的生物學功能，我們應用細胞免疫熒光定位法對Cyp10進行了亞細胞定位。結果顯示其主要分布細胞質中，這與De-Hua等(2008)探究的Cyp10與凋亡蛋白Apoptin在腫瘤細胞細胞質中相互作用相符，這將為更深入探討Cyp10的生物學功能提供幫助。而對于Cyp10深入的研究將有利于揭示昆蟲先天免疫的分子機制。

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Molecular cloning and construction of expression vector of Cyp10 fromSpodopteralitura

TIAN Hang-Yu, YU Dang, XING Wen-Xi, LI Ming*

(Yunnan Province Key Laboratory for University Zoological Gentic Diversity and Evolution, School of Biosciences, Yunnan University, Kunming 650091,China)

Cyclophilin 10 is one of the members of Cyclophilin protein family with cis-trans isomerases Peptidyl-prolyl activity, which is widely distributed in eukaryotes and prokaryotes.Recent studies indicate that Cyp10 may be involved in cytoplasmic distribution of apoptin in tumor cells.However, little is known about the function of this protein in insect innate immunity.Here, we clonedcyp10 Open Reading Frame (ORF), which contained 486 bp, conded 161 AA, from theSpodopteraliturahemocytes by RT-PCR.Then, using the bioinformatics methods, the peptidyl prolyl cis-trans isomerase family tag sequence was found YNGSLFHRNIKGFIVQTG, which belongs to the conversedcypgene family.Furthermore, pET32a-Cyp10 were constructed and expressed 26 kDa by usingE.coli.Likewisely, pIZT/V5-His-Cyp10 were constructed to express 22 kDa in insect cell lines (High Five, Sf9 and Spli221).Finally, we foud that Cyp10 distributed in the cytoplasm of BmN cells by immunofluorescence.This study provides a possibility for functional research of Cyp10 in insect innate immunity.

Spodopteralitura；Cyp10；cloning；expression；immunofluorescence

田航宇，俞丹，邢文溪,等.斜紋夜蛾Cyp10基因的克隆及表達載體構建[J].環(huán)境昆蟲學報，2017,39(3):588-595.

國家自然基金項目(31360454, 31260448, 31560528)；云南省應用基礎研究計劃項目(2012FB120)

田航宇，男，1990年生，碩士，云南曲靖人，主要從事昆蟲的先天免疫研究，E-mail:tianhangyu@163.com

*通訊作者Author for correspondence，E-mail:leeming@ynu.edu.cn

Received：2016-03-30；接受日期Accepted：2016-05-26

Q963;S433.4

A

1674-0858(2017)03-0588-08