艾賢龍，張雅林

粘蟲中腸總蛋白質(zhì)雙向電泳體系的優(yōu)化方法

艾賢龍，張雅林*

(西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

為了今后更好的利用雙向電泳技術(shù)研究不同處理后粘蟲Mythimnaseparata中腸蛋白表達(dá)差異，本研究比較了不同的蛋白提取方法、IPG膠條、二硫蘇糖醇(DTT)濃度和等電聚焦條件，建立了適用于粘蟲中腸總蛋白質(zhì)的雙向電泳體系。結(jié)果表明：采用Tris-飽和酚法提取蛋白質(zhì)，選取pH為5-8的線性IPG膠條進(jìn)行第一向等電點(diǎn)分離，按照DTT濃度I和等電聚焦程序II進(jìn)行雙向電泳分離，獲得了蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)多、背景清晰、分辨率高的蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜。

粘蟲；中腸；雙向電泳；蛋白質(zhì)

粘蟲Mythimnaseparata是一種典型的季節(jié)性遠(yuǎn)距離遷飛性農(nóng)業(yè)害蟲，每年南北往返遷飛危害(王玉正和張孝羲，2001)。近年來，粘蟲在中國的東北、華北、黃淮部分地區(qū)多次出現(xiàn)高密度集中危害情況，嚴(yán)重影響著玉米、小麥和水稻等糧食作物的食品安全(潘蕾等，2014)。中腸是昆蟲的第二大組織，是消化道最主要的部分，昆蟲的許多消化酶合成和分泌都是在中腸完成的。除此之外，中腸還是許多致病微生物、農(nóng)藥和天然毒素的靶標(biāo)(Dow,1986)。對(duì)于昆蟲中腸的研究，無論是對(duì)藥物毒理探索，還是對(duì)昆蟲抗藥性研究都有十分重要的意義。利用蛋白質(zhì)組技術(shù)研究昆蟲中腸取得了一定的成果。Bt的作用受體是昆蟲中腸內(nèi)的氨肽酶(Am inopeptidase N,APN)(Knowles and Ellar，1986；Hofmannetal.，1988；RIEetal.，1989)。McNall和Adang(2003)利用雙向電泳結(jié)合免疫印跡從煙草天蛾Manducasexta中腸上的Bt結(jié)合位點(diǎn)上鑒定出了肌動(dòng)蛋白、氨肽酶N、和堿性磷酸酶(McNall and Adang，2003)。而Candas等利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)證實(shí)了昆蟲對(duì)Bt抗性的產(chǎn)生與生理適應(yīng)性是多層面的，包括蛋白修飾以及特定的幼蟲中腸蛋白合成的變異(Candasetal.，2003)。

蛋白質(zhì)組學(xué)研究的是一個(gè)組織或者細(xì)胞的蛋白表達(dá)情況，是一種準(zhǔn)確鑒定高通量蛋白的方法，研究的關(guān)鍵技術(shù)包括雙向電泳技術(shù)(2-DE)、質(zhì)譜鑒定技術(shù)、核磁共振、蛋白質(zhì)芯片、噬菌體展示技術(shù)、酵母雙雜交系統(tǒng)、蛋白質(zhì)組生物信息學(xué)等。其中雙向電泳技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)是當(dāng)前分離鑒定蛋白質(zhì)的兩大支柱技術(shù)。在雙向電泳中，要得到高分辨率、重復(fù)性好的2-DE圖譜，樣品制備是十分重要的一步(Wangetal.，2006)，而不同的樣品或者組織需要選擇不同的蛋白制備方法。雙向電泳第一向?yàn)榈赛c(diǎn)聚焦，其原理是依靠蛋白質(zhì)等電點(diǎn)來分離蛋白質(zhì)，所使用的IPG膠條能夠在等點(diǎn)聚焦的過程中保持穩(wěn)定的pH梯度，從而使的帶不同浄電荷的蛋白質(zhì)有效分離，目前已經(jīng)有不同范圍的pH膠條可供選擇(Sahabetal.，2005)。第一向等點(diǎn)聚焦程序的步驟分為：水化；除鹽；升壓；聚焦，選擇最合適的程序有利于蛋白質(zhì)分離。第二向?yàn)镾DS-PAGE凝膠電泳分離，按照分子量大小分離蛋白質(zhì)。堿性蛋白2-DE分離效果的提高一直是蛋白組學(xué)研究領(lǐng)域關(guān)注的問題(G?rgetal.，1995；Roberts and van Oostrum，2002；Baeetal.，2003；Penningtonetal.，2004)。堿性蛋白是組織和細(xì)胞中重要的組成部分，研究堿性蛋白有重要的意義(曹晶等，2004)，例如組蛋白、精蛋白和核糖體蛋白均屬于堿性蛋白質(zhì)(Wangetal.，2002)。在堿性條件下，DTT會(huì)干擾等點(diǎn)聚焦pH梯度，DTT帶有負(fù)電荷，在等點(diǎn)聚焦過程中可能會(huì)跑出膠條，因此改變DTT濃度會(huì)改善堿性端蛋白分布。目前，尚未見到關(guān)于粘蟲中腸蛋白質(zhì)組學(xué)的報(bào)道，研究適宜的雙向電泳條件需要大量的試驗(yàn)。

本研究通過探索不同的等點(diǎn)聚焦程序，不同的DTT濃度，不同的提取蛋白質(zhì)方法以及不同pH梯度的膠條，建立了適用于粘蟲中腸的雙向電泳條件。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

尿素、硫脲、CHAPS、二硫蘇糖醇(DTT)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、考馬斯亮藍(lán)G-250、低熔點(diǎn)瓊脂糖、碘乙酰胺、Tris-平衡酚均產(chǎn)于Solarbio公司。四甲基二乙胺(TEMED)和β-巰基乙醇產(chǎn)于MP Biomedicals公司。IPG膠條(17 cm，pH3-10，非線性)IPG膠條(17 cm，pH5-8，線性)40%Bio-lyte(pH 3-10)為Bio-Rad公司生產(chǎn)。溴酚藍(lán)、牛血清蛋白、Tris-base、過硫酸銨、甘氨酸硫酸銨、蔗糖、EDTA、乙酸銨、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氫氧化鈉、氯化鈉、丙酮、三氯醋酸(TCA)、30%Acr-bis、乙醇冰醋酸、磷酸、甘油為國產(chǎn)分析純。

Infinite M 200 PRO型酶標(biāo)儀(Tecan)、等電聚焦電泳儀(Bio-Rad)、垂直電泳儀(Bio-Rad)、彩色掃描儀(Umax)。

1.2 試蟲處理

粘蟲購自西北農(nóng)林科技大學(xué)無公害農(nóng)藥研究中心，所有試蟲喂食野燕麥葉片，飼養(yǎng)于25℃±2℃,50%相對(duì)濕度的環(huán)境中。挑選剛蛻皮的五齡幼蟲提取中腸，以保證中腸內(nèi)沒有食物殘留。提取出的中腸置于速凍管中在液氮中速凍、在-80℃冰箱中保存。

1.3 蛋白提取

1.3.1 磷酸抽提法

在研缽中加入組織和液氮，用液氮將組織研磨成極細(xì)的粉末，取出粉末置于Ep管中并迅速投入液氮中。將磷酸抽提緩沖液(2.6 mM KH2PO4, 32.5 mM K2HPO4, 400 mM NaCl, pH7.6)加入到Ep管中；在4℃、12000 g 離心10 min，保存沉淀；上清液繼續(xù)15000 g離心10 min；吸掉脂肪層，收集上清至另一Ep管中，保存沉淀；兩次沉淀合并后加入磷酸抽提緩沖液，冰上研磨后15000 g離心10 min，收集上清；沉淀中加入蛋白溶解緩沖液(2 M硫尿,8 M尿素,20 mM Trisbase, 4% CHAPS,30 mM DTT, 0.5% Bio-lyte)，15000 g離心10 min 2次，收集上清；合并上清加入TCA，使其濃度達(dá)到10%，冰浴靜置10 min；4℃，15000 g離心2次，棄上清液；沉淀加入蛋白溶解緩沖液冰上溶解、置于-80℃冰箱保存。

1.3.2 Tris-飽和酚法

研磨同1.3.1；在冰上加勻漿緩沖液(20 mM Tris-Hcl pH 7.5，250 mM蔗糖，10 mM EDTA，1 mM DTT，1% CHAPS，1 m Mβ-巰基乙醇)繼續(xù)研磨成勻漿；加入等體積Tris-飽和酚，震蕩30 min,-4℃ 15000 g離心20 min，取酚相；加入3倍體積含.01 M乙酸銨的甲醇溶液過夜沉淀蛋白；沉淀用甲醇溶液洗1次，用含有13 mM DTT的冷丙酮溶液洗2次，每次均在4℃，15000 g條件下離心15 min；在-20℃下凍干，使用時(shí)用蛋白溶解緩沖液(2 M硫尿，8 M尿素，20 mM Trisbase，4% CHAPS，30 mM DTT，0.5%Bio-lyte)溶解。

1.3.3 蛋白定量

利用Bradford方法進(jìn)行蛋白濃度定量(Bradford，1976)。

1.4 膠條選擇

選用兩種IPG膠條：IPG膠條(17 cm，pH 3-10，非線性)和IPG膠條(17 cm，pH5-8，線性)。

1.5 雙向凝膠電泳

1.5.1 第一向等點(diǎn)聚焦

在-20℃冰箱中取出水化上樣緩沖液(7 M尿素, 4%CHAPS，0.001%溴酚蘭，1% DTT/1.3% DTT，0.2% Bio-lyte)(DTT、Bio-lyte為用前加)溶解；取出蛋白樣品冰上溶解后，4℃ 15000 g離心10 min；將水化上樣緩沖液與樣品以1∶4混合作為上樣液；取出IPG膠條，室溫溶解10 min；將上樣液緩慢加入聚焦槽中，去除膠條保護(hù)膜，膠面朝下置于槽中，中間不能有氣泡；滴加礦物油覆蓋后置于雙電電泳儀中，設(shè)定程序I(50 V主動(dòng)水化16 h；250 V除鹽30 min，線性；1000 V除鹽30 min，線性；8000 V升壓3 h，線性；8000 V聚焦83000 Vh，線性；500 V保持24 h)程序II(50 V主動(dòng)水化14 h；250 V除鹽30 min，500 V除鹽30 min，線性；1000 V除鹽30 min，線性；8000 V升壓3 h，線性；8000 V聚焦75000 Vh，線性；500 V保持24 h)；聚焦結(jié)束的膠條若不立即進(jìn)行第二向電泳，則置于樣品水花盤中，-20℃保存。

1.5.2 IPG膠條平衡和第二向SDS-PAGE電泳

組裝灌膠模具，配制12.5%丙烯酰胺凝膠灌入已組裝好的模具中，上部留1.5 cm左右的空間，用異丙醇封層；取出膠條使其溶解，用電泳緩沖液洗掉膠條表面礦物油，濕濾紙吸干多余液體；在水化盤中用膠條平衡緩沖液I(0.375 M Tris-Hcl(pH8.8)，6 M尿素，2% SDS，20% 甘油，2% DTT/2.3% DTT)浸沒膠條并且震蕩15 min；膠條取出用電泳緩沖液洗凈后置于膠條平衡緩沖液II(0.375 M Tris-Hcl(pH 8.8)，6 M尿素，20%甘油，2% SDS，2.5%碘乙酰胺/2.9%碘乙酰胺)中浸沒震蕩15 min；結(jié)束后取出膠條，用電泳緩沖液洗凈膠條，并用濕濾紙吸盡多余液體。

將膠條推入電泳模具使之與膠面完全貼合，在上方加入1-2 mL封膠液(0.5%低熔點(diǎn)瓊脂糖，0.001%溴酚蘭，1×電泳緩沖液)；5 min后將其轉(zhuǎn)入垂直電泳儀中，加入緩沖液設(shè)置程序(15 μA/根，30 min；25 μA/根,溴酚藍(lán)到達(dá)底部邊緣)；電泳結(jié)束后，撬開玻璃板，取出凝膠板，切角做標(biāo)記。

1.5.3 染色

將凝膠置于固定液(40%乙醇，10%醋酸)中在搖床上震蕩4 h(速度適中)；取出凝膠置于染色液((NH4)2SO48%，CBB G-250 0.08%，85%磷酸 1.6%，無水甲醇20%)中，震蕩12 h;利用脫色液(乙醇23.75%，冰醋酸8%)將染好的膠脫色至背景干凈。

1.5.4 掃描及圖片分析

利用PowerLook 2100XL-USB彩色掃描儀掃描；每種方法進(jìn)行三次重復(fù)，然后利用PDQuest 2-D Analysis Software計(jì)算蛋白點(diǎn)數(shù)，用GraphPad Prism 5進(jìn)行蛋白點(diǎn)數(shù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同等點(diǎn)聚焦程序

粘蟲中腸蛋白經(jīng)過不同的等點(diǎn)聚焦程序得到的2-DE圖譜如圖1所示，其中圖A為程序I得到的結(jié)果，而圖B為程序II得到的結(jié)果。程序I聚焦到了83000 Vh，圖A中的橫條紋與縱條紋較為嚴(yán)重，而且堿性端的蛋白點(diǎn)幾乎沒有成功分離，分子量在40 kDa-100 kDa蛋白點(diǎn)橫向拖尾較為嚴(yán)重。程序II聚焦到75000 Vh，與圖A相對(duì)比，圖B的質(zhì)量明顯提高，橫縱條紋減少了許多，堿性端可以看到成功分離的蛋白點(diǎn)，而且蛋白點(diǎn)的拖尾也有所改善。這說明聚焦到75000 Vh已經(jīng)可以較好地分離蛋白點(diǎn)，到83000 Vh非但沒有改善堿性端蛋白點(diǎn)圖譜不清晰的問題，過度聚焦反而增加了橫縱條紋。當(dāng)然在這其中，程序II增加了500 V除鹽的步驟，這也改善了鹽離子對(duì)圖譜的影響。如圖2所示，不同的程序分別得到了1084個(gè)和1365個(gè)蛋白點(diǎn)，程序II的蛋白點(diǎn)明顯多于程序I，進(jìn)一步證實(shí)了程序II要優(yōu)于程序I。

圖1 不同電泳條件的2-DE圖譜Fig.1 The 2-DE maps of different electrophoretic programs注：A，系統(tǒng)I；B，系統(tǒng)II。Note: A, program I; B, program II.

圖2 不同電泳條件的蛋白點(diǎn)數(shù)Fig.2 Protein spots number of different electrophoretic programs

圖3 不同DTT濃度的2-DE圖譜Fig.3 2-DE maps of different DTT concentration注：A，DTT濃度I(上樣緩沖液中為1%，平衡緩沖液中為2%)；B，DTT濃度II(上樣緩沖液中為1.3%，平衡緩沖液中為2.3%。Note: A, concentration I (1% DTT in loading buffer and 2% DTT in equilibration buffer);B, concentration II (1.3% DTT in loading buffer and 2.3% DTT in equilibration buffer).

2.2 不同濃度DTT

如圖3所示，得到的2-DE圖譜為在進(jìn)行雙向電泳時(shí)使用含不同濃度DTT,圖A為濃度I(在上樣緩沖液中為1%，在平衡緩沖液中為2%),圖B為濃度II(在上樣緩沖液中為1.3%，在平衡緩沖液中為2.3%)。圖A的電泳圖明顯好于圖B，圖A的酸性端蛋白點(diǎn)沒有發(fā)生圖B中的拖尾現(xiàn)象，堿性端的蛋白點(diǎn)也較為清晰，而且圖B的背景中條紋影響嚴(yán)重。這說明雖然DTT有利于得到更好的圖譜，但是僅增加DTT濃度不能使圖譜更清晰，即DTT的使用不能過量。如圖4，對(duì)圖譜分析后兩張圖分別檢測到了1218個(gè)和1059個(gè)蛋白點(diǎn)，這也說明了高濃度DTT并未使2-DE圖譜質(zhì)量提高。

圖4 不同DTT濃度的蛋白點(diǎn)數(shù)Fig.4 Protein spots number of different DTT concentration

2.3 不同PH梯度的IPG膠條

使用不同的IPG膠條得到了如圖5所示結(jié)果，其中圖A為PH 3-10的非線性膠條，圖B為PH 5-8的線性膠條。圖B中的蛋白點(diǎn)分布要更加均勻，背景更加清晰，圖譜上沒有大面積未分離的蛋白點(diǎn)。而圖A中的酸性端蛋白點(diǎn)分離的較為理想，但堿性端蛋白并未完全分離開來，圖中的橫條紋較多，背景色也較重。從圖A可以看出，蛋白分布基本上都在pH 4-8，更為重要的是在圖B中，高豐度蛋白分離的同時(shí)，低豐度蛋白也顯現(xiàn)的較多，而研究較多的往往是低豐度蛋白，所以對(duì)于粘蟲中腸蛋白而言，選取pH 5-8的膠條更為合適。如圖6，這2張圖譜分別得到了1428個(gè)和1384個(gè)蛋白點(diǎn)，雖然pH 3-10圖譜中的蛋白點(diǎn)比圖pH 5-8的多，但后者的低豐度蛋白較多，說明要優(yōu)先選取pH 5-8的膠條。

圖5 不同PH條件下IPG膠條的2-DE圖譜Fig.5 2-DE maps of IPG strips in different PH注：A，pH 3-10,非線性；B，pH 5-8，線性。Note: A: pH 3-10, L；B: pH 5-8, NL.

圖6 不同PH膠條的蛋白點(diǎn)數(shù)Fig.6 Protein spots number of IPG strips in different pH

2.4 不同蛋白提取方法

利用磷酸抽提法和Tris-飽和酚法提取粘蟲中腸的提取率有明顯不同，前者的提取率較低，為4.4574 μg/uL，而后者提取率則較高，為6.5674 μg/uL，利用SPSS 19.0進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，結(jié)果(如圖7)表明兩種蛋白質(zhì)提取方法存在極顯著性差異(P<0.01)。

圖7 不同提取方法的蛋白質(zhì)提取率Fig.7 The rate of protein in extraction from differentethods

兩種蛋白質(zhì)提取方法分別得到了如圖8所示的2-DE圖譜。2張圖譜蛋白點(diǎn)分離的都較為均勻，蛋白點(diǎn)沒有拖尾現(xiàn)象，凝膠背景較為清晰，沒有明顯的橫縱條紋，也有較多的低豐度蛋白，但是圖B中的高豐度蛋白比圖A中的清晰。如圖9，Tris-飽和酚法圖譜的蛋白點(diǎn)明顯多于磷酸抽提法圖譜，經(jīng)過分析，2張圖譜蛋白點(diǎn)分別為1308個(gè)和1569個(gè)，表明Tris-飽和酚法提取的蛋白質(zhì)種類明顯多于磷酸抽提法提取的蛋白質(zhì)。

圖8 不同蛋白質(zhì)提取方法的2-DE圖譜Fig.8 2-DE maps of different protein extraction methods注：A，磷酸抽提法；B，Tris-飽和酚法。Note: A, extract with phosphate buffer; B, Tris-saturated phenol law.

圖9 不同蛋白質(zhì)提取方法的蛋白點(diǎn)數(shù)Fig.9 Protein spots number of different protein extraction methods

3 結(jié)論與討論

3.1 不同等電聚焦程序?qū)﹄p向電泳結(jié)果的影響

等點(diǎn)聚焦程序直接影響到2-DE圖譜的分辨率和重復(fù)性，不合適的聚焦程序會(huì)導(dǎo)致圖譜中出現(xiàn)橫縱條紋，蛋白點(diǎn)拖尾，不規(guī)則蛋白點(diǎn)等現(xiàn)象。如果聚焦不完全，會(huì)出現(xiàn)橫條紋，但若過度聚焦，則會(huì)出現(xiàn)蛋白飄移和電滲現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)中程序I聚焦到了83000 Vh，程序II聚焦到了75000 Vh 。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看過高的聚焦電壓得到2-DE圖譜反而不如低聚焦電壓，這可能是低的聚焦電壓延長了聚焦時(shí)間，反而使得堿性端蛋白有了一定的分布，所以堿性端蛋白分布效果不好的原因可能不是未聚焦完全。在程序中增加了一步500 V除鹽后，圖譜中的縱條紋減少了許多，橫條紋的減少則與較好地聚焦條件有關(guān)。

3.2 不同濃度DTT對(duì)雙向電泳結(jié)果的影響

DTT能夠打開蛋白質(zhì)中的二硫鍵，使蛋白去折疊，減少蛋白聚集(解建勛和蒲小平，2001)。在堿性條件下，DTT會(huì)干擾等點(diǎn)聚焦PH梯度，DTT帶有負(fù)電荷，在等點(diǎn)聚焦過程中可能會(huì)跑出膠條，因此改變DTT濃度會(huì)改善堿性端蛋白分布。實(shí)驗(yàn)中改變了DTT濃度后，發(fā)現(xiàn)過高濃度的DTT反而使得堿性端蛋白圖譜更模糊，使得圖譜質(zhì)量下降，這說明過量使用DTT也并不能更好的分離堿性端蛋白。在今后的實(shí)驗(yàn)中可以嘗試選擇使用三正丁基膦,TBP，它的還原性要強(qiáng)于DTT，而且可以提高蛋白溶解度(Herbert，1999)，但是半衰期短，所以要慎重選擇。

3.3 不同pH梯度的IPG膠條對(duì)雙向電泳結(jié)果的影響

我們在實(shí)驗(yàn)中用了2種pH梯度的膠條，雖然pH 5-8的膠條分離的蛋白點(diǎn)相對(duì)少一點(diǎn)，但是分離到的低豐度蛋白較多，蛋白點(diǎn)分布更均勻，背景更清晰。而且從pH 3-10的膠條上可以看出來，粘蟲中腸蛋白點(diǎn)大多集中于pH 4-8的區(qū)域，所以選擇pH 5-8的膠條更好。等點(diǎn)聚焦有用于不同目的的多種pH梯度的膠條(Kasketal.，2009)，而不同pH梯度的膠條分離蛋白質(zhì)的效果不同(Zhangetal.，2004)。選擇IPG膠條需要根據(jù)目的蛋白的分布、性質(zhì)及豐度等進(jìn)行選擇，對(duì)于未知蛋白，可先使用pH范圍較寬的IPG膠條，如若不能徹底分離，則應(yīng)該使用范圍較窄的膠條。

3.4 不同蛋白提取方法對(duì)雙向電泳結(jié)果的影響

本實(shí)驗(yàn)采用了兩種方法提取粘蟲中腸蛋白：磷酸抽提法和Tris-飽和酚法。其中Tris-飽和酚法可以使鹽、核酸、色素、酚和多糖等可溶性物質(zhì)進(jìn)入水相，蛋白質(zhì)和脂類則進(jìn)入酚相(Yaoetal.，2006)，酚相中的蛋白質(zhì)通過含有乙酸銨的丙酮溶液沉淀出來。雖然Tris-飽和酚法步驟較為繁瑣，但可以去除糖和多酚，很大程度上減少了雜質(zhì)的影響，在提取含有雜質(zhì)的中腸較為合適。鐘伯雄等人建立了系統(tǒng)的磷酸抽提法提取家蠶蛋白質(zhì)(鐘伯雄等，2003)。本實(shí)驗(yàn)也利用磷酸抽提法提取了粘蟲中腸蛋白，但從蛋白點(diǎn)分布來看，提取質(zhì)量沒有Tris-飽和酚法好。本實(shí)驗(yàn)沒有用其他的一些經(jīng)典方法(TCA-丙酮法、Trizol沉淀法、Tris-丙酮-酚法等)提取中腸蛋白質(zhì)，在今后的實(shí)驗(yàn)中也可嘗試。

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Optimizing method of two-dimensional electrophoresis system of armyworm(Mythimnaseparata) midgut

AI Xian-Long,ZHANG Ya-Lin*

(College of Plant Protection, Northwest A & F University, Yangling 712100, Shaanxi Province, China)

To study the expression differences of armyworm(Mythimnaseparata) midgut proteins after different treated, we established the two-dimensional electrophoresis system for midgut proteomic analysis of armyworm by comparing the parameters including protein extraction, IPG strip, dithiothreitol(DTT) concentration and isoelectric focusing conditions.The results indicated that the proposed better system is as follows: Tris-phenol extraction method was used to extract the total protein from the midgut of armyworm, separate the proteins with pH 5-8(L) strip, with DTT concentration I and isoelectric focusing program II.After optimizing the two-dimensional electrophoresis system, the 2-DE maps are obtained with more protein spots, clearer background and higher-resolution.

Armyworm; midgut; two-dimensional electrophoresis; protein

艾賢龍，張雅林.粘蟲中腸總蛋白質(zhì)雙向電泳體系的優(yōu)化方法[J].環(huán)境昆蟲學(xué)報(bào)，2017,39(3):548-555.

國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(200903052)；陜西省“13115”科技創(chuàng)新工程重大科技專項(xiàng)項(xiàng)目(2007ZDKG-14)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(Z109021514)

艾賢龍，男，碩士研究生，研究方向?yàn)橘Y源昆蟲和昆蟲毒理學(xué)，E-mail:ai212sc@126.com

*通訊作者Author for correspondence，E-mail:yalinzh@nwsuaf.edu.cn

Received：2016-03-18；接受日期Accepted：2016-04-13

Q966；S433.4

A

1674-0858(2017)03-548-08