劉宏飛 陳春悠 陸?zhàn)〇|

華北理工大學研究生學院 河北唐山 063000;①唐山工人醫(yī)院頭頸外科;②華北理工大學口腔醫(yī)學院

MCM7、SKP2和P27蛋白在甲狀腺乳頭狀癌中的表達及其臨床意義

劉宏飛 陳春悠①陸?zhàn)〇|②

華北理工大學研究生學院 河北唐山 063000;①唐山工人醫(yī)院頭頸外科;②華北理工大學口腔醫(yī)學院

①目的 探討微小染色體維持蛋白7(Minichromosome maintenance protein7，MCM7)、S期激酶相關蛋白2(S-phase kinase associated protein 2，SKP2)和細胞周期素依賴性激酶抑制蛋白P27(cyclin dependent kinase inhibited protein，P27)在甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)中的表達及其臨床病理特征之間的關系。②方法 采用免疫組織化學S-P法檢測MCM7、SKP2和P27蛋白在50例甲狀腺乳頭狀癌、30例結(jié)節(jié)性甲狀腺腫、30例甲狀腺腺瘤及20例正常甲狀腺組織中的表達。③結(jié)果 甲狀腺乳頭狀癌組織中MCM7、SKP2蛋白的陽性表達率均顯著高于結(jié)節(jié)性甲狀腺腫、甲狀腺腺瘤及正常甲狀腺組織。甲狀腺乳頭狀癌中P27蛋白的陽性表達率顯著低于結(jié)節(jié)性甲狀腺腫、甲狀腺腺瘤及正常甲狀腺組織。MCM7與P27蛋白的表達、SKP2與P27蛋白的表達均呈負相關。④結(jié)論 MCM7、SKP2及P27蛋白與甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生和發(fā)展起著重要的作用，且MCM7、SKP2蛋白對于淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移方面可能有鑒別意義。在臨床上將MCM7、SKP2及P27蛋白聯(lián)合檢測，對于提高術(shù)前診斷的準確性及判斷淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移情況可能有一定的作用。

甲狀腺乳頭狀癌 MCM7蛋白 SKP2蛋白 P27蛋白

甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤[1]，其主要組織學類型為甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid cancer，PTC)，約占85%。腫瘤的發(fā)生與細胞周期密切相關，尤其是G1期向S期的過渡期，起著十分重要的作用。本研究采用免疫組化S-P法檢測G1向S期過渡時細胞周期調(diào)控因子微小染色體維持蛋白(MCM7)、S期激酶相關蛋白(SKP2)及細胞周期素依賴性激酶抑制蛋白P27(P27)蛋白在PTC中的表達及其與PTC臨床病理特征之間的關系，從而探討三者在PTC中的表達及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集工人醫(yī)院病理科2014年6月～2015年12月間經(jīng)外科手術(shù)切除的甲狀腺病變組織130例，所有病例在術(shù)前均未經(jīng)過放療、化療等輔助治療，且病案資料完整。

收集的標本按照WHO甲狀腺腫瘤的分類標準進行分類。其中PTC50例，結(jié)節(jié)性甲狀腺腫30例，甲狀腺腺瘤30例，正常甲狀腺組織20例。正常組織選取結(jié)節(jié)性甲狀腺腫周圍1cm以外的組織。50例PTC組中：女41例，男9例；≥45歲者14例，<45歲者36例；腫瘤直徑>1cm者17例，≤1cm者33例；單發(fā)病灶者37例，多發(fā)病灶13例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者35例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者15例。

1.2 主要試劑 兔抗人MCM7多抗；兔抗人SKP2多抗；兔抗人P27多抗。均購自北京博奧森生物科技有限公司。

1.3 方法 采用Evision免疫組化法，按試劑盒說明書進行實驗步驟，用已知的胃癌MCM7陽性切片、已知的肝癌SKP2陽性切片以及已知的喉癌P27陽性切片作為陽性對照，用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。

1.4 結(jié)果判定 參考Bukholm[2]、許良中[3]等人的標準進行結(jié)果判定：由2位經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)師在不知情的情況下，每張切片在高倍鏡下(400倍)隨機選擇5個視野分析，每個視野至少計數(shù)100個細胞，取其平均值。3種蛋白陽性表達計數(shù)均根據(jù)細胞核著色情況對染色強度進行評估分級，即：未著色為0分；淺棕色為1分；棕色為2分；深棕色為3分。同時根據(jù)陽性細胞的百分率分為5級：陽性細胞數(shù)占9%以下為0分，陽性細胞10%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～74%為3分，>75%為4分。每一病例的染色強度與陽性細胞數(shù)乘積0分者為(-)，指不表達;1～3分者為(+)，低表達;4～8分者為()，中度表達；9～12分者為()，強表達。0分為表達陰性，1～12分為表達陽性。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行χ2檢驗以及spearman等級相關分析。

2 結(jié)果

2.1 不同甲狀腺組織中MCM7、SKP2及P27蛋白的陽性數(shù)及陽性表達率比較 PTC中MCM7、SKP2蛋白的陽性表達率分別為72%(36/50)、70%(35/50)，明顯高于結(jié)節(jié)性甲狀腺腫、甲狀腺腺瘤及正常甲狀腺組織。PTC中P27蛋白的陽性表達率為14%(7/50)，明顯低于結(jié)節(jié)性甲狀腺腫、甲狀腺腺瘤及正常甲狀腺組織。三者在PTC組與結(jié)節(jié)性甲狀腺組、PTC組與甲狀腺腺瘤組、PTC組與正常組織之間的蛋白表達差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

2.2 PTC中MCM7、SKP2及P27蛋白與臨床病理參數(shù)之間的關系 PTC中MCM7、SKP2蛋白表達與患者的性別、年齡、腫瘤直徑及病灶數(shù)之間的陽性表達率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。PTC中P27蛋白表達與患者的性別、年齡、腫瘤直徑、病灶數(shù)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的陽性表達率比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

2.3 PTC中MCM7、SKP2與P27蛋白表達之間的相互關系 PTC中MCM7、SKP2與P27蛋白的表達均呈負相關(r1=-0.323，P<0.05;r2=-0.302，P<0.05)，見表3。

表1 不同甲狀腺組織中MCM7、SKP2及P27蛋白陽性數(shù)及表達率的比較

注：*PTC組與結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組間比較， **PTC組與腺瘤組比較， ***PTC組與正常組間比較

表2 PTC中MCM7、SKP2、P27蛋白表達與臨床病理參數(shù)的比較

表3 PTC中P27與MCM7、SKP2蛋白表達之間的相關性

注：r1=-0.323;r2=-0.302

3 討論

由細胞周期失調(diào)引起的異常細胞增殖是腫瘤發(fā)生的基礎[4]。G1早期,MCMs、起始識別復合物(oringin recognization complex,ORC)、細胞分裂蛋白6(CDC6)等復制起始因子與復制子有序的結(jié)合,形成前復制復合體(pre-RC);G1期到S期,經(jīng)CDC7/DBF4激活pre-RC后再活化MCMs,激活的MCMs具有DNA解鏈酶活性,最終啟動DNA復制[5]。MCM7決定染色體復制能力的大小，正常細胞中MCMs蛋白的表達在G1/S轉(zhuǎn)換時達峰值,在Go期細胞和分化、衰老的細胞中,MCMs蛋白表達水平下降。因此,MCMs蛋白的水平隨細胞增殖、生長能力的增強而升高[6]。P27被認為是一種腫瘤抑制基因,作為細胞周期的負性調(diào)控因子參與細胞周期調(diào)控,抑制細胞的惡性轉(zhuǎn)化及異常增殖、分化,延緩惡性腫瘤的進程[7]。MCM7的保守結(jié)構(gòu)域與P27基因的羧基末端結(jié)構(gòu)域相結(jié)合后,使DNA的復制受抑,誘導細胞停止于G1期,說明P27可以負性調(diào)控MCM7。在細胞周期中,若存在P27的表達下調(diào),將有可能導致MCM7的表達上調(diào),從而可以過度發(fā)揮其在DNA復制期間的作用,促進腫瘤的發(fā)生[8]。SKP2是細胞從G1期進入S期的必需因子，主要通過泛素蛋白酶體途徑(UPP)來參與細胞周期調(diào)控因子的降解，P27即是主要通過此途徑造成從G1期開始被SKP2泛素化降解，表達下調(diào),使P27對細胞周期的抑制作用減弱,細胞不斷增殖,最終導致腫瘤形成[9]。

近年來，國內(nèi)外大量研究表明，MCM7、SKP2及P27蛋白與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。但未見三者聯(lián)合報道。Choy B[10]等證實MCM4，MCM7和Ki-67表達的平均百分比從鱗狀上皮增加到柱狀細胞化生，Barrett食管，高度異型增生，腺癌，低級別發(fā)育不良和鱗狀細胞癌顯著增高，且MCM4和MCM7表達的百分比顯著高于Ki-67表達。此外該文章還證實MCM4和MCM7表達的百分比將與食管癌和癌前病變中的Ki-67，Bmi1和細胞周期蛋白E表達顯著相關。MCM4和MCM7可以作為更敏感的增殖標記物用于評估食管的損傷。國內(nèi)陳軍[11]等采用免疫組化法檢測MCM7和P27在胃癌組織中的表達及其意義，結(jié)果顯示：MCM7 和P27 蛋白在正常胃黏膜、低級別非典型增生和胃癌組織中的表達之間差異有統(tǒng)計學意義；且胃癌組織中MCM7和P27蛋白的標記指數(shù)表達呈顯著負相關。說明MCM7蛋白的高表達和P27蛋白的低表達與胃癌的發(fā)生及發(fā)展密切相關, 檢測MCM7和P27蛋白有助于判斷胃癌惡性程度及預后。葉勁軍等[12]采用免疫組化法檢測SKP2和P27蛋白在食管癌和癌旁組織中的陽性表達率，差異有統(tǒng)計學意義。且SKP2、P27蛋白表達呈負相關關系。證明SKP2和P27參與正常食管組織向食管癌的演變，可能與食管癌的發(fā)生和發(fā)展有關。任占平[13]等采用免疫組化法檢測MCM7及P27蛋白在正常子宮內(nèi)膜、內(nèi)膜增生、非典型性增生到子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中的陽性表達水平，P27呈逐漸下降趨勢;而MCM7陽性表達水平呈逐漸上升趨勢。子宮內(nèi)膜樣腺癌組中P27與MCM7蛋白的表達呈負相關,P27蛋白低表達與組織學分級及手術(shù)病理分期有關，MCM7蛋白的高表達與組織學分級、肌層浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和手術(shù)病理分期有關;P27低表達和MCM7的高表達與腫瘤的復發(fā)有關。P27蛋白的表達缺失和MCM7的高表達可能涉及子宮內(nèi)膜樣腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程, 兩者的聯(lián)合檢測可作為臨床早期診斷、評價預后的生物學指標。本實驗結(jié)果總體與前人的研究結(jié)論相似，但由于樣本量有限，且未能對PTC進行TNM分期的比較，需進一步做大樣本實驗進行分析比較。

本實驗結(jié)果顯示：PTC組織中MCM7、SKP2蛋白的陽性表達率均顯著高于結(jié)節(jié)性甲狀腺腫、甲狀腺腺瘤及正常甲狀腺組織。PTC中P27蛋白的陽性表達率顯著低于結(jié)節(jié)性甲狀腺腫、甲狀腺腺瘤及正常甲狀腺組織。三者在PTC組與結(jié)節(jié)性甲狀腺組、PTC組與甲狀腺腺瘤組、PTC組與正常組織之間的蛋白表達均存在明顯的差異性。該結(jié)論說明MCM7、SKP2蛋白的高表達以及P27蛋白的低表達與PTC的發(fā)生、發(fā)展過程有關。另外本研究還發(fā)現(xiàn)MCM7、SKP2蛋白與PTC中淋巴結(jié)的陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義，說明二者在評估PTC患者有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況中可能有鑒別意義。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)MCM7與P27蛋白的表達、SKP2與P27蛋白的表達均呈負相關。表明MCM7及SKP2蛋白在PTC的發(fā)生、發(fā)展中行使正性調(diào)控作用，且二者可能是通過降解或下調(diào)P27蛋白來發(fā)揮其促腫瘤作用。

總之，MCM7、SKP2及P27蛋白在PTC的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用，且MCM7、SKP2蛋白對于淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移方面可能有鑒別意義。在臨床上將MCM7、SKP2及P27蛋白聯(lián)合檢測，對于提高術(shù)前診斷的準確性及判斷淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移情況方面可能有一定的作用。

[1] Farrokhi Y R,Rezaie T M,Arefi O A,et al.The metabolomics and lipidomics window into thyroid cancer research[J].Biomarkers Biochemical Indicators of Exposure Response & Susceptibility to Chemicals,2016:1-19

[2] Bukholm I R,Bukholm G,Holm R,et al.Association between histology grade,expression of HsMCM2,and cyclin A in human invasive breast carcinoma[J].J Clin pathol,2003,56(5):368-373

[3] 許良中,楊文濤.免疫組織化學反應結(jié)果的判斷標準[J].中國癌癥雜志, 1996，6(4):229-231

[4] Gambichler T,Bischoff S,Bechara F G,et al.Expression of proliferation markers and cell cycle regulators in T cell lymphoproliferative skin disorders[J].Journal of Dermatological Science,2008,49(2):125-132

[5] Aparicio T,Megias D,Mendez J.Visualization of the MCM DNA helicase at replication factories before the onset of DNA synthesis[J].Chromosoma，2012,121(5):499-507

[6] Aparicio T,Megias D,Mendez J.Visualization of the MCM DNA helicase at replication factories before the onset of DNA synthesis[J].Chromosoma,2012,121(5):499-507

[7] 柴大敏,鮑正齊,胡建國,等.喉鱗狀細胞癌中細胞周期蛋白E和p27異常表達的臨床意義[J].臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志,2014(3):165-169

[8] 林海瑞.MCM7、Skp2、p27、Rb在子宮頸上皮內(nèi)瘤變及鱗狀細胞癌中的表達及意義[D].天津：天津醫(yī)科大學,2014

[9] 羅四維,彭先兵,張 群,等.Skp2結(jié)構(gòu)與腫瘤關系研究進展[J].中華實用診斷與治療雜志,2010,24(2):110-112

[10] Choy B,Lalonde A,Que J,et al.MCM4 and MCM7,Potential novel proliferation markers,significantly correlated with Ki67,Bmi1,and Cyclin E expression in esophageal adenocarcinoma,squamous cell carcinoma,and precancerous lesions[J].Human Pathology,2016,57:126-135

[11] 陳 軍,曹 驥,覃思繁.胃癌組織MCM7和p27蛋白表達及其臨床意義的探討[J].中華腫瘤防治雜志,2010,17(21):1755-1757

[12] 葉勁軍,費春明,周國仁,等.食管癌組織中Skp2和p27的表達及臨床意義[J].臨床腫瘤學雜志,2015,(7):615-619

[13] 任占平,石 喆,張 芫.子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中p27、MCM7蛋白的表達及意義[J].腫瘤防治研究, 2011,38(1):73-76

(2017-01-09 收稿)(庫雪飛 編輯)

The expression and significance of MCM7、SKP2 and P27 in papillary thyroid carcinoma

LIU Hongfei,CHEN Chunyou,LU Haodong

(North China University of Science and Technology,Tangshan 063000, China)

Objective To explore the expression and significance of MCM7、SKP2 and P27 protein in papillary thyroid carcinoma.Method Detected 50 cases of PTC patients,30 cases of thyroid nodular goiter patients,30 cases of thyroid adenoma patients and 20 cases of normal thyroid patients with immunohistochemical SP method.Results The positive expression rate of MCM7、SKP2 protein in PTC patients were significantly higher than those of thyroid nodular goiter patients,thyroid adenoma patients and normal thyroid patients.The positive expression of P27 protein in papillary thyroid carcinoma patients was significantly lower than those of nodular goiter patients,thyroid adenoma patients and normal thyroid patients.The expression level of P27 protein was negatively correlated with MCM7 and SKP2 protein in papillary thyroid carcinoma patients.Conclusion MCM7,SKP2 and P27 protein play an important role in the development and progression of papillary thyroid carcinoma.MCM7 and SKP2 protein have unique significance in lymph node metastasis. Clinically, the combination of MCM7, SKP2 and P27 protein can improve the accuracy of preoperative diagnosis and determine the lymph node metastasis.

Papillary thyroid carcinoma.MCM7 protein.SKP2 protein.P27 protein

劉宏飛(1990-)，女，碩士研究生。研究方向：頭頸部腫瘤。

陳春悠。

R 581

A

2095-2694(2017)04-295-05