高勝華

中國石化中原油田分公司技術(shù)監(jiān)測中心化工產(chǎn)品監(jiān)測總站（河南濮陽457001）

殺菌劑室內(nèi)空白菌量檢測方法研究

高勝華

中國石化中原油田分公司技術(shù)監(jiān)測中心化工產(chǎn)品監(jiān)測總站（河南濮陽457001）

在依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)Q/SH 0355—2010《油田采出水處理用殺菌劑技術(shù)要求》對殺菌劑產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行檢測時，采出水空白菌量室內(nèi)培養(yǎng)及計數(shù)是檢測的重要環(huán)節(jié)。分析了培養(yǎng)基加入量、培養(yǎng)時間及培養(yǎng)溫度對培養(yǎng)空白細(xì)菌菌量的影響，優(yōu)化選擇培養(yǎng)基體積分?jǐn)?shù)為0.20%、培養(yǎng)溫度為（40±5）℃、培養(yǎng)時間為36h，作為培養(yǎng)空白菌量最佳實驗條件。針對不同標(biāo)準(zhǔn)對菌量計數(shù)方法的不同要求而導(dǎo)致的結(jié)果偏差問題，從理論和實驗角度進(jìn)行分析驗證，通過對空白菌量室內(nèi)檢測及計數(shù)的方法優(yōu)化，確定絕跡稀釋法為最合理計數(shù)方法，從而提高了室內(nèi)殺菌效果檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和時效性，對油田用殺菌劑的質(zhì)量檢測工作有一定的指導(dǎo)意義。

殺菌劑；室內(nèi)殺菌效果；細(xì)菌培養(yǎng)；絕跡稀釋法

油田采出水中含有大量的有機(jī)質(zhì)且含氧量低，為細(xì)菌特別是厭氧菌的繁殖生長提供了有利條件，其中危害最大的是硫酸鹽還原菌（SRB）、腐生菌（TGB）、鐵細(xì)菌（FB），細(xì)菌在注水系統(tǒng)中大量繁殖，危害水質(zhì)、造成腐蝕、堵塞油層，給油田生產(chǎn)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[1-3]，這就需要在水體中加入一定量的殺菌劑進(jìn)行預(yù)處理。殺菌劑通過影響細(xì)菌正常的新陳代謝而起殺菌作用，是一種能殺死或抑制各種微生物的化學(xué)產(chǎn)品藥劑[4-6]。因此準(zhǔn)確及時地檢測控制殺菌劑質(zhì)量至關(guān)重要。

室內(nèi)殺菌效果是評價殺菌劑質(zhì)量的一項重要指標(biāo)，現(xiàn)行的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和各油田企業(yè)內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)大多采用絕跡稀釋法[7-8]來評價室內(nèi)殺菌效果，中原油田采用標(biāo)準(zhǔn)Q/SH 0355—2010《油田采出水處理用殺菌劑技術(shù)要求》檢測殺菌劑室內(nèi)殺菌效果。標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，取回的水樣若因故放置超出24h，這就需要向水樣中加入營養(yǎng)基進(jìn)行空白細(xì)菌培養(yǎng)，在實際檢測工作中發(fā)現(xiàn)：①由于選擇不同實驗條件，培養(yǎng)出的細(xì)菌菌量不同，造成殺菌效果檢測結(jié)果出現(xiàn)偏差，影響室內(nèi)殺菌效果的評價；②標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定采用2次重復(fù)法進(jìn)行空白實驗，不同的檢測人員對多組測試瓶細(xì)菌計數(shù)采用的方法不同及確定成長指數(shù)的原則理解層次偏差，造成細(xì)菌計量的差異，影響室內(nèi)殺菌效果的判斷[9]。因此，優(yōu)化培養(yǎng)采出水空白菌量的室內(nèi)評價及計數(shù)方法，能夠進(jìn)一步提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，減少實驗的重復(fù)性，及時準(zhǔn)確地評價殺菌劑質(zhì)量[10]。

1 實驗部分

1.1 儀器及材料

DHP—9272型恒溫培養(yǎng)箱、電熱壓力蒸汽消毒器、細(xì)菌培養(yǎng)瓶（SRB）、1 mL一次性滅菌注射器、350 mL玻璃菌瓶。

1.2 實驗用水樣的要求

1）實驗用水樣取自污水站未經(jīng)殺菌劑處理的水。

2）水樣應(yīng)在采集后24h之內(nèi)盡快進(jìn)行殺菌效果實驗。如因故不能在24h內(nèi)回到實驗室進(jìn)行檢驗，則在水樣中加入營養(yǎng)基培養(yǎng)24～72h進(jìn)行測試，營養(yǎng)基加入量推薦為0.1%～0.2%，污水中細(xì)菌的最佳生長溫度一般為30～50℃。

1.3 實驗步驟

1）空白實驗采用2次重復(fù)法。

2）抽取空白水樣于密閉玻璃菌瓶中，抽取的水量滿足實驗要求，放入恒溫培養(yǎng)箱選擇所需的培養(yǎng)溫度進(jìn)行培養(yǎng)。

3）培養(yǎng)一定時間后，將10個細(xì)菌培養(yǎng)瓶排成一組并依次編號，用一次性滅菌注射器取空白水樣1.0mL注入1#培養(yǎng)瓶，充分震蕩，再從1#培養(yǎng)瓶抽取1.0mL水樣注入2#培養(yǎng)瓶中，依次類推，直至稀釋到第10個培養(yǎng)瓶為止，同理再做一組。

4）將實驗培養(yǎng)瓶放置于恒溫培養(yǎng)箱，恒溫培養(yǎng)7天后，觀察細(xì)菌瓶中細(xì)菌生長的情況，根據(jù)細(xì)菌生長情況和稀釋倍數(shù)，計算出水樣中細(xì)菌的數(shù)目。

2 結(jié)果與討論

2.1 水樣放置時間對菌量的影響

取回的現(xiàn)場采出水隨著放置時間的延長，水中的細(xì)菌量不斷變化。放置時間越長，水中環(huán)境的改變導(dǎo)致細(xì)菌量變化較大見表1。尤其是溫度的影響，當(dāng)溫度高于水中細(xì)菌生長的適宜溫度，會導(dǎo)致細(xì)菌死亡；當(dāng)溫度低于適宜溫度，會抑制細(xì)菌的生長甚至死亡。因此從現(xiàn)場取回的水樣要在30～50℃環(huán)境中放置，并盡快在24h內(nèi)檢測，如果放置時間超過24h，應(yīng)加入培養(yǎng)基在適宜的條件下進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)。

表1 水樣放置時間對SRB細(xì)菌影響數(shù)據(jù)統(tǒng)計表/(個·mL-1)

2.2 溫度對實驗室培養(yǎng)細(xì)菌的影響

取現(xiàn)場水配制體積分?jǐn)?shù)為0.2%SRB培養(yǎng)基，根據(jù)污水中細(xì)菌的最佳生長溫度為30～50℃，選取30、35、40、45、50℃進(jìn)行絕跡細(xì)菌培養(yǎng)，統(tǒng)計數(shù)據(jù)見表2。

表2 溫度對實驗室培養(yǎng)SRB細(xì)菌影響數(shù)據(jù)統(tǒng)計/(個·mL-1)

由表2看出：在溫度30～50℃之間進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，隨著溫度的變化，細(xì)菌的生長菌量趨于穩(wěn)定。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)Q/SH 0355—2010《油田采出水處理用殺菌劑技術(shù)要求》對水溫的要求，選擇（40±5）℃為培養(yǎng)細(xì)菌的最佳培養(yǎng)溫度。如現(xiàn)場施工對溫度有要求，則優(yōu)選現(xiàn)場溫度進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)。

因此，在冬季取水樣過程中要對水樣瓶進(jìn)行適當(dāng)保溫，改進(jìn)取水樣裝置，在水樣瓶的外壁裹了一層橡塑板，用以保溫，并用不透明非活性玻璃瓶代替以往的塑料桶，防止水樣中細(xì)菌吸附，減少了檢測誤差。

2.3 培養(yǎng)時間對細(xì)菌菌量的影響

由表2看出隨著培養(yǎng)時間的延長，細(xì)菌菌量不斷增大。當(dāng)培養(yǎng)時間在36h時，產(chǎn)生的細(xì)菌數(shù)量滿足標(biāo)準(zhǔn)對空白的要求。同時檢測1個殺菌劑樣品需要7天時間，培養(yǎng)時間過長勢必會影響檢測效率，造成人力、物力的浪費，因此選擇最佳培養(yǎng)時間為36h。

2.4 培養(yǎng)基的加入量對細(xì)菌菌量的影響

在加入的培養(yǎng)基濃度很低情況下，培養(yǎng)基濃度影響細(xì)菌的生長速度，隨著培養(yǎng)基濃度的提高，生長速度趨于穩(wěn)定；進(jìn)一步提高培養(yǎng)基濃度，生長菌量增大，而且隨著培養(yǎng)基濃度過大會發(fā)生菌體菌量富集程度過高現(xiàn)象[11]。

將6個350 mL的玻璃菌瓶，用采出水配制體積分?jǐn)?shù)為0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、0.50% SRB培養(yǎng)基，將實驗培養(yǎng)瓶放入恒溫箱中，在45℃情況下恒溫36h，用絕跡稀釋法檢測0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、0.50%SRB細(xì)菌培養(yǎng)，7天后讀取細(xì)菌的生長個數(shù)（表3）。

表3 實驗室培養(yǎng)SRB細(xì)菌生長數(shù)據(jù)統(tǒng)計

由表3可以看出：當(dāng)加入的培養(yǎng)基的體積分?jǐn)?shù)為0.15%時，細(xì)菌的菌量就能滿足標(biāo)準(zhǔn)對空白菌量的要求，采出水處于隨時變化中，因此應(yīng)放寬一個級別，選擇體積分?jǐn)?shù)為0.20%。

2.5 選擇合理菌量計數(shù)方法

細(xì)菌培養(yǎng)7天后讀取細(xì)菌的生長個數(shù)，目前有兩種方法計算細(xì)菌菌量，第1種方法是標(biāo)準(zhǔn)Q/SH 0355—2010《油田采出水處理用殺菌劑技術(shù)要求》中推薦的“菌量計數(shù)按SY/T 5329—2012中5.6.5條規(guī)定讀數(shù)”；第2種方法是根據(jù)SY/T 0532—2012《油田注入水細(xì)菌分析方法絕跡稀釋法》進(jìn)行多組測試瓶細(xì)菌計數(shù)，現(xiàn)對兩種方法進(jìn)行現(xiàn)場試驗分析，具體見表4～表5。

表4 1701#污水細(xì)菌生長情況（二次重復(fù)法）

表5 1707#污水細(xì)菌生長情況（二次重復(fù)法）

由表4看出，按第1種方法得出水樣中指數(shù)為“211”，查SY/T 5329—2012標(biāo)準(zhǔn)中二次重復(fù)法數(shù)據(jù)表得細(xì)菌數(shù)為13.0個/mL，再乘以指數(shù)第一位的稀釋倍數(shù)101，即得含菌量為130個/mL。按第2種方法得出水樣中指數(shù)為“110”，查SY/T 5329—2012標(biāo)準(zhǔn)中二次重復(fù)法數(shù)據(jù)表得細(xì)菌數(shù)為1.3個/mL，再乘以指數(shù)稀釋倍數(shù)102，即得水樣含菌量為130個/mL。結(jié)果：第1種方法與第2種方法計算的水樣細(xì)菌含量一致。

由表5看出，按第1種方法得出水樣中指數(shù)為“211”，查SY/T 5329—2012標(biāo)準(zhǔn)中二次重復(fù)法數(shù)據(jù)表得細(xì)菌數(shù)為13.0個/mL，再乘以指數(shù)第一位的稀釋倍數(shù)101，即得水樣含菌量為130個/mL。按第2種方法得出水樣中指數(shù)為“111”，查SY/T 5329—2012標(biāo)準(zhǔn)中二次重復(fù)法數(shù)據(jù)表得細(xì)菌數(shù)為2.0個/mL，再乘以指數(shù)稀釋倍數(shù)102，即得水樣含菌量為200個/mL。結(jié)果：第1種方法與第2種方法計算的水樣細(xì)菌含量相差70個/mL。

擴(kuò)展到三次重復(fù)法計算菌數(shù)，見表6。

表6 1714#污水細(xì)菌生長情況（三次重復(fù)法）

由表6看出，按第1種方法得出水樣中指數(shù)為“320”，查SY/T 5329—2012標(biāo)準(zhǔn)中三次重復(fù)法數(shù)據(jù)表得細(xì)菌數(shù)為9.5個/mL，再乘以指數(shù)第一位的稀釋倍數(shù)101，即得水樣含菌量為95個/mL。按第2種方法得出水樣中指數(shù)為“200”，查SY/T 5329—2012標(biāo)準(zhǔn)中三次重復(fù)法數(shù)據(jù)表得細(xì)菌數(shù)為0.9個/mL，再乘以指數(shù)稀釋倍數(shù)102，即得水樣含菌量為90個/mL。結(jié)果：第1種方法與第2種方法計算的水樣細(xì)菌含量相差5個/mL。

從表5和表6可以看出，兩種計算細(xì)菌個數(shù)的方法存在不一致的情況，而生長指標(biāo)所選的3級稀釋倍數(shù)，共有6個或9個細(xì)菌測試瓶。從定性分析的角度來說，將這些細(xì)菌瓶可分為兩類：一類是有細(xì)菌生長的陽性瓶，另一類是無細(xì)菌生長陰性瓶。從定量分析的角度來說，陽性瓶中有多少個細(xì)菌，不能加以量化，而陰性瓶里無細(xì)菌即0個/mL，可以加以量化，因此由陽性瓶推導(dǎo)的結(jié)果是不準(zhǔn)確的，由陰性瓶推導(dǎo)的結(jié)果為準(zhǔn)確結(jié)果[12]。

由表5看出：方法1中所選6個細(xì)菌測試瓶中有4個陽性瓶，2個陰性瓶；方法2所選的6個細(xì)菌測試瓶中有3個陽性瓶，3個陰性瓶。由表6看出：方法1中所選9個細(xì)菌測試瓶中有5個陽性瓶，4個陰性瓶；方法2所選的9個細(xì)菌測試瓶中有2個陽性瓶，7個陰性瓶?？梢娨罁?jù)方法2所推導(dǎo)的結(jié)果比方法1更準(zhǔn)確些，能夠更接近實際的真實情況，而方法1得出的結(jié)果誤差較大。因此細(xì)菌菌量的計算應(yīng)依據(jù)SY/T 0532—2012《油田注入水細(xì)菌分析方法絕跡稀釋法》標(biāo)準(zhǔn)中多組測試瓶細(xì)菌計數(shù)原則進(jìn)行確定。

2.6 驗證實驗

取兩批次的殺菌劑產(chǎn)品，用采出水進(jìn)行檢測殺菌劑的技術(shù)指標(biāo)室內(nèi)殺菌效果。第1種方法：在24h內(nèi)盡快檢測。第2種方法：將放置時間超出24h的水樣，按加入培養(yǎng)基的體積分?jǐn)?shù)為0.20%、培養(yǎng)溫度為45℃、培養(yǎng)時間為36h，先培養(yǎng)空白細(xì)菌量，再進(jìn)行檢測。空白細(xì)菌菌量結(jié)果的讀數(shù)依據(jù)SY/T 0532—2012《油田注入水細(xì)菌分析方法絕跡稀釋法》中多組測試瓶細(xì)菌計數(shù)的原則。室內(nèi)殺菌效果結(jié)果的判定依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)Q/SH 0355—2010《油田采出水處理用殺菌劑技術(shù)要求》中技術(shù)指標(biāo)的要求，結(jié)果見表7。

表7 檢測SRB細(xì)菌室內(nèi)殺菌效果數(shù)據(jù)

從表7得知樣品在24h內(nèi)與24h后的殺菌效果基本一致，結(jié)果在誤差的范圍內(nèi)，符合標(biāo)準(zhǔn)的要求。

3 結(jié)論

1）通過對培養(yǎng)空白細(xì)菌菌量的檢測方法影響因素分析，選擇加入培養(yǎng)基的體積分?jǐn)?shù)為0.20%、培養(yǎng)溫度為（40±5）℃、培養(yǎng)時間為36h，作為培養(yǎng)空白菌量最佳實驗條件。

2）對兩種計數(shù)細(xì)菌菌量的方法進(jìn)行理論與實際應(yīng)用分析，得出SY/T 0532—2012《油田注入水細(xì)菌分析方法絕跡稀釋法》中多組測試瓶細(xì)菌計數(shù)的原則方法是最合理的細(xì)菌菌量的計數(shù)方法。

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In the quality detection of bactericide products according to the standard Q/SH 0355-2010"technical requirements for bactericide for oilfield produced water treatment",the laboratory culture and counting of the bacteria in the bactericide blank sample of oilfield produced water is important link.The effects of culture medium amount,culture time and culture temperature on the amount of bacteria in blank sample were analyzed,and the optimum bacterium culture conditions were determined：the volume fraction of culture medium is 0.2%,the culture temperature is(40+5)℃,and the culture time is 36 h.It is theoretically analyzed and experimentally verified that different requirements of different standards to bacterial count method lead to the difference in the bacterial count results.Through the optimization of the laboratory bacterium detection and counting methods,it is held that extinction dilution method is the most reasonable bacterium counting method,which improves the accuracy and timeliness of the laboratory sterilization effect detection results of bactericides.The research result in this paper has certain guiding significance of quality inspection of bactericides.

bactericide;laboratory bactericidal effect;bacterial culture;extinction dilution method

左學(xué)敏

2017-02-09

高勝華（1970-），女，工程師，主要從事油田化學(xué)劑的質(zhì)量監(jiān)督檢驗與研究工作。