呂自明，蔡 凱，李巧汶，李健洪

廣州醫(yī)科大學附屬第六醫(yī)院胸心五區(qū)，廣東 清遠 511518

廣東地區(qū)冠心病患者外周血中eHSP90α的表達水平及意義

呂自明，蔡 凱，李巧汶，李健洪

廣州醫(yī)科大學附屬第六醫(yī)院胸心五區(qū)，廣東 清遠 511518

目的探討eHSP90α在冠心病發(fā)生發(fā)展中的作用和意義。方法選取2013年6月～2016年6月在本院住院的廣東籍冠心病患者101例及對照組31例，收集病情資料，檢測外周血eHSP90α含量。分析外周血eHSP90α含量與冠心病患者病情的關(guān)系。結(jié)果冠心病患者外周血中eHSP90α水平較對照組升高（P＜0.01）。不穩(wěn)定型冠心病患者外周血eHSP90α含量高于穩(wěn)定性冠心病患者（92.17±23.63 ng/Lvs15.84±15.83 ng/L,P＜0.01），冠心病合并心衰患者外周血eHSP90α含量高于不合并心衰發(fā)生的患者（93.04±22.94 ng/Lvs81.49±20.44 ng/L,P＜0.05）。冠心病合并IV級、III級心衰患者外周血eHSP90α 差異沒有統(tǒng)計學意義（P=0.158）。結(jié)論血中eHSP90α含量與廣東地區(qū)冠心病患者病情相關(guān)，進一步深入研究也許可作為冠心病病情血學標志。

冠心病；eHSP90α；心衰

冠心病是在冠狀動脈粥樣硬化病理基礎(chǔ)上，因多種危險因素誘發(fā)的動脈粥樣斑塊破裂和血栓形成，造成管腔狹窄甚至閉塞，進而心肌缺血，嚴重引起心肌梗死的病理生理過程[1-2]。在這一過程中，心肌細胞損傷可引起細胞內(nèi)大量物質(zhì)分泌，如肌酸激酶同工酶(CK-MB)、心肌肌鈣蛋白(cTnI)等都大量增加，已成為冠心病診斷的血清指標[3-4]。熱休克蛋白90（HSP90）是一類高度保守的蛋白質(zhì)，約占胞質(zhì)蛋白的1%～2%，有α和β兩種亞型[5]。近年來，外周血中分泌型Hsp90α（eHSP90α）日愈受到關(guān)注，被證明與腫瘤、炎癥、細胞損傷等有密切關(guān)系[6-7]。但是，eHSP90α與冠心病的發(fā)病及嚴重程度之間的關(guān)系鮮有報道。因此，本研究將通過研究廣東地區(qū)冠心病患者外周血中eHSP90α表達水平，初步探索eHSP90α在冠心病發(fā)病中的關(guān)系和臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選自2013年6月～2016年6月，我院診斷為冠心病的廣東籍患者101例，其中男性64例，女性37例；穩(wěn)定性心絞痛（SAP）51例，不穩(wěn)定型心絞痛（ACS）50例（表1）；按冠脈病變分型，A型35例，B1型30例，B2型21例，C型15例；按冠脈病變支數(shù)，一支冠脈病變43例，兩支冠脈病變36例，三支冠脈病變22例。收集體檢中心健康對照組31例，無重要臟器病變和惡性疾病。

病例排除標準：嚴重高血壓患者；創(chuàng)傷或4周內(nèi)行手術(shù)者；各類腫瘤；非動脈粥樣硬化性心肌病；嚴重心瓣膜?。恍募》屎?；系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性硬化癥等自身免疫性疾病；肺纖維化；各種急慢性感染性疾病。

表1 穩(wěn)定型和不穩(wěn)定型冠心病患者基本情況和血eHSP90α含量

1.2 研究方法

1.2.1 外周血中eHSP90α含量檢測 患者入院后采集靜脈血5 mL，2 h內(nèi)離心（3000 r/min，4 ℃）15 min，取血約1.5 mL，分裝后-80 ℃冰箱凍存。待標本收集齊全后進行統(tǒng)一檢測。采用ELISA法檢測eHSP90α（Cloud Clone，USA），680全自動酶標儀檢測（BIORAD，USA）。

1.2.2 統(tǒng)計學處理 用SPSS19.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學處理，計量資料以均數(shù)±標準差表示。多組計量數(shù)據(jù)比較采用多個獨立樣本非參數(shù)檢驗，各組間數(shù)據(jù)比較使用單因素方差分析，兩組間連續(xù)變量比較使用t檢驗，組內(nèi)兩兩比較采用SNK法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 穩(wěn)定型和不穩(wěn)定型冠心病患者基本情況和血eHSP90α含量的差異

健康對照組，穩(wěn)定型和不穩(wěn)定型冠心病患者在性別和年齡分布上沒有顯著差異。穩(wěn)定型和不穩(wěn)定型冠心病患者血eHSP90α含量較健康對照組明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義；同時，不穩(wěn)定型組血eHSP90α也較穩(wěn)定型組顯著增高（P＜0.01, 表1）。

2.2 不同冠脈病變分型冠心病患者基本情況和血eHSP90α含量的差異

健康對照組、A組、B1組、B2組和C組在在性別和年齡分布上沒有顯著差異。A組、B1組、B2組和C組血eHSP90α含量較健康對照組顯著增高；B1組和A組、B2組間血eHSP90α含量沒有顯著差異，B2組和C組間血eHSP90α含量沒有顯著差異，而B2組血eHSP90α含量較A組顯著升高，C組血eHSP90α含量較B1組和A組顯著升高（P＜0.01, 表2）。

2.3 不同冠脈病變支數(shù)冠心病患者基本情況和血eHSP90α含量的差異

不同冠脈病變支數(shù)冠心病患者在性別和年齡分布上沒有顯著差異。兩支冠脈病變和三支冠脈病變血eHSP90α含量較一支冠脈病變顯著增高；三支冠脈病變較兩支冠脈病變血eHSP90α含量有所升高，但無顯著差異（表3）。

表2 不同冠脈病變分型冠心病患者基本情況和血eHSP90α含量

表3 不同冠脈病變支數(shù)冠心病患者基本情況和血eHSP90α含量

2.4 合并心衰和不合并心衰的冠心病患者血eHSP90α含量的差異

心衰是冠心病患者的一類嚴重并發(fā)癥。因此，通過對比冠心病合并心衰和冠心病不合并心衰患者血eHSP90α含量的差異，發(fā)現(xiàn)合并心衰的冠心病患者血eHSP90α含量（93.04±22.94 ng/L）較不合并心衰的冠心病患者血eHSP90α含量（81.49±20.44 ng/L）明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.041，表4）。

表4 合并心衰和不合并心衰的冠心病患者血eHSP90α含量

2.5 不同心功能級別的冠心病合并心衰患者血eHSP90α含量的差異

本研究進一步對比了不同心功能級別的冠心病合并心衰患者血eHSP90α含量的差異，結(jié)果顯示，III級血eHSP90α含量（87.33±23.36 ng/L）較IV級血eHSP90α含量（101.29±20.81 ng/L）低，但差異沒有統(tǒng)計學意義（P=0.158，表5）。

表5 不同心功能級別的冠心病合并心衰患者血eHSP90α含量

3 討論

Hsp90是重要的應(yīng)激性蛋白之一，能在應(yīng)激反應(yīng)時迅速合成并激活，主要的作用是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)聚集、折疊、跨膜、運輸和轉(zhuǎn)位，發(fā)揮穩(wěn)定細胞骨架和作為分子伴侶等作用，是細胞抵抗早期應(yīng)激性損傷的主要方式之一[8-9]。

既往的研究發(fā)現(xiàn)，細胞內(nèi)的HSP90可以通過調(diào)控eNOS參與NO合成來減少冠心病的發(fā)生發(fā)展[10]、調(diào)節(jié)PI3K-AKT信號通路減少細胞凋亡[11]。在冠心病研究中發(fā)現(xiàn)患者血中總HSP90的水平較對照組明顯升高，被認為是心血管的自我保護機制[12-13]。也有研究表明，應(yīng)激原的作用下HSP90可以“主動”分泌到細胞外或者應(yīng)激導(dǎo)致的壞死細胞釋放崩解后釋放到細胞外（即eHSP90），可與TGF-β1的受體結(jié)合促進心肌纖維化發(fā)生發(fā)展[14]。

那么，eHSP90在冠心病中的作用如何？新近的研究發(fā)現(xiàn)，HSP90兩個亞型中，分泌到細胞外的eHSP90α是其發(fā)揮作用的主要形式[6]。我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)冠心病患者血中HSP90的亞型eHSP90α的表達水平也較健康對照組顯著升高。不穩(wěn)定型冠心病患者血eHSP90α明顯高于穩(wěn)定性冠心病患者，冠脈血管病變多的也多于單一血管病變患者。我們一步的分析也發(fā)現(xiàn)，如果冠心病患者合并心衰發(fā)生，其血eHSP90α的表達水平高于不合并心衰發(fā)生的患者；并且心衰等級越高，eHSP90α的表達水平也越高，只是兩者間差異不太顯著，考慮病例數(shù)不足。可見，eHSP90α的表達水平與冠心病患者病情的嚴重程度密切相關(guān)。

但是，冠心病患者血高水平的eHSP90α是否參與冠心病的發(fā)生發(fā)展呢？在其他的研究中發(fā)現(xiàn)，eHSP90α可以促進腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移[15-17]、增加成纖維細胞合成細胞外基質(zhì)參與組織重構(gòu)[14,18]、誘導(dǎo)炎癥因子的生成參與炎癥反應(yīng)[19-20]等。因此，我們考慮心血管中內(nèi)皮細胞、心肌細胞等中高Hsp90α在應(yīng)激早期參與了心血管細胞的保護。但是分泌到細胞外的eHSP90α可能啟動了炎癥反應(yīng)和心肌構(gòu)成，促進了冠心病的發(fā)生發(fā)展。因此，下一步研究中，我們將在實驗中進一步探討eHSP90α對冠脈血管的作用，并研究其中的機制。

綜上所述，Hsp90作為體內(nèi)重要的應(yīng)激蛋白之一，在冠心病缺血缺氧的應(yīng)激環(huán)境中發(fā)揮重要作用。eHSP90α其與冠心病患者病情的嚴重程度密切相關(guān)，可能可以作為冠心病患者病情變化及預(yù)后的血清學指標。

[1]Hashmi S, Ahmad HR, Sharif H, et al. Diastolic dysfunction in coronary artery disease[J]. J Coll Physicians Surg Pak, 2017,27(3): 192.

[2]Senior R, Khattar RS. Cardiac investigation for prognosis in coronary artery disease: where negative is positive[J]. Eur Heart J Cardiovasc Imaging, 2017, 25(8): 25.

[3]Fan J, Ma J, Xia N, et al. Clinical value of combined detection of CK-MB, MYO, cTnI and plasma NT-proBNP in diagnosis of acute myocardial infarction[J]. Clin Lab, 2017, 63(3): 427-33.

[4]Moludi J, Keshavarz S, Tabaee AS, et al. Q10 supplementation effects on cardiac enzyme CK-MB and troponin in patients undergoing coronary artery bypass graft: a randomized, doubleblinded, placebo-controlled clinical trial[J]. J Cardio Thorac Res,2016, 8(1): 1-7.

[5]Walter R, Pan KT, Doebele C, et al. HSP90 promotes Burkitt lymphoma cell survival by maintaining tonic B-cell receptor signaling[J]. Blood, 2017, 129(5): 598-608.

[6]Zou M, Bhatia A, Dong H, et al. Evolutionarily conserved dual lysine motif determines the non-chaperone function of secreted Hsp90alpha in tumour progression[J]. Oncogene, 2017, 36(15):2160-71.

[7]Bhatia A, O'brien K, Chen M, et al. Keratinocyte-Secreted heat shock protein-90alpha: leading wound reepithelialization and closure[J]. Advances Wound Care, 2016, 5(4): 176-84.

[8]Blair LJ, Sabbagh JJ, Dickey CA. Targeting Hsp90 and its cochaperones to treat Alzheimer's disease[J]. Expert Opin Ther Targets, 2014, 18(10): 1219-32.

[9]Calderwood SK, Gong J. Heat shock proteins promote cancer: it's a protection racket[J]. Trends Biochem Sci, 2016, 41(4): 311-23.

[10]Vladic N, Ge ZD, Leucker T, et al. Decreased tetrahydrobiopterin and disrupted association of Hsp90 with eNOS by hyperglycemia impair myocardial ischemic preconditioning[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2011, 301(5): H2130-9.

[11]Gao ZM, Liu FH, Yin P, et al. Inhibition of heat-induced apoptosis in rat small intestine and IEC-6 cells through the AKT signaling pathway[J]. BMC Vet Res, 2013, 9(8): 241.

[12]朱惠民, 曾高峰. 冠心病患者血清熱休克蛋白90水平變化及意義[J]. 實用醫(yī)學雜志, 2009, (04): 576-7.

[13]劉代華, 黃紅林, 廖端芳. 熱休克蛋白90在心血管系統(tǒng)中的作用[J]. 國外醫(yī)學: 生理, 病理科學與臨床分冊, 2004, (05): 473-5.

[14]García R, Merino D, Gómez JM, et al. Extracellular heat shock protein 90 binding to TGFβ receptor I participates in TGFβmediated collagen production in myocardial fibroblasts[J]. Cell Signal, 2016, 28(10): 1563-79.

[15]Hance MW, Dole K, Gopal U, et al. Secreted Hsp90 is a novel regulator of the epithelial to mesenchymal transition (EMT) in prostate cancer[J]. J Biol Chem, 2012, 287(45): 37732-44.

[16]Nolan KD, Franco OE, Hance MW, et al. Tumor-secreted Hsp90 subverts polycomb function to drive prostate tumor growth and invasion[J]. J Biol Chem, 2015, 290(13): 8271-82.

[17]Dong H, Zou M, Bhatia A, et al. Breast Cancer MDA-MB-231 cells use secreted heat shock protein-90alpha (Hsp90α) to survive a hostile hypoxic environment[J]. Sci Rep, 2016, 6(4): 20605.

[18]Bohonowych JE, Hance MW, Nolan KD, et al. Extracellular Hsp90 mediates an NF-κB dependent inflammatory stromal program:implications for the prostate tumor microenvironment[J]. Prostate,2014, 74(4): 395-407.

[19]Tukaj S, W?grzyn G. Anti-Hsp90 therapy in autoimmune and inflammatory diseases: a review of preclinical studies[J]. Cell Stress Chaperones, 2016, 21(2): 213-8.

[20]Oca?a GJ, Pérez L, Guindon L, et al. Inflammatory stress of pancreatic beta cells drives release of extracellular heat-shock protein 90α[J]. Immunology, 2017, 151(2): 198-210.

Expression and significance of eHSP90α in peripheral blood of patients with coronary heart disease in Guangdong

LV Ziming, CAI Kai, LI Qiaowen, LI Jianhong
The Fifth District in Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, the Sixth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University,Qingyuan 511518, China

ObjectiveTo investigate the effect of secreted Hsp90α (eHSP90α) on the development and progression of coronary heart disease (CHD).MethodsA total of 101 patients with CHD and 31 cases as healthy control group were enrolled in this study from June 2013 to June 2016. The eHSP90 αlevels in peripheral blood of all cases were collected. The correlation of eHSP90α levels in peripheral blood with condition of patients with CHD was analyzed.ResultsThe eHSP90α levels in peripheral blood of patients with CHD was significantly higher than that of healthy control group (P＜0.01). In patients with CHD, eHSP90α levels in peripheral blood in unstable CHD group was significantly higher than that in stable CHD group(P＜0.01). The eHSP90α levels in peripheral blood in CHD combined with heart failure was significantly higher than that in patients group without heart failure (P＜0.05). The eHSP90α levels in peripheral blood of CHD patients with grade Ⅳ heart failure had no significant difference with grade III heart failure patients (P=0.158).ConclusionThe eHSP90α levels in peripheral blood are closely related to the condition of CHD in Guangdong. It may be a serological marker of coronary heart disease by further study.

coronary heart disease; eHSP90α; heart failure

2017-03-05

廣東省自然科學基金（2016A030607034）

呂自明，碩士，醫(yī)師，E-mail：lzmwyzt@126.com