梁 惠 （山東省蓬萊市大辛店畜牧工作站 265612）

鴨疫里默氏桿菌的分離鑒定及耐藥性分析

梁 惠 （山東省蓬萊市大辛店畜牧工作站 265612）

采集煙臺地區(qū)某鴨場鴨傳染性漿膜炎疑似病料進行細(xì)菌分離，并對分離細(xì)菌進行生化鑒定、PCR鑒定、動物試驗和藥敏試驗。結(jié)果表明：分離得到的2株細(xì)菌均為鴨疫里默氏桿菌，分離株對頭孢氨芐、頭孢噻肟高度敏感，對氨芐西林、多粘菌素B、丁胺卡那、氟苯尼考、慶大霉素、卡那霉素、阿奇霉素、鏈霉素、恩諾沙星中度敏感，對環(huán)丙沙星、氟哌酸、復(fù)方新諾明、磺胺嘧啶、利福平、四環(huán)素不敏感。說明頭孢氨芐、頭孢噻肟可作為此養(yǎng)鴨場防治該病的首選藥物，其他藥物須減少或暫停使用。

鴨疫里默氏桿菌 分離 鑒定 藥敏試驗

鴨疫里默氏桿菌(Riemerella anatipestifer，RA)簡稱鴨疫里氏桿菌，由其引起的疾病稱為鴨傳染性漿膜炎，是鴨、鵝等多種禽類的一種急性或慢性傳染病[1]，主要危害1-8周齡的小鴨，在臨床上表現(xiàn)為困倦、眼鼻有分泌物，綠色下痢，共濟失調(diào)和抽搐，慢性病例可出現(xiàn)頭頸歪斜；病理變化為纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、干酪性輸卵管炎和腦膜炎，是危害養(yǎng)鴨業(yè)最主要的傳染病之一，如果治療不及時可引起大批死亡，給養(yǎng)鴨業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。

在養(yǎng)鴨的過程中，為了防治細(xì)菌性傳染病的發(fā)生，盲目使用一些抗菌藥物，導(dǎo)致環(huán)境中RA的耐藥性菌株越來越多，表現(xiàn)為多重耐藥和交叉耐藥[2]，并且不同地區(qū)不同養(yǎng)殖場RA的耐藥性不同，這給本病的防治帶來很大的困難，此外，RA血清型多，有20多個，流行于我國的血清型主要有1、2、3、4、5、7、8、10、11、13、14和其他未知血清型[3]，血清型之間無交叉免疫作用，因血清型不符而導(dǎo)致疫苗免疫失敗，因此有必要進行RA的分離鑒定，為鴨傳染性漿膜炎的防治提供一定的指導(dǎo)，并為研究符合當(dāng)?shù)匮逍偷囊呙绲於ɑA(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病料來源 煙臺地區(qū)發(fā)病鴨場，無菌采集疑似鴨傳染性漿膜炎病死鴨的心臟、肝臟、腦組織。

1.1.2 培養(yǎng)基、試劑 普通營養(yǎng)瓊脂、麥康凱培養(yǎng)基、TSA、TSB均購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；生化試劑和藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司；高保真Taq DNA聚合酶購自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司，細(xì)菌DNAout(G+)購自綿陽高新區(qū)天澤基因工程有限公司。

1.1.3 試驗動物 10日齡RA未免疫健康雛鴨15只來自煙臺蓬萊某養(yǎng)鴨場，常規(guī)飼養(yǎng)3d，未發(fā)現(xiàn)任何異常，供動物試驗用。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離 將采集的病料分別劃線接種于麥康凱培養(yǎng)基、普通營養(yǎng)瓊脂、TSA，并將TSA置CO2培養(yǎng)箱，普通營養(yǎng)瓊脂和麥康凱培養(yǎng)基置普通培養(yǎng)箱，37℃恒溫培養(yǎng)24h，選擇符合RA特性的菌落，然后涂片、革蘭氏染色、鏡檢，觀察結(jié)果。并挑取單個菌落反復(fù)劃線觀察，進行分離菌的純培養(yǎng)。

1.2.2 生化鑒定 根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[4]對分離細(xì)菌進行常規(guī)的生理生化鑒定。

1.2.3 PCR鑒定 （1）引物的設(shè)計與合成：根據(jù)GenBank中已發(fā)表的RA16S rRNA基因序列，應(yīng)用Primer5.0軟件自行設(shè)計合成了一對能擴增1115bp基因片段的引物，序列如下：P1: 5’GTA TTC ACC GCG CCA TGG CT3’；P2: 5’ TTG GTG AGG TAA CGG CTC AC3’.送北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。（2）RA基因組DNA的提?。禾羧A單菌落，接種到5ml TSB中，37oC振蕩培養(yǎng)過夜，參考細(xì)菌DNAout(G+)試劑盒說明書提取全基因組。（3）PCR體系與反應(yīng)條件：以提取的RA全基因組為模板，用合成的引物進行PCR擴增，反應(yīng)條件為：94oC預(yù)變性5min；94oC 1min，51oC 1min，72oC 1min，30個循環(huán)；72oC 10min。PCR結(jié)束后，取5μLPCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，觀察結(jié)果。

1.2.4 動物試驗 將2株分離菌株分別接種于TSA上，置CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)48h，將平板上所有菌落刮下，混于滅菌生理鹽水中制成細(xì)菌懸液，并調(diào)整細(xì)菌濃度為107CFU/ml。選取15只飼養(yǎng)至13日齡的健康肉鴨，隨機分為3組，每組5只，試驗組每只腿部皮下接種菌液0.5ml，對照組用滅菌生理鹽水注射。接種后每日觀察記錄鴨的精神、食欲、飲水、糞便、運動及死亡情況，并對死亡鴨進行病理剖檢，并取死亡鴨的心血、肝組織進行細(xì)菌分離培養(yǎng)。

1.2.5 藥敏試驗 參照《獸醫(yī)微生物學(xué)實驗指導(dǎo)》圓紙片擴散法[5]，將2株分離株的菌落分別用滅菌生理鹽水洗脫，分別均勻涂布在TSA上，然后將慶大霉素、卡那霉素等16種常用抗菌藥物的藥敏試紙分別貼到平板表面，二氧化碳培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24h，觀察抑菌圈的大小并記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離

經(jīng)鑒別培養(yǎng)和涂片、染色、鏡檢，從采集的病料中分離得到2株疑似RA。細(xì)菌在TSA上生長良好，形成光滑、中央隆起、奶油狀的圓形菌落，在普通營養(yǎng)瓊脂和麥康凱培養(yǎng)基上不生長。顯微鏡下觀察呈革蘭氏陰性、瑞氏染色兩極濃染的短桿菌。

2.2 生化鑒定

2株分離株生化鑒定結(jié)果一致，均符合RA的生化特性，結(jié)果見表1

表1 生化鑒定結(jié)果

2.3 PCR鑒定

以提取的細(xì)菌DNA基因組為模板，應(yīng)用合成的P1和P2為引物進行PCR反應(yīng)擴增目的基因，所獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳呈單一條帶，大小與預(yù)期1115bp相符(見附圖)

附圖 PCR擴增結(jié)果M：DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1：分離株1擴增產(chǎn)物；2：分離株2擴增產(chǎn)物

2.4 動物試驗結(jié)果

2組試驗組的5只小鴨在接種細(xì)菌2d后，表現(xiàn)為精神沉郁、采食量下降、眼鼻有分泌物、排黃綠色稀糞，死亡之前有頭頸震顫、抽搐、共濟失調(diào)、角弓反張等明顯神經(jīng)癥狀，分別于接種后3~4d出現(xiàn)死亡，對照組的5只小鴨精神、食欲無異常。病死鴨剖檢可見典型的纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎，取腦，心血和肝組織進行細(xì)菌分離，其培養(yǎng)特性、生化特性與RA一致。

2.5 藥敏試驗結(jié)果

藥敏試驗結(jié)果見表2。結(jié)果表明，分離株對頭孢氨芐、頭孢噻肟高度敏感，對氨芐西林、多粘菌素B、丁胺卡那、氟苯尼考、慶大霉素、卡那霉素、阿奇霉素、鏈霉素中度敏感，對環(huán)丙沙星、氟哌酸、復(fù)方新諾明、磺胺嘧啶、利福平、四環(huán)素不敏感。

表2 分離株藥敏試驗結(jié)果

3 討論

（1）診斷鴨傳染性漿膜炎時應(yīng)與鴨大腸桿菌病相區(qū)別，兩者在臨床癥狀和剖檢病變上極為相似，但在細(xì)菌的培養(yǎng)特性和生化特性上大不相同。本試驗從臨床疑似病例中分離得到一株細(xì)菌，通過培養(yǎng)特性、形態(tài)觀察、生化試驗進行鑒定，由于RA生化特性存在一定的差異[6]，生化鑒定結(jié)果只能初步鑒定分離株為RA，因此通過PCR進一步鑒定分離菌株為RA，RA菌株的獲得為進一步研究該病有效的防制方法奠定了基礎(chǔ)。（2）臨床上抗菌藥物的濫用，導(dǎo)致RA的耐藥性在不斷地增加，給該病的防治帶來了巨大的困難，鴨傳染性漿膜炎的防治須在藥敏試驗的基礎(chǔ)上進行。本試驗的藥敏試驗結(jié)果表明，分離菌株對頭孢氨芐、頭孢噻肟高度敏感，可作為此養(yǎng)鴨場防治該病的首選藥物，其他藥物須減少或暫停使用。（3）疫苗免疫是預(yù)防鴨傳染性漿膜炎的有效措施之一，由于RA血清型多，不同血清型間缺乏交叉免疫力，并且該病可出現(xiàn)多種血清型混合感染及新的血清型不斷出現(xiàn)[7]，因此，疫苗免疫效果差。在應(yīng)用疫苗免疫時，應(yīng)經(jīng)常對本地區(qū)本養(yǎng)殖場的流行菌株進行鑒定，選擇同血清型的疫苗或自家苗進行免疫接種，確保免疫效果。

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