孟雪蓮,劉 佳,劉瑩瑩,鄭良超,高程程,王 丹,呂 晶,陳長蘭

(遼寧大學藥學院,遼寧沈陽 110036)

?

蟲草素對脂多糖誘導巨噬細胞過度活化的抑制作用研究

孟雪蓮,劉 佳,劉瑩瑩,鄭良超,高程程,王 丹,呂 晶,陳長蘭*

(遼寧大學藥學院,遼寧沈陽 110036)

蟲草素,脂多糖,巨噬細胞,過度活化

巨噬細胞(Macrophages)為吞噬細胞,參與機體的先天性免疫和細胞免疫。巨噬細胞過度激活,會顯著上調(diào)多種毒性炎性因子的分泌,如 NO、TNF-α、IL-1β、IL-6、活性氧(ROS)等,引起炎癥反應,使組織和細胞遭受損傷。致病原引起的感染、炎癥性胃腸道疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病、風濕性疾病、過敏性疾病等的發(fā)病機制均與巨噬細胞的過度活化有關[1]。研究表明,抑制巨噬細胞過度活化可能成為防治炎癥相關疾病的一個重要策略。

圖1 蟲草素的化學結(jié)構(gòu)Fig.1 The chemical structure of cordycepin

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蟲草素 純度98%，成都曼斯特生物科技有限公司;脂多糖(lipopolysaccharides,LPS,E.coli026:B6) 美國Sigma公司;DMEM高糖培養(yǎng)基 美國HyClone公司;胰蛋白酶、四甲基偶氮唑鹽(MTT) 美國Gibco公司;胎牛血清 日本TaKaRa公司;Mouse/Rat TNF-αValukine ELISA試劑盒、Mouse IL-1βValukine ELISA試劑盒、Mouse IL-6 Valukine ELISA試劑盒 美國R&D公司;Fluo-3/AM 美國Invitrogen公司;小鼠巨噬細胞系RAW264.7 中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所北京協(xié)和醫(yī)學院細胞資源中心。

CO2培養(yǎng)箱、超低溫-80 ℃冰箱、紫外分光光度計 德國Thermo Scientific公司;倒置顯微鏡 日本OMYLPUS公司;酶標儀 瑞士帝肯公司;流式細胞儀 美國BD公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和藥物配制

1.2.1.1 細胞培養(yǎng) 小鼠RAW264.7細胞系以DMEM高糖培養(yǎng)基(含5%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素)在37 ℃、95%空氣、5% CO2條件下培養(yǎng)。以0.25%胰蛋白酶消化進行傳代培養(yǎng)。

1.2.1.2 藥物配制 稱取蟲草素完全溶于DMSO溶液制成10 mmol/L儲備液,-20 ℃避光保存。使用時,用無血清無抗生素的DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋到最終濃度。DMSO的終濃度≤1‰。

1.2.2 細胞存活率的檢測——MTT法 取對數(shù)生長期的RAW264.7巨噬細胞,以6×105cells/mL接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi),每孔100 μL。細胞貼壁24 h,換成無血清無抗生素新鮮培養(yǎng)基,加入藥物處理,設置蟲草素濃度為0.1、0.3、1、3、10 μmol/L單獨或與LPS(1 μg/mL)聯(lián)合作用,設置空白對照,每個組別設四個平行孔。藥物作用于RAW264.7巨噬細胞24 h后,每孔加入10 μL MTT溶液,37 ℃孵育3 h,去除培養(yǎng)液,每孔加入100 μL DMSO,室溫振蕩10 min,待結(jié)晶紫完全溶解后,用酶標儀測定490 nm處吸光度值,計算細胞存活率。

1.2.3 細胞NO釋放水平的測定——Griess法 取對數(shù)生長期的RAW264.7巨噬細胞,以6×105cells/mL接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi),每孔100 μL。細胞貼壁24 h,換成無血清無抗生素新鮮培養(yǎng)基,加入藥物處理,設置蟲草素濃度為0.1、0.3、1、3、10 μmol/L單獨或與LPS(1 μg/mL)聯(lián)合作用,設置空白對照,每個組別設四個平行孔。藥物作用于RAW264.7巨噬細胞24 h后,取50 μL培養(yǎng)液上清,加入50 μL的Griess試劑(以蒸餾水配制的0.1%的萘乙二胺,以5%的磷酸配制1%的磺胺,臨用前二者1∶1等體積混合)室溫條件下反應15 min,在540 nm處測定其吸光度。

1.2.4 細胞TNF-α、IL-1β和IL-6 釋放水平的測定——ELISA法 取對數(shù)生長期的RAW264.7巨噬細胞,以6×105cells/mL接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi),每孔100 μL。細胞貼壁24 h,換成無血清無抗生素新鮮培養(yǎng)基,加入藥物處理,設置蟲草素濃度為0.1、0.3、1、3、10 μmol/L單獨或與LPS(1 μg/mL)聯(lián)合作用,設置空白對照,每組設三個平行孔。加藥1 h后檢測TNF-α釋放,加藥4 h后檢測IL-1β和IL-6釋放。每孔收集50 μL細胞培養(yǎng)上清液用于ELISA檢測分析,按照試劑盒操作說明進行測定。根據(jù)標準曲線方程計算細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6含量。

1.2.5 細胞內(nèi)[Ca2+]i水平的測定——流式細胞術(shù)法 取對數(shù)生長期的RAW264.7巨噬細胞,以6×105cells/mL接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi),每孔2 mL。細胞貼壁24 h,換成無血清無抗生素新鮮培養(yǎng)基,加入藥物處理,設置蟲草素濃度為10 μmol/L單獨或與LPS(1 μg/mL)聯(lián)合作用,設置空白對照,每組設三個平行孔。加藥24 h后,收集細胞,4 ℃,1000 r/min,離心5 min,再以磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗待測細胞兩次;加入5 μmol/L Fluo-3/AM熒光探針,37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育30 min;4 ℃,1000 r/min,離心5 min,以PBS清洗細胞兩次;加入300 μL PBS吹散細胞,采用流式細胞儀檢測各組細胞的熒光強度值。

1.2.6 自由基清除能力檢測

1.2.6.1 羥自由基(·OH)清除能力測定——水楊酸法 水楊酸法檢測蟲草素對羥自由基的清除能力,參照文獻方法略做改動[5],利用fenton反應產(chǎn)生羥自由基,取1.5 mL 離心管,編號,依次加入無菌水96 μL、6 mmol/L FeSO4100 μL、2.4 mmol/L H2O2溶液100μL,而后加入不同濃度的蟲草素PBS溶液(以磷酸鹽緩沖液PBS配制的蟲草素溶液)4 μL,混合均勻,蟲草素終濃度為0.1、0.3、1、3、10 μmol/L,同時設置空白對照組(PBS作用組),室溫條件下靜置10 min,再加入6 mmol/L的水楊酸100 μL,37 ℃水浴反應30 min,取100 μL混合反應液于96孔板中,每組設三個平行孔,采用酶標儀測定510 nm波長處的吸光度值。實驗重復三次。

1.2.6.2 過氧亞硝酸根離子(ONOO-)清除能力的測定——L-酪氨酸法 目前過氧亞硝酸根離子(ONOO-)的制備主要采用淬滅流動反應合成法,本實驗參考文獻采用改進的過氧亞硝酸根離子溶液合成工藝[6]。實驗合成反應在4 ℃條件下進行。0.125 mol/L的NaOH水溶液10 mL(A液),30%的H2O2溶液0.3 mL與濃H2SO4溶液0.08 mL混合,以蒸餾水稀釋至5 mL(B液)。0.6 mol/L的NaNO2水溶液5 mL(C液)。B液與C液混合均勻,立即倒入A液中。而后加入MnO20.08 g,過濾后置于-20 ℃密封、避光過夜。1.0 mol/L NaOH溶液作為參比,用紫外分光光度計檢測302 nm 波長處的吸光度值,根據(jù)朗伯-比爾定律計算過氧亞硝酸根離子(ONOO-)的濃度(ε=1670)為778 μmol/L。

75 μmol/L的L-酪氨酸水溶液和96 μmol/L的ONOO-溶液與不同濃度的蟲草素PBS溶液(0.1～10 μmol/L)混勻,實驗同時設置空白對照(PBS作用組),于37 ℃水浴中反應30 min,取反應液點樣于96孔板,每孔100 μL,每組設三個平行孔,采用酶標儀檢測428 nm 處的吸光度值。實驗重復三次。

2 結(jié)果與分析

2.1 蟲草素對巨噬細胞存活率的影響

為了排除藥物對巨噬細胞的毒性作用,實驗首先采用MTT法考察蟲草素對細胞存活率的影響。結(jié)果表明,0.1～10 μmol/L的蟲草素單獨或與LPS(1 μg/mL)共同作用于RAW264.7巨噬細胞,細胞的存活率均無顯著變化。表明在0.1～10 μmol/L濃度范圍內(nèi),蟲草素對巨噬細胞無明顯毒性作用(數(shù)據(jù)未給出)。

2.2 蟲草素對多度活化的巨噬細胞NO釋放的影響

Griess法研究結(jié)果表明,與空白對照組相比,RAW264.7巨噬細胞經(jīng)LPS(1 μg/mL)單獨處理24 h后,細胞培養(yǎng)液中NO含量顯著升高。與模型組(LPS單獨作用組)相比,不同濃度的蟲草素與LPS共同作用于RAW264.7巨噬細胞,細胞釋放NO水平顯著降低。蟲草素(0.1～10 μmol/L)單獨作用于RAW264.7巨噬細胞24 h后,對細胞NO釋放均無顯著影響(圖2)。

圖2 蟲草素單獨或與LPS聯(lián)合作用對RAW264.7 巨噬細胞NO產(chǎn)生的影響Fig. 2 Effect of cordycepin on NO production by unstimulated or LPS-activated RAW264.注:##.與空白對照組相比,差異顯著(p<0.01);###. 與空白對照組相比,差異極顯著(p<0.001);*. 與LPS組相比,差異顯著(p<0.05);**. 與LPS組相比,差異極顯著(p<0.01);***. 與LPS組相比,差異高度顯著(p<0.001);圖3、圖4同。

2.3 蟲草素對過度活化的巨噬細胞TNF-α、IL-1β和IL-6釋放的影響

由圖3可見,ELISA研究結(jié)果表明,與空白對照組相比,LPS作用1 h后,RAW264.7巨噬細胞的炎癥因子TNF-α釋放量顯著增加;LPS作用4 h后,細胞釋放IL-1β和IL-6水平顯著增加。蟲草素對LPS活化的巨噬細胞釋放3種炎癥因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)均具有顯著抑制作用,且具有一定的濃度依賴性。

2.4 蟲草素對LPS過度活化的巨噬細胞內(nèi)[Ca2+]i水平的影響

流式細胞儀檢測結(jié)果表明,LPS(1 μg/mL)作用于RAW264.7巨噬細胞24 h,胞漿游離鈣離子熒光強度顯著升高。與LPS單獨作用組相比,蟲草素(10 μmol/L)與LPS共同作用可顯著抑制巨噬細胞內(nèi)胞漿游離鈣離子熒光強度的異常增高(見圖4)。

圖4 蟲草素與LPS聯(lián)合作用對RAW264.7巨噬細胞內(nèi)胞漿鈣離子濃度[Ca2+]i的影響Fig. 4 Effect of cordycepin on[Ca2+]i level in LPS-activated RAW264.

圖3 蟲草素與LPS聯(lián)合作用對RAW264.7巨噬細胞 TNF-α、IL-1β和IL-6釋放的影響Fig. 3 Effect of cordycepin on TNF-α,IL-1β, and IL-6 release by LPS-activated RAW264.

圖5 蟲草素對·OH自由基、ONOO-自由基清 和·自由基的清除作用Fig. 5 ·OH,ONOO-,and · free radical scavenging注:*.與模型對照組相比,差異顯著(p<0.05);**. 與模型對照組相比,差異極顯著(p<0.01);***. 與模型對照組相比,差異高度顯著(p<0.001)。

3 討論

細菌及其產(chǎn)物脂多糖(lipopolysaceharides,LPS)可將細胞激活,誘導細胞產(chǎn)生大量的NO、活性氧(ROS)及多種炎癥因子,如腫瘤壞死因子(TNF)、白細胞介素-1(IL-1)、IL-6、IL-12等[8]。在本實驗中,采用LPS激活小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞的方法,使其產(chǎn)生炎癥反應,釋放大量的NO和炎癥因子,從而建立起細胞炎癥模型。MTT實驗的結(jié)果表明(數(shù)據(jù)未給出),當濃度為0.1～10 μmol/L時,蟲草素單獨或與LPS 聯(lián)合應用對RAW264.7細胞的存活率無顯著影響。以此排除蟲草素對上述細胞NO釋放的作用是通過降低細胞數(shù)量所致。Griess實驗的結(jié)果表明,蟲草素(0.1～10 μmol/L)與LPS 聯(lián)合作用于巨噬細胞,LPS誘導的NO釋放水平的增高被顯著抑制;而蟲草素(0.1～10 μmol/L)單獨作用于巨噬細胞RAW264.7后,NO釋放水平無顯著變化。接著,采用ELISA實驗分別考察了蟲草素對LPS激活的RAW264.7細胞釋放TNF-α、IL-1β以及IL-6水平的變化。實驗證明,蟲草素(0.1～10 μmol/L)可不同程度的顯著抑制LPS激活的巨噬細胞釋放炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6,且具有明顯的濃度依賴性。上述結(jié)果證明,蟲草素具有顯著的抗巨噬細胞過度激活及抑制相關炎癥因子生成的作用。

在人體和動物體內(nèi),由于巨噬細胞過度活化產(chǎn)生過量的炎癥因子可以導致感染、心血管疾病、風濕性疾病等一系列疾病[1]。蟲草素抑制過度激活的巨噬細胞釋放NO及多種炎癥因子的作用,提示其有望用于上述炎癥相關疾病的防治。

多項研究結(jié)果表明,激活的巨噬細胞中胞漿游離鈣離子濃度([Ca2+]i)持續(xù)增高,其升高一方面來自胞內(nèi)Ca2+庫的釋放,另一方面來自胞外Ca2+的內(nèi)流。脂多糖(LPS)能夠通過作用于TLR受體而誘導巨噬細胞胞內(nèi)Ca2+大量增加[9],從而加強TLR配體誘導的炎性細胞因子如IL-6、TNF-α、NO的產(chǎn)生,表明Ca2+信號通路與TLR信號通路之間的交互作用是巨噬細胞充分活化所必需的[10]。Zhou[11]等的研究表明,在LPS激活的大鼠腹腔巨噬細胞中,[Ca2+]i的增高可使誘導型一氧化氮合酶(iNOS)表達增高,NO和TNF-α大量產(chǎn)生。已有研究表明,蟲草素可抑制HT22神經(jīng)細胞及人血小板細胞內(nèi)Ca2+濃度的異常增高[12-13]。

本研究結(jié)果表明,蟲草素可顯著抑制LPS誘導的巨噬細胞內(nèi)[Ca2+]i濃度的增高,這可能是蟲草素抑制巨噬細胞過度活化并抑制其大量釋放NO、TNF-α、IL-1β和IL-6的作用機制之一。

自由基是指含有一個不成對電子的原子團,具有較強氧化能力的微粒。主要是指活性氧自由基,包括羥自由基,過氧化氫分子,過氧亞硝酸根離子、超氧陰離子,烷氧基,單線態(tài)氧等等。活性氧(ROS)是炎癥信號通路中的重要環(huán)節(jié),位于多條炎癥信號通路的上游。已有研究表明,在活化的巨噬細胞中可產(chǎn)生大量的活性氧自由基,可使NF-κB活化入核,增強iNOS、IL-1β、TNF-α和IL-6基因轉(zhuǎn)錄表達,促進細胞活化,使NO、IL-1β、TNF-α和IL-6的釋放增加[14-15]。本研究考察了蟲草素對羥自由基、過氧亞硝酸根自由基和超氧陰離子自由基的清除作用。結(jié)果顯示,蟲草素對三種自由基均具有顯著清除作用,表明自由基清除作用可能是其抗巨噬細胞活化的作用機制之一。

4 結(jié)論

[1]Liu G,Yang H. Modulation of macrophage activation and programming in immunity[J]. J Cell Physiol,2013,228(3):502-512.

[2]張姝,張永杰,Shrestha B,等. 冬蟲夏草菌和蛹蟲草菌的研究現(xiàn)狀、問題及展望[J]. 菌物學報,2013,32(4):577-597.

[3]余伯成,唐永范,唐亮,等. 蟲草素的藥理作用研究進展[J]. 現(xiàn)代藥物與臨床,2011,26(5):349-352.

[4]孟雪蓮,陳長蘭,孔維娟,等. 蟲草素抑制脂多糖誘導的小膠質(zhì)細胞活化及神經(jīng)保護作用[J]. 食品科學,2014,35(19):224-230.

[5]陳金娥,豐慧君,張海容. 紅茶、綠茶、烏龍茶活性成分抗氧化性研究[J]. 食品科學,2009,30(3):62-66.

[6]Beckman J S,Beckman T W,Chen J,et al. Apparent hydroxyl radical production by peroxynitrite:implications for endothelial injury from nitric oxide and superoxide[J]. Proc Natl Acad Sci U S A,1990,87(4):1620-1624.

[7]韓少華,朱靖博,王妍妍. 鄰苯三酚自氧化法測定抗氧化活性的方法研究[J]. 中國釀造,2009,6(6):155-157.

[8]Neher J J,Neniskyte U,Zhao J W,et al. Inhibition of microglial phagocytosis is sufficient to prevent inflammatory neuronal death[J]. J Immunol,2011,186(8):4973-4983.

[9]Desai B N,Leitinger N. Purinergic and calcium signaling in macrophage function and plasticity[J]. Front Immunol,2014,5:580.

[10]Liu X,Yao M,Li N,et al. CaMKII promotes TLR-triggered proinflammatory cytokine and type I interferon production by directly binding and activating TAK1 and IRF3 in macrophages[J]. Blood,2008,112(13):4961-4970.

[11]Zhou X,Yang W,Li J. Ca2+-and protein kinase C-dependent signaling pathway for nuclear factor-kappaB activation,inducible nitric-oxide synthase expression,and tumor necrosis factor-alpha production in lipopolysaccharide-stimulated rat peritoneal macrophages[J]. J Biol Chem,2006,281(42):31337-31347.

[12]Jin M L,Park S Y,Kim Y H,et al. The neuroprotective effects of cordycepin inhibit glutamate-induced oxidative and ER stress-associated apoptosis in hippocampal HT22 cells[J]. Neurotoxicology,2014,41:102-111.

[13]Lee D H,Kim H H,Cho H J,et al. Cordycepin-Enriched WIB801C from Cordyceps militaris Inhibits Collagen-Induced[Ca2+]i Mobilization via cAMP-Dependent Phosphorylation of Inositol 1,4,5-Trisphosphate Receptor in Human Platelets[J]. Biomol Ther(Seoul),2014,22(3):223-231.

[14]Dr?ge W. Free radicals in the physiological control of cell function[J]. Physiol Rev,2002,82(1):47-95.

[15]Jung H A,Jin S E,Choi R J,et al. Anti-amnesic activity of neferine with antioxidant and anti-inflammatory capacities,as well as inhibition of ChEs and BACE1[J]. Life Sci,2010,87(13-14):420-430.

Inhibitory effect of cordycepin on macrophagehyperactivation induced by lipopolysaccharide

MENG Xue-lian,LIU Jia,LIU Ying-ying,ZHENG Liang-chao,GAO Cheng-cheng,WANG Dan,LV Jing,CHEN Chang-lan*

(School of Pharmaceutical Science,Liaoning University,Shenyang 110036,China)

cordycepin;lipopolysaccharide;macrophage;hyperactivation

2017-02-14

孟雪蓮(1978-)，女，博士，副教授，研究方向：抗炎與免疫藥理學，E-mail：rubymxl@163.com。

*通訊作者:陳長蘭 (1963-)，男，博士，教授，研究方向：遺傳學與生物制藥，E-mail：chenchanglanbio@aliyun.com。

國家自然科學基金項目(81503085，31371085)。

TS201.4

A

1002-0306(2017)13-0297-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.13.055