鞏養(yǎng)倉，張雪林，吳建勇，張興平，彭凡嘉，張志剛，賀云新，梅正鼎，周德桂，邢朝柱*

(1.湖南省棉花科學研究所，湖南常德415101；2.棉花生物學國家重點實驗室／中國農業(yè)科學院棉花研究所，河南安陽455000)

哈克尼西棉細胞質雄性不育相關線粒體基因多態(tài)性分析

鞏養(yǎng)倉1，張雪林1，吳建勇2，張興平1，彭凡嘉1，張志剛1，賀云新1，梅正鼎1，周德桂1，邢朝柱2*

(1.湖南省棉花科學研究所，湖南常德415101；2.棉花生物學國家重點實驗室／中國農業(yè)科學院棉花研究所，河南安陽455000)

【目的】研究棉花細胞質雄性不育的相關線粒體基因。【方法】利用線粒體基因atpA、atp6、atp9、cob、coxⅠ、coxⅡ、coxⅢ、nad3、nad6、nad9探針，對哈克尼西棉細胞質雄性不育系S、保持系F、雜種一代H進行限制性片段長度多態(tài)性分析?！窘Y果】atpA、coxⅢ、nad3、nad6在3個材料間具有多態(tài)性。atpA、nad6基因探針與所有酶的雜交結果均顯示出多態(tài)性，且在不育系與雜種一代中表現(xiàn)一致，而在保持系中差異明顯。atpA/EcoRⅠ在3個材料中的雜交結果均顯示2條帶，其中1條2.2 kb的雜交帶在3個材料中相同，另一條在不育系和雜種一代中大小為3.2 kb，而在保持系中為4.8 kb；atpA/PstⅠ雜交結果中，在不育系和雜種一代中的條帶大小為17.0 kb，而在保持系中為10.2 kb。nad6探針與4個酶的雜交結果均為不育系和雜種一代比保持系多1～2條雜交帶。coxⅢ/EcoRⅠ在3個材料中均有1條2.5 kb的雜交帶，但在保持系與雜種一代中比不育系多1條1.7 kb的弱帶。nad3/BamHⅠ的雜交結果在不育系與保持系中表現(xiàn)一致，而在雜種一代中缺少1條9.5 kb的雜交帶?！窘Y論】推測atpA、nad6基因參與調控不育系的形成，而coxⅢ、nad3可能受到恢復系核基因的調控，在不育系育性恢復過程中發(fā)揮較為重要的作用。

棉花；細胞質雄性不育；線粒體基因；限制性片段長度多態(tài)性

利用二倍體野生棉——哈克尼西棉(Gossypium harknessiiBrandegee)育成的細胞質雄性不育系（Cytoplasmic male sterility，CMS）是首個棉花CMS品系[1]。目前已有多個哈克尼西棉三系雜交組合通過國家和省級審定，但因受恢復系來源狹窄和恢復能力不穩(wěn)定等影響，對其高優(yōu)勢組合的篩選十分困難，三系雜交種至今還未在生產上大面積應用。因此，研究不育系形成機理，挖掘不育相關基因及其標記，建立哈克尼西棉三系雜交棉分子標記輔助育種體系，提高育種效率，成為高優(yōu)勢三系雜交棉選育的重要基礎。

很多研究[2-5]表明，線粒體基因與CMS密切相關。植物線粒體基因組在200～2900 kb[6]，包含atp、cox、nad、cob、rps、rrn、ccm等基因家族[7]。線粒體基因組功能非常復雜，存在正向或反向重復、重組重排、缺失或遷入、RNA編輯、轉錄后調控等，這些因素是CMS產生的分子基礎[8-9]。Dewey等在T型胞質玉米中發(fā)現(xiàn)了第1個CMS相關基因T-urf13，它編碼1個13 kDa的蛋白[10]，該蛋白聚集在線粒體內膜上，參與膜孔組成[11]。在蘿卜[12]、向日葵[13]、水稻[14]、油菜[15]、辣椒[16]、小麥[17]等作物中均發(fā)現(xiàn)了與CMS相關的線粒體基因或開放閱讀框（Open reading frame，ORF）。在棉花上，王學德[18]對棉花線粒體蛋白質和DNA分析發(fā)現(xiàn)，不育系線粒體DNA缺少1個與coxⅡ基因具有同源序列的1.9 kb片段，敗育時期不育系花藥線粒體缺少1個約31 kDa的多肽。李雙雙等[19]研究發(fā)現(xiàn),在atp4下游發(fā)現(xiàn)1個哈克尼西棉細胞質不育系特有的orf160，全長480 bp，N端與atp6序列部分同源，C端序列與核序列部分同源，其編碼的159個氨基酸序列，與膜蛋白、細胞周期蛋白具有部分同源性。黃晉玲[20]對晉A細胞質雄性不育系和保持系線粒體基因的限制性片段長度多態(tài)性 （Restriction fragment length polymorphism，RFLP）分析結果顯示，atp6和coxⅡ基因在兩系間存在差異。張曉等[21]對棉花細胞質雄性不育系104-7A與其保持系線粒體基因的RFLP分析顯示，atpA、atp9、ccmB、nad1bc、nad6、nad7c、rrn18等基因表現(xiàn)出了多態(tài)性。本課題組前期對哈克尼西棉細胞質雄性不育系及其保持系[22]研究發(fā)現(xiàn)，atpA、nad6、coxⅢ基因表現(xiàn)出多態(tài)性。有研究[23-25]認為，相關線粒體基因與核基因的共同作用影響細胞質雄性不育的表達及育性恢復。雜種一代是CMS系與其恢復系的雜交后代，其線粒體基因來源于CMS系。本研究把雜種一代作為試驗材料，與CMS系、保持系一并進行RFLP多態(tài)性分析，研究可能參與棉花CMS形成的線粒體基因，為棉花CMS形成的分子機理研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

哈克尼西棉細胞質雄性不育系S、保持系F及雜種一代H，由中國農業(yè)科學院棉花研究所提供。不育系S來源于原始的哈克尼西棉細胞質不育系DES-HAMS277，是以保持系F作父本經多代嚴格授粉、性狀鑒定和多年株系選育而成，性狀穩(wěn)定。保持系F經多年多代封花自交，株系篩選，性狀穩(wěn)定。雜種一代H是利用多年培育的恢復系與不育系S配制的雜交組合，可育度100%。

1.2 試驗方法

1.2.1總DNA提取。參考宋國立等[26]的方法提取試驗材料葉片總DNA，并用RNase A對DNA進行純化、干燥，溶于滅菌水，紫外分光光度計檢測濃度并稀釋，使3個材料濃度一致。

1.2.2引物設計。選擇10個線粒體基因atpA、atp6、atp9、cob、coxⅠ、coxⅡ、coxⅢ、nad3、nad6、nad9，通過文獻查詢與軟件設計，針對每個基因選擇1對高特異性引物（表1），引物由上海生物工程技術服務有限公司合成。

1.2.3線粒體基因片段擴增。分別以S、F、H的總DNA為模板，進行聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction，PCR）擴增。反應體系20 μL：模板DNA 2 μL，10×PCR buffer 2 μL，dNTP（10 mmol· L－1each dNTP）0.4 μL，F(xiàn)wd primer（10 μmol·L－1）1 μL，Rev primer（10 μmol·L－1）1 μL，MgCl2（25 mmol·L－1）1.6 μL，TaqDNA polymerase（5×106U·L－1）0.2 μL，ddH2O 11.8 μL。擴增程序：94℃3 min；94℃30 s，57℃30 s，72℃1 min，28個循環(huán)；72℃10 min。反應結束后，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果。分離、回收保持系的擴增特異條帶，連入pGEM-T easy vector，經轉化、克隆、測序，與美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫序列比對分析。

表1 線粒體基因擴增引物Table 1 Primer sequence for mitochondrial genes

1.2.4探針標記。以連入基因片段的菌液為模板，進行PCR擴增，擴增程序同上，反應體系放大為50 μL?；厥仗禺悧l帶，測定回收基因片段濃度，采用地高辛標記，操作參照“DIG high prime DNA labeling and detection starter kitⅠ”說明書，每個基因探針制備10 μL，37℃孵育24 h，完成探針標記。每個標記探針與試劑盒提供的對照標準樣各取1 μL，分別稀釋成1000、10、3、1、0.3、0.1、0.03和0.01 μg·L－18個質量濃度梯度，依次點在尼龍膜上，1200 kJ紫外交聯(lián)3 min，超純水漂洗后，馬來酸平衡2 min，封閉30 min，抗體反應30 min，洗滌2次，顯色，檢測探針標記效率。根據(jù)標記效率結果確定各探針用于Southern雜交的稀釋倍數(shù)。

1.2.5DNA酶切與分離。選擇限制性內切酶BamHⅠ、bsp143Ⅰ、EcoRⅠ、HindⅢ、HinfⅠ、PstⅠ、SacⅠ消化總DNA。根據(jù)擴增片段測序結果，結合酶切位點分析，針對每個探針選擇4種限制性內切酶（表2）。根據(jù)酶切效率試驗結果，BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、PstⅠ、SacⅠ反應體系使用200 U，反應時間12 h；bsp143Ⅰ和HinfⅠ反應體系使用60 U，反應時間4 h。酶切完成后，向各反應體系中加入2.5 V的無水乙醇，置于－20℃0.5 h沉淀酶切產物，1×104r·min－1離心15 min，收集沉淀，真空干燥，溶于25 μL TE（Tris-EDTA）緩沖液中。酶切產物分離用0.5×TBE緩沖液制備12 g·L－1的瓊脂糖凝膠，上樣體系30 μL：25 μL酶切產物、5 μL上樣緩沖液 （溴酚藍為指示劑），電泳電壓2～3 V·cm－1，待溴酚藍跑出點樣孔約8 cm時停止電泳。熒光燈下檢測、拍照，切除Marker泳道和點樣孔。

表2 各探針對應選擇的限制性內切酶Table 2 Restriction enzymes for each probe

1.2.6Southern雜交。參考《分子克隆實驗指南》(第3版)第六章方案8的操作方法[27]，將凝膠分離的酶切產物轉移到尼龍膜上，轉膜時間22 h左右。將轉移后的凝膠和緊貼尼龍膜的濾紙用EB染色檢驗，驗證轉膜是否徹底。按照 “DIG high prime DNA labeling and detection starter kitⅠ”說明書進行Southern預雜交、雜交、顯色、拍照。參照切除的Marker，確定顯色條帶大小。

2 結果與分析

2.1 引物擴增結果分析

以總DNA為模板，10對基因引物在3個材料中均擴增出了單一條帶（圖1），回收保持系F的特異條帶，利用BLASTN V2.3.1+程序將測序結果在nr數(shù)據(jù)庫中進行比對分析，這些片段與哈克尼西棉線粒體序列（JX944506.1）的一致性超過99%（表3），說明選擇設計的引物特異性高，基因片段均被有效擴增。

圖1 線粒體基因PCR擴增結果Fig.1 PCR amplification for mitochondrial genes

表3 擴增序列與NCBI數(shù)據(jù)庫哈克尼西棉線粒體基因序列比對結果Table 3 Sequence alignment between PCR amplification and mitochondrial sequence of G.harknessiiBrandegee in NCBI database

2.2 探針標記效率分析

探針標記效率檢測結果表明，所有探針標記效率都與對照標準樣相當或者高于對照 （圖2），說明探針標記效率較高。比對標記探針與對照標準樣樣點顯示亮度認為，用于Southern雜交時，探針cob、coxⅠ稀釋30倍，探針atpA、coxⅡ、coxⅢ、nad6、nad9稀釋 10倍，探針atp6、atp9、nad3不稀釋。

2.3 Southern雜交結果分析

EB染色檢驗證明，轉膜徹底。Southern雜交結果顯示，10個基因探針都顯示了雜交信號。在40個探針／酶組合雜交結果中，30個探針／酶顯示較強的雜交信號，6個探針／酶雜交信號較弱，4個探針／酶沒有雜交信號；16個探針／酶顯示多個雜交信號，10個探針／酶在3個材料間表現(xiàn)出多態(tài)性（表4）。

圖2 探針標記效率檢測結果Fig.2 Probe labeling efficiency detection

不育系、保持系與雜種一代的雜交結果主要分為 4種類型：（1）3個材料無差異類型：atp6、cob、coxⅠ、coxⅡ、nad9所有的探針／酶組合，其條帶大小、亮度在3個材料間高度一致，說明這些基因是哈克尼西棉線粒體中非常保守的基因，能夠穩(wěn)定遺傳。根據(jù)雜交結果和酶切位點分析，這5個基因在3個材料中均表現(xiàn)為單拷貝。因atp6探針序列內含有2個相隔81 bp的HindⅢ酶切位點，atp6/HindⅢ表現(xiàn)為2條雜交帶。在內切酶HindⅢ作用下，探針cob雜交結果除顯示1條1.2 kb的主帶外，還在3.0 kb處有1條弱帶；在內切酶EcoRⅠ、HindⅢ作用下，探針coxⅠ雜交結果除顯示1條主帶外，還分別在1.4 kb、18.0 kb出現(xiàn)1條弱帶，且3個材料表現(xiàn)一致，基因組中可能存在部分同源序列。（2）不育系與雜種一代一致、與保持系存在差異類型：atpA、nad6基因在3個材料中均表現(xiàn)為多拷貝，且所有的探針／酶組合雜交結果均存在差異條帶 （圖 3）。at-pA/EcoRⅠ雜交結果中，1條2.2 kb的條帶在3個材料中相同，另一條差異條帶在保持系中為4.8 kb， 在不育系和雜種一代中為 3.2 kb；atpA/HindⅢ差異條帶在保持系中為11.0 kb，在不育系和雜種一代中為14.8 kb；atpA/PstⅠ雜交結果中，差異條帶在保持系為10.2 kb，在不育系和雜種一代中為17.0 kb；atpA/SacⅠ雜交結果中，保持系比不育系及雜種一代缺失1條大小2.8 kb的條帶。nad6探針與所有酶的雜交結果均表現(xiàn)為保持系比不育系及雜種一代缺失 1～2條帶，nad6/EcoRⅠ缺失7.5 kb、1.3 kb條帶，nad6/HindⅢ缺失12.0 kb、2.8 kb條帶，nad6/HinfⅠ缺失1.0 kb條帶，nad6/PstⅠ缺失15.0 kb、9.2 kb條帶。這表明atpA、nad6基因在后代與母系中能夠穩(wěn)定地遺傳，而在父系中存在一定的差異。atp9表現(xiàn)為單拷貝，在EcoRⅠ消化作用下，3個材料的雜交結果均顯示了大小相同的雜交帶（4.3 kb），但保持系的條帶亮度明顯高于不育系及雜種一代。（3）保持系與雜種一代一致、與不育系存在差異類型：coxⅢ基因在3個材料中均表現(xiàn)為單拷貝，coxⅢ/EcoRⅠ在3個材料中的雜交結果均顯示1條2.5 kb的主帶，且在保持系與雜種一代中還顯示1條1.7 kb的弱帶（圖3）。（4）不育系與保持系一致、與雜種一代存在差異類型：nad3基因在3個材料中表現(xiàn)為多拷貝，且具有多態(tài)性 （圖3）；nad3/BamHⅠ的雜交信號顯示：在20.5 kb處，3個材料均有較強的雜交信號；13.0 kb處，不育系與保持系有較強的雜交信號，雜種一代的雜交信號很弱；9.5 kb處，不育系與保持系的雜交信號較強，而雜種一代沒有雜交信號。

3 討論

應用分子標記技術尋找細胞質雄性不育相關線粒體基因，是目前最為常用的方法。作為傳統(tǒng)的分子標記技術，RFLP結果可靠性強，是分析線粒體基因差異應用最廣泛的技術。本研究利用該技術篩選出了哈克尼西棉不育相關線粒體差異基因，而且在不育系、保持系、雜種一代3個材料間具有多態(tài)性，為棉花不育系相關線粒體基因的深入研究提供了重要基礎信息。但是這些差異是相對較為穩(wěn)定的DNA序列差異，且對差異序列的定位尚不精細，也尚未研究其在棉花中的時空表達差異，因此，需要對其進一步研究。一方面，可通過測定側翼序列，尋找差異位點，并開發(fā)出相應的分子標記，用于細胞質雄性不育系的改良及鑒定，輔助新品種選育；另一方面，可對差異基因進行表達分析，進一步揭示其與棉花細胞質雄性不育的關系。

表4 RFLP結果統(tǒng)計Table 4 Summary of RFLP patterns

圖3 線粒體基因atpA、coxⅢ、nad3、nad6 Southern雜交結果Fig.3 Southern blot results of mitochondrial geneatpA,coxⅢ,nad3 andnad6

由線粒體基因組復制而引起的內部重組或重排是序列獲得和缺失的主要原因，其中一些重組造成異常的ORF，這些ORF常與細胞質雄性不育有關。此外，植物線粒體基因產生功能蛋白通常需要RNA編輯過程，如果這種編輯發(fā)生在基因轉錄區(qū)內，可能導致基因轉錄本的變異，如轉錄本的提前終止或不能表達，導致基因的功能缺陷或喪失等，這也是造成不育的原因之一。線粒體作為植物的能量細胞器，在花粉發(fā)育中起至關重要的作用。線粒體atpA基因編碼腺苷三磷酸（Adenosine triphosphate，ATP）合酶亞基基因，ATP合酶參與線粒體膜上的腺苷二磷酸（Adenosine diphosphate，ADP）與Pi生成ATP，是能量形成的關鍵環(huán)節(jié)。nad6基因是線粒體內還原型輔酶Ⅰ（Reduced form of nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）脫氫酶亞基基因，NADH脫氫酶是1種氫傳遞體，把NADH轉變成煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 （Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+），釋放出游離的H+，在植物呼吸鏈中具有重要的作用[28]。atpA、nad6基因是植物線粒體序列突變相對較為活躍的基因[29-31]，如水稻線粒體35個蛋白的編碼基因存在26個單核苷酸多態(tài)性，其中nad6基因含有11個[32]。本研究結果中，不育系的atpA基因與nad6基因序列與保持系存在差異，這種差異可能導致ATP合酶、NADH脫氫酶亞基氨基酸組成序列或結構的變化，制約酶的功能發(fā)揮，從而影響花粉發(fā)育過程中的能量供應而導致敗育。由于核質互作效應，細胞色素氧化酶亞基基因coxⅢ與NADH脫氫酶亞基基因nad3有可能在恢復系核基因的調控下發(fā)生堿基改變，導致雜種一代coxⅢ、nad3基因與不育系存在差異。推測coxⅢ、nad3基因在雜種一代基因表達和生理代謝過程中有可能參與調控相關基因表達產物的功能修復，從而恢復雜種一代育性。當然，花粉發(fā)育是1個十分復雜的過程，涉及到特定基因的時空表達和多基因的調控，任何1個基因的結構或表達變化都可能引起花粉發(fā)育異常而導致雄性不育。因此，在棉花細胞質雄性不育的敗育機制和育性恢復機理方面，還需要開展更深入、更廣泛、更系統(tǒng)的分子生物學研究。

4 結論

據(jù)對哈克尼西棉細胞質雄性不育系、保持系、雜種一代的多態(tài)性研究推測，線粒體基因atpA、nad6、coxⅢ、nad3與細胞質雄性不育相關，atpA、nad6基因可能參與調控不育系的形成過程，coxⅢ、nad3基因可能受到恢復系核基因的調控，在不育系育性恢復機制中發(fā)揮較為重要的作用。

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Polymorphism Analysis of Mitochondrial Genes Associated Cytoplasmic Male Sterility in Cotton(Gossypium harknessiiBrandegee)

Gong Yangcang1,Zhang Xuelin1,Wu Jianyong2,Zhang Xingping1,Peng Fanjia1,Zhang Zhigang1,He Yunxin1, Mei Zhengding1,Zhou Degui1,Xing Chaozhu2*
(1.Hunan Cotton Research Institute,Changde,Hunan415101,China;2.State Key Laboratory of Cotton Biology/Institute of Cotton Research of the Chinese Academy of Agricultural Sciences,Anyang,Henan455000,China)

[Objective]Cytoplasmic male sterility (CMS)is closely associated with the mitochondrial genome.The aim of this study was to identify CMS-related mitochondrial genes in cotton.[Method]Ten mitochondrial gene probes(i.e.,atpA,atp6,atp9,cob,coxI,coxII,coxIII,nad3,nad6,andnad9)were used to analyze restriction fragment length polymorphisms in aGossypium harknessiiBrandegee cytoplasmic male sterile line(S),maintainer line(F),and hybrid(H).[Result]Ten probe/enzyme combinations for four probes(i.e.,atpA,coxIII,nad3,andnad6)revealed polymorphisms among lines S,F,and H.All enzyme digestions for two probes(i.e.,atpA andnad6)displayed the polymorphisms in three lines,with the same patterns for lines S and H.ForatpA,theEcoR I digestion revealed two fragments in the three lines.The 2.2 kb fragment was common to all three lines,while the second fragment was 3.2 kb in lines S and H,but 4.8 kb in line F.TheatpA/PstI combination produced a 17.0 kb fragment in lines S and H,but a 10.2 kb fragment in line F.Fornad6,one or two additional fragments of the same length were detected in lines S and H,while line F had more than two additional fragments.WithcoxIII as a probe,theEcoR I digestion resulted in a 2.5 kb fragment in three lines,as well as a 1.7 kb fragment in lines F and H,but not in line S.With thenad3 probe,the same patternswere observed for lines S and F,while the pattern for line H differed because of a lack of a 9.5 kb fragment.[Conclusion]BothatpA andnad6 are involved in regulating the development of CMS,whilecoxIII andnad3 may be regulated by nuclear genes to help restore fertility in cytoplasmic male sterile lines.

cotton;cytoplasmic male sterility;mitochondrial genes;restriction fragment length polymorphism

S562.03

A

1002-7807（2017）04-0327-09

10.11963/1002-7807.gycxcz.20170630

2016-07-04

鞏養(yǎng)倉 （1981―），男，副研究員，碩士，mksgyc@163.com。*通信作者：chaozhuxing@126.com

國家科技重大專項——轉基因生物新品種培育（2014ZX08005001-007）；國家科技支撐計劃——棉花種質資源發(fā)掘與創(chuàng)新利用（2013BAD01B03-05）