王葉，謝家建，黃春蒙，彭于發(fā)

（中國農業(yè)科學院植物保護研究所／植物病蟲害生物學國家重點實驗室／農業(yè)部轉基因環(huán)境安全及植物抗性監(jiān)督檢驗測試中心（北京），北京100193）

轉cry1Aa基因抗蟲棉整合結構解析及轉化體特異性檢測方法的建立

王葉，謝家建*，黃春蒙，彭于發(fā)

（中國農業(yè)科學院植物保護研究所／植物病蟲害生物學國家重點實驗室／農業(yè)部轉基因環(huán)境安全及植物抗性監(jiān)督檢驗測試中心（北京），北京100193）

【目的】cry1Aa基因是2011年本實驗室在我國棉花商品種子中發(fā)現的1種未經批準的轉基因成分，本研究旨在通過整合結構解析，建立特異性檢測方法，對市售棉種進行初測，明確該外源基因在我國棉種中的存在情況?！痉椒ā客ㄟ^Genome walking、長鏈PCR分離獲得了轉cry1Aa基因棉花轉化體（定名為NN6轉化體，簡稱NN6）的外源基因整合結構，同時基于插入位點基因組及外源DNA連接區(qū)，建立了NN6轉化體特異性的定性聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction，PCR）方法和實時熒光定量PCR方法?！窘Y果】NN6整合結構主要包括cry1Aa、aad和NptII基因，插入棉花基因組7號染色體37 169 450位，產生91 bp基因組缺失；所構建的定性PCR檢測方法能特異、快速地對棉花單株和種子單粒中NN6轉化體的純／雜合狀態(tài)進行鑒定，實時熒光定量PCR檢測限為44拷貝，能滿足國內外對轉基因標識的需要；對含有cry1Aa基因的3個市售棉種進行檢測，其純合度分別為1.51%，5.21%和21.09%?！窘Y論】本研究解析了NN6的整合結構，并建立特異性檢測方法，為我國轉基因棉花新品種選育及轉基因安全管理提供技術手段。

轉基因棉花；NN6轉化體；cry1Aa基因；定性PCR；定量PCR

棉花是重要的經濟作物，是繼轉基因玉米和大豆之后的第三大轉基因作物，轉基因棉花在我國已經有20年的種植歷史。盡管近年我國棉花種植面積有所下降，但轉基因棉花種植比例卻保持在95%以上[1]。當前我國大面積推廣的轉基因抗蟲棉品種主要包括含cry1Ab/Ac融合基因的國抗系列、中棉所系列以及由孟山都公司研發(fā)cry1Ac基因的MON531及其衍生品種。此外，我國還批準抗蟲的MON15985（轉cry1Ac和cry2Ab基因）、COT102（轉vip3Aa基因），耐除草劑的MON88913、1445、GHB614、LLCotton25以及抗蟲耐除草劑的GHB119、T304等轉基因棉花進口作為加工原料[2-4]。2011年孫爻等在我國棉花種子中發(fā)現了 1種含有cry1Aa基因的新轉基因成分，建立了cry1Aa基因表達盒特異性檢測方法[5]。2013年該檢測方法被確定為國家檢測標準[6]，并作為我國轉基因棉花安全性評價過程中篩查未批準轉基因成分的方法之一。這種含有cry1Aa基因的轉基因棉花在國外批準商業(yè)化的轉基因棉花中未見報道，其轉基因整合結構并不十分清楚，轉化體特異性的檢測方法也尚無報道。

轉化體特異性檢測是基于受體基因組和外源基因連接區(qū)域序列所構建的方法，較篩查檢測、基因檢測和構建檢測具有更高的特異性，用于轉基因轉化體的身份鑒定，廣泛運用于多種轉基因作物的特異性檢測[7]。在轉基因棉花中，已經建立了多個材料的轉化體特異性檢測方法。汪巧等分離我國轉基因抗蟲棉鄂雜棉1號的旁側序列，并建立其轉化體特異性定性PCR（Polymerase chain reaction）檢測方法[8]；楊陽等獲得了轉基因棉花MON757整合結構，并建立轉化體特異性的純／雜合PCR方法和實時熒光定量PCR檢測方法[9]；汪秀秀等建立抗蟲耐除草劑棉花GHB119品系特異性定量PCR檢測方法[10]；Yang等構建了適用于耐除草劑轉基因棉花MON1445和抗蟲轉基因棉花MON531的雙重PCR檢測方法[11]；Jiang等針對MON15985轉基因棉花及其衍生物構建了定性、定量PCR方法[12]。

通過轉基因產生的不同轉化體在宿主基因組的存在狀態(tài)與物種的基因型分類類似，可分為3種類型：純合體、雜合體、非轉基因。及時、快速、準確鑒定轉化體的純／雜合狀態(tài)，是轉基因品種培育的重要基礎之一?；谵D化體插入位點兩側基因組及外源DNA序列，構建純／雜合鑒定方法，不僅省時省力，而且能充分利用子代的寶貴資源[13]。本研究通過染色體步移 （Genome walking）、長鏈PCR等方法，在cry1Aa基因序列的基礎上進一步分離獲得了NN6轉化體的整合結構全長序列。在此基礎上建立了特異性的純／雜合定性PCR方法和實時熒光定量PCR檢測方法，并對部分陽性樣品的轉基因純合度進行了初步分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

含有cry1Aa基因的南農6號F1種子材料2010年購于江蘇省市場[5]。為了獲得純合、雜合、非NN6種子材料，2011年起種植于中國農業(yè)科學院植物保護研究所廊坊試驗基地，自交繁殖留種，通過子代cry1Aa基因的分離情況分析親代的純/雜合狀態(tài)，若子代不發(fā)生分離，則親代為純合，若發(fā)生分離則為雜合。測試材料異優(yōu)7號F1、泗優(yōu)1號、路棉6號F1（均為商品名）等40個轉基因棉種分別購自湖北省、江西省棉花種子市場。

1.2 DNA提取

參考轉基因植物及其產品成分檢測抽樣標準[14]，在0.5%（質量分數）的檢出限上，定量測試樣品異優(yōu)7號F1、泗優(yōu)1號和路棉6號F1，分別隨機取樣600粒，充分研磨、混勻；棉花單株葉片組織或單粒種子樣品，則分別置于2.0 mL離心管，用組織研磨儀充分研磨。按照植物基因組DNA提取試劑盒操作手冊提取棉花種子或葉片基因組DNA，經瓊脂糖凝膠電泳 （膠質量分數1.2%，1×TAE緩沖液）檢測DNA完整性，采用Thermo Scientific NanoDrop2000微量分光光度計測定其純度和濃度。

1.3 NN6轉化體整合結構解析

根據已報道的MON531整合結構及cry1Aa基因構建，參照蘇長青等[15]結構解析方法，按以下步驟獲得 NN6轉化體的整合結構：（A）采用Genome walking方法分離獲得了整合結構的5'端基因組旁側序列；（B）采用長鏈PCR方法獲得3'端旁側序列和結構；（C）通過PCR測序法測定和驗證內部整合結構。

1.4 定性PCR檢測方法的建立

基于轉化體插入位點基因組及外源DNA片段，在5'端、3'端棉花基因組分別設計上游引物NN6-GF、下游引物NN6-GR，在轉基因插入序列5'端設計下游引物NN6-TR（圖1），由3條引物組成雙重PCR（引物由Primer Premier 6.0設計，序列見表1）。PCR反應體系為20 μL，其中GoTaq?GreenMaster Mix10 μL，7 μL ddH2O，引物各1 μL（10 μmol·L－1），DNA模板1 μL。PCR反應程序：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)，72℃10 min，經瓊脂糖凝膠電泳檢測目的擴增 （膠質量分數1.5%，1×TAE緩沖液）。

圖1 NN6轉化體檢測引物和序列示意圖Fig.1 Diagram of primer/probe and sequence used in the detection of NN6 event

表1 定性、定量PCR檢測引物/探針信息Table 1 Primer/probe information for qualitative and quantitative PCR detection

在苗期單株取樣，提取基因組DNA，運用建立的定性PCR方法鑒定NN6轉化體的純、雜合情況。選擇雜合單株，經單花自交后，收獲子代種子，隨機選取30粒種子，分析其NN6轉化體純合、雜合分布情況。

采用孫爻等的方法[5]對2015年從湖北省、江西省收集40份棉花種子進行鑒定，其中有3個含有cry1Aa基因構建成分：異優(yōu)7號F1、泗優(yōu)1號和路棉6號F1。3份棉花材料各隨機抽取60粒種子，單粒提取DNA，以定性PCR方法分別鑒定其NN6轉化體的純合／雜合狀態(tài)，參照國家標準[16]計算NN6轉化體的轉基因純合度（C）。公式：C=（N1+N2/2）/60×100%.式中，N1為純合NN6轉化體數量，N2為雜合NN6轉化體數量。

實踐性教學就是要求教師構建自己的教學理論，將自己的實踐理論化，在實踐中不斷完善和發(fā)展。實踐性的核心是教師的職業(yè)敏感性。教學是一個動態(tài)的過程，隨著經濟社會發(fā)展不可能一成不變。在教師的日常教學中，教師應當能夠將教學實踐理論化，將教學理論實踐化[5]。外語教學專家要尊重教師積累的經驗，并鼓勵教師觀察、反思自己的教學過程，將教學理論付諸于實踐的同時發(fā)掘自己的教學潛力。

1.5 實時熒光定量PCR檢測方法的建立

體系與程序：在NN6轉化體的5'端基因組與外源 DNA連接區(qū)設計特異性引物對NN6-QF/NN6-QR以及探針NN6-QP（序列見表1），探針5'端標記FAM（Carhoxy fluorescein）熒光基團，3'端標記BHQ-1（Black hole quencher 1）熒光猝滅基團。棉花內標準基因ACP1基因特異性引物對ACP-QF/ACP-QR和探針ACP-QP參照國家標準[17]，探針5'端標記HEX（Hexachloro fluorescein）熒光基團，3'端標記BHQ-1熒光猝滅基團。反應體系為 20 μL：2×Premix ExTaqTMmix10 μL，ddH2O 6.1 μL，正反向引物各1 μL（10 μmol·L－1），探針 0.5 μL （10 μmol·L－1），ROX Reference Dye 0.4 μL，模板DNA 1 μL。熒光定量PCR反應采用兩步法進行，程序為：95℃預熱2 min，95℃變性5 s,60℃退火延伸34 s，40個循環(huán)，熒光信號于60℃收集。

標準曲線構建參照楊陽等[9]關于MON757轉化體的報道，將純合NN6轉化體DNA用ddH2O稀釋為5個質量濃度梯度，分別為100、10、1、0.5和0.1 mg·L－1。按照 100 ng棉花基因組折合44 000拷貝計算，每微升梯度樣品對應的拷貝數為44 000、4400、440、220、44。以DNA模板拷貝數對數值為橫坐標，以循環(huán)閾值（Cycle threshold value，Ct）為縱坐標建立NN6轉化體及棉花內標準基因ACP1的標準曲線。

采用建立的實時熒光定量PCR檢測方法對3個陽性材料進行NN6轉化體的純合度測定，設置3次重復，計算標準差和相對標準差。由于在棉花基因組中ACP1基因的拷貝數為2[17]，所以樣品中棉花基因組拷貝數為ACP1基因拷貝數的一半。因此，按照以下公式計算NN6轉化體的純合度（C）：C=（P1×2/P2）×100%.式中P1為NN6轉化體拷貝數，P2為ACP1基因拷貝數[17]。

2 結果與分析

2.1 NN6轉化體的整合結構

從南農6號F1獲得NN6轉化體整合位點全長 序 列 為 12 045 bp （GenBank登 錄 號 ：KY348841），外源DNA插入到棉花基因組7號染色體37 169 450位，造成棉花基因組插入位點91 bp DNA缺失。采用Genome walking獲得5'端旁側序列，包含213 bp棉花基因組序列（位于37 169 238～37 169 450）及88 bp右邊界（Right border，RB）；運用長鏈PCR方法測定載體重組區(qū)域的3'端旁側序列,包括位于37 169 541～37 171 328的棉花基因組及T-DNA左邊界（Left border，LB）序列；經克隆測序、比對拼接獲得NN6整合結構，由cry1Aa基因、3'(9)-O-氨基糖苷腺苷?；D移酶基因（aad）和新霉素磷酸轉移酶基因（nptⅡ）以單拷貝閱讀框組成完整T-DNA，三者分別由380bp和75bp的FillerDNA依次連接（圖2）。

圖2 NN6轉化體插入位點全序列測定示意圖Fig.2 Schematic diagram of whole insertion sequence analysis for NN6 event

2.2 定性PCR檢測方法

在不同區(qū)域設計引物組合，通過純合、雜合、非 NN6的 棉 種 測 試 發(fā) 現 引 物 NN6-GF/NN6-TR/NN6-GR能有效地鑒別出NN6轉化體的純／雜合狀態(tài)（圖3）。其中NN6純合體擴增產生221 bp的單一條帶，NN6雜合體單株擴增產生221 bp和162 bp的2條帶，不含NN6轉化體的個體擴增產生162 bp的單一條帶。

圖3 NN6轉化體定性PCR檢測方法Fig.3 Qualitative PCR method for NN6 event

苗期對田間單株定性PCR鑒定表明，12個單株包含NN6轉化體的3種核酸類型：純合NN6、雜合NN6、非NN6（圖4），這一結果與通過后代種子分離比鑒定結果相一致。雜合單株單花自交種子檢測表明，30粒種子中含有純合NN6轉化體4粒、雜合NN6轉化體18粒、不含NN6轉化體9粒（圖5），說明該方法能準確、快速地鑒定自交后代純合、雜合分離情況。這表明所建純／雜合定性PCR檢測方法在田間單株篩選和單粒檢測有較好的適用性。

圖4 苗期單株的NN6轉化體定性PCR檢測Fig.4 Evaluation of single seedling using qualitative PCR method of NN6 event

圖5 30粒雜合NN6自交單粒鑒定結果Fig.5 Identification of 30 self-pollinated seeds of heterozygous NN6 cotton

對2015年從湖北省和江西省購入的40份轉基因棉種600?；鞓予b定發(fā)現，有3個品種中含有NN6轉化體，分別為異優(yōu)7號F1、泗優(yōu)1號和路棉6號F1。3個棉種60粒種子定性PCR檢測表明，所構建的PCR檢測方法能快速鑒定單粒種子中NN6轉化體的純／雜合狀態(tài)。通過轉基因純合度公式計算表明，3個轉基因棉種中NN6轉化體純合度分別為1.67%，5.00%和15.00%（表2）。

表2 3個轉基因棉花品種中單粒定性檢測分析Table 2 Qualitative PCR assay for single seeds in three transgenic cotton varieties

2.3 實時熒光PCR方法

實時熒光定量PCR檢測方法的構建參照楊陽等[9]的報道，以NN6轉化體基因組DNA為模板，設置3次平行下的5個濃度梯度，建立的棉花內標準基因ACP1基因標準曲線的線性回歸方程為：y=－0.288 8x+11.625 8，R2=0.999 4，擴增效率E=94.45%（圖6-A），其中y為拷貝數的常用對數，x為Ct值。建立NN6轉化體標準曲線的線性回歸方程為y=－0.296 1x+11.713 8，R2= 0.998 3，擴增效率E=97.75%（圖6-B），以上2項數據均符合轉基因定量檢測相關準則（R2≥0.98；120%≥E≥80%）。NN6轉化體擴增曲線圖表明，該定量PCR方法在44拷貝水平的平均Ct值為34.040 5，相對標準差（Relative standard deviation）為0.21%，所建定量方法在44拷貝以上即可對目標DNA進行準確定量。該閾值折合成質量分數為0.1%（以體系加入100 ng基因組DNA計算），完全能夠滿足目前國際上轉基因標識需要[18]。該方法的建立，一方面適用于田間單株或單粒種子的定性篩選，另一方面可對棉花混樣或初加工品中NN6轉化體進行準確定量，較定性PCR方法具有更廣泛的適用性。因此，該熒光定量PCR方法適用于NN6轉化體定量檢測。

采用所構建的實時熒光定量PCR方法檢測2015年湖北省和江西省3份含有cry1Aa基因棉種的NN6轉化體純合度，結果表明NN6轉化體純合度依次為1.51%，5.21%和21.09%，相對標準差分別為3.12%，1.49%和2.43%（表3），均在轉基因檢測的接受閾值（25%）內，這一定量結果與60單粒定性PCR檢測所折合的純合度結果相近。

3 討論

整合結構是轉基因作物分子特征的重要內容，是其轉基因生物安全性評價“個案分析”和建立其特異性檢測方法的分子基礎。本研究在前期檢測到cry1Aa基因棉花材料的基礎上，分離獲得了NN6轉化體的完整外源基因整合結構，為其檢測溯源和安全性評價提供了重要的技術資料。從NN6轉化體整合的T-DNA結構看，基因元件的組成、順序和載體骨架構成等與孟山都公司的MON531轉化體非常類似，推測NN6轉化體采用與MON531轉化體相同的載體構建而成，只是抗蟲基因不同。NN6轉化體整合的T-DNA左右邊界相對完整，推測其是通過農桿菌方法轉化而來的。

轉基因在生物體基因組中的存在表現為純合、雜合2種狀態(tài)，不同狀態(tài)下可能呈現出外源蛋白的差異表達及表型變化[19]。本研究針對NN6轉化體建立了純／雜合檢測的定性PCR方法，不僅適用于田間單株、種子單粒純／雜合鑒定，也適用于轉基因抗蟲棉的品系鑒定。目前含有NN6轉化體的抗蟲棉在我國尚未獲得安全審批，在國外已經批準的轉基因棉花中也未見報道。目前構建cry1Aa基因特異性檢測方法也已列入安全評價篩查，因此本研究建立的轉化體特異性的定性PCR檢測方法能更進一步地提高篩查的特異性和溯源。

本研究對2015年湖北省、江西省上市的轉基因棉花種子抽樣鑒定結果表明，40個材料中有3個檢出含有cry1Aa基因，相比于2011年孫爻等[5]的鑒定結果，含cry1Aa基因材料的比例有所下降，這表明將其列入轉基因成分篩查這一管理措施取得了一定的效果。從3個陽性棉種中NN6轉化體純度來看，NN6轉化體均處于較低水平，可能是由于育種親本的不同程度污染造成的轉基因混雜，因此在育種環(huán)節(jié)對親本加強檢測力度才能有效控制源頭。

圖6 實時熒光定量PCR擴增曲線和標準曲線Fig.6 Amplification plot and standard curves of real-time PCR assay

表3 3個轉基因棉花品種NN6轉化體的定量檢測Table 3 Quantitative PCR assay of NN6 event in three transgenic cotton varieties

4 結論

以市場轉基因棉種為材料分離獲得NN6轉化體，通過Genome walking、長鏈PCR分別解析其5'端、3'端基因組旁側序列，經克隆、測序、拼接獲得完整整合結構，包括cry1Aa、aad和nptⅡ基因?；诓迦胛稽c基因組及外源DNA連接區(qū)，建立NN6轉化體特異性的定性、定量PCR檢測方法，通過定性PCR可實現田間單株或單粒種子純／雜合鑒定，加快育種進程；定量PCR檢測下限為44拷貝，可在此水平上實現轉基因棉花混樣或初加工品的定量檢測。運用本研究建立的檢測方法對市場棉種進行初測，在3個轉基因棉種中獲得目的擴增，其純合度為1.51%～21.09%。NN6轉化體的結構解析和檢測方法構建，可為我國轉基因棉花新品種選育及轉基因安全管理提供技術手段。

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Integrated Structure of the Modifiedcry1Aa Gene in Cotton and Its Event-Specific Detection

Wang Ye,Xie Jiajian*,Huang Chunmeng,Peng Yufa
(Institute of Plant Protection,Chinese Academy of Agricultural Sciences/State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests/Inspection Test Center for Environmental Safety of Transgenic Crops and Plant Resistance(Beijing),Ministry of A-griculture,Beijing100193,China)

[Objective]We detected a modifiedcry1Aa gene in a Chinese cotton line in 2011.The objectives of this study were to establish a specific detection method applicable for commercial cotton varieties by integrating the results of structural analyses and to confirm the existence of the exogenous gene in cotton.[Method]The integrated structure of the modifiedcry1Aa gene (NN6)was determined by genome walking and a long-chain polymerase chain reaction(PCR).An event-specific qualitative PCR and a quantitative real-time PCR were established based on the linkage region between genomic DNA and the exogenous DNA of NN6.[Result]The NN6 structure mainly comprised thecry1Aa,aad,andnptII genes,which had been inserted into chromosome 7 at position 37 169 450,with a 91 bp deletion in the genome.The highly sensitive qualitative PCR was able to quickly identify the heterozygous and homozygous NN6.The limit of detection for the NN6-specific quantitative real-time PCR was 44 copies,which satisfied the requirements for analyzing Chinese and international cotton varieties.The seeds of three commercial cotton varieties carrying thecry1Aa gene were tested,with a resulting purity of 1.51%,5.21%,and 21.09%.[Conclusion] We analyzed the integrated structure of NN6 and established a specific detection method that may be useful for ensuring transgenic cotton can be bred safely in China.

transgenic cotton;NN6 event;cry1Aa gene;event-specific qualitative PCR;quantitative real-time PCR

S562.035

A

1002-7807（2017）04-0307-09

10.11963/1002-7807.wyxjj.20170628

2016-12-26

王葉(1993―)，男，碩士，1038580458@qq.com。*通信作者：jjxie@ippcaas.cn

國家科技重大專項——轉基因生物新品種培育(2016ZX08012-002)