黃珊，王修俊*，范志平，沈暢萱

（1.貴州大學發(fā)酵工程與生物制藥省級重點實驗室，貴州貴陽550025；2.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽550025；3.貴州大學化學與化工學院，貴州貴陽550025）

復合菌劑對辣椒發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量的影響

黃珊1，2，王修俊1，2*，范志平1，3，沈暢萱1，2

（1.貴州大學發(fā)酵工程與生物制藥省級重點實驗室，貴州貴陽550025；2.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽550025；3.貴州大學化學與化工學院，貴州貴陽550025）

以新鮮辣椒為原料，將從泡菜中分離出來的優(yōu)勢菌株制備成復合菌劑，研究自然發(fā)酵和復合菌劑發(fā)酵對發(fā)酵辣椒中亞硝酸鹽含量的影響。在單因素試驗的基礎上，通過正交試驗確定最佳生產(chǎn)工藝參數(shù)。結果表明，最佳工藝條件為食鹽質量分數(shù)4%，蔗糖質量分數(shù)1%，復合菌劑接種量6%，發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵時間72 h。在此條件下，發(fā)酵辣椒的亞硝酸鹽含量為1.21 mg/kg，與自然發(fā)酵辣椒相比，成熟期由168 h縮短為72 h，亞硝酸鹽含量由3.94 mg/kg下降至1.21 mg/kg，不僅縮短了發(fā)酵周期且提高了產(chǎn)品的食用安全性。

發(fā)酵辣椒；自然發(fā)酵；復合菌劑；亞硝酸鹽

發(fā)酵辣椒作為泡菜的一種，是新鮮辣椒經(jīng)過含有調料的一定濃度的食鹽水浸漬之后并通過以乳酸菌為主導發(fā)酵而成的傳統(tǒng)發(fā)酵制品[1-3]，以其獨特的口感風味受到許多人的喜愛，同時也增加了辣椒的附加值，推動經(jīng)濟的發(fā)展。

我國泡菜加工歷史悠久，傳統(tǒng)泡菜是以自然發(fā)酵為主，高度依賴發(fā)酵過程中自然存在的乳酸菌[4]。但在其加工過程中，參與作用的微生物種類繁多，發(fā)酵時間過長，產(chǎn)品質量不穩(wěn)定，同時蔬菜中高含量的硝酸鹽[5-8]，在有害微生物及其硝酸鹽還原酶的作用下，可以在發(fā)酵過程中將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，導致產(chǎn)品中亞硝酸鹽含量高[9-12]，最終使泡菜的品質、食用安全性及口感受到極大的影響，嚴重制約了泡菜的生產(chǎn)與銷售[13-14]，其中亞硝酸鹽是一種毒性很強的致癌物，易與胺合成一種致癌物亞硝胺[15-18]，廣泛引起人們的關注。因此如何能使發(fā)酵過程可控化，縮短發(fā)酵周期、提高產(chǎn)品質量穩(wěn)定性、減少發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽含量，已成為了國內(nèi)外學者的研究重點。

ANNA M等[19-21]研究表明，傳統(tǒng)的蔬菜發(fā)酵模式已經(jīng)不能滿足其發(fā)展趨勢，取而代之的將是一次性直投式粉末發(fā)酵劑。袁亞等[22-24]研究表明，乳酸菌純種發(fā)酵可以有效解決發(fā)酵周期長、亞硝酸鹽含量高的問題。接種純種乳酸菌發(fā)酵辣椒，能加速優(yōu)勢菌群的形成，抑制有害微生物的繁殖，同時乳酸菌可以降解部分亞硝酸鹽，從而減少亞硝酸鹽的產(chǎn)生，最終縮短生產(chǎn)周期，提高生產(chǎn)效率，保障產(chǎn)品食用安全性和質量穩(wěn)定性，改善產(chǎn)品的品質及口感。

本實驗通過研究自然發(fā)酵和復合菌劑發(fā)酵對辣椒制品中亞硝酸鹽含量的影響，以及食鹽含量、蔗糖含量、復合菌劑接種量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間對復合菌劑發(fā)酵辣椒生產(chǎn)中亞硝酸鹽含量的影響，利用單因素和正交試驗優(yōu)化工藝，確定最佳生產(chǎn)工藝參數(shù)，旨在為發(fā)酵辣椒大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)，提高產(chǎn)品食用安全性和質量穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮辣椒：貴陽市花溪區(qū)吉林村農(nóng)貿(mào)市場；白砂糖（食品級）：武漢成達食品有限公司；食鹽（食品級）：四川久大制鹽有限公司；復合菌劑：腸膜明珠串菌（Leuconostoc mesenteroides）C6，腸膜明珠串菌（Leuconostoc mesenteroides）B2，植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）G3，菌種比例為C6∶B2∶G3=1∶1∶1，由貴州大學發(fā)酵工程與生物制藥省級重點實驗室提供。

1.2 儀器與設備

FA1004電子精密天平：上海良平儀表有限公司；SPX-150C恒溫恒濕培養(yǎng)箱：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；泡菜壇：四川省瀘縣海羅玻璃廠；LS-1F凈化工作臺：上海索普儀器有限公司；XFS-280A手提式壓力蒸汽滅菌鍋：浙江新豐醫(yī)療器械有限公司；722S分光光度計：上海精密科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵辣椒的工藝流程及操作要點

操作要點：挑選顏色均一、無機械損傷、大小均勻、無病蟲害、成熟度均一（8成熟）的新鮮辣椒。在去梗過程中保證辣椒的完整性，然后用流動水清洗2～3遍，晾干辣椒表面的水后與食鹽、蔗糖等混勻后立即裝壇。泡菜壇應經(jīng)檢驗無泄漏、破損，洗凈消毒備用。發(fā)酵過程中要隨時注意發(fā)酵壇的密封性，同時每隔24h測定發(fā)酵液中亞硝酸鹽含量。

1.3.2 發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗設計

（1）食鹽含量對亞硝酸鹽含量的影響

選用1%、3%、5%、7%、9%五個不同的鹽含量，蔗糖含量為1%，復合菌劑接種量為4%，發(fā)酵溫度為30℃，分別在0、24h、48h、72h、96h和120h測定發(fā)酵液中亞硝酸鹽含量。

（2）蔗糖含量對亞硝酸鹽含量變化的影響

選用0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%五個不同的蔗糖含量，食鹽含量為4%，復合菌劑接種量為4%，發(fā)酵溫度為30℃，分別在0、24 h、48 h、72 h、96 h和120 h測定發(fā)酵液中亞硝酸鹽含量。

（3）復合菌劑接種量對亞硝酸鹽含量的影響

選用1%、3%、5%、7%、9%五個不同的復合菌劑接種量，食鹽含量為4%，蔗糖含量為1%，發(fā)酵溫度為30℃，分別在0、24 h、48 h、72 h、96 h和120 h測定發(fā)酵液中亞硝酸鹽含量。

（4）發(fā)酵溫度對亞硝酸鹽含量的影響

選用24℃、27℃、30℃、33℃、36℃五個不同的溫度，食鹽含量為4%，蔗糖含量為1%，復合菌劑（腸膜明珠串菌C6∶腸膜明珠串菌B2∶植物乳桿菌G3=1∶1∶1，）接種量為4%，分別在0、24 h、48 h、72 h、96 h和120 h測定發(fā)酵液中亞硝酸鹽含量。

（5）發(fā)酵時間對亞硝酸鹽含量的影響

選用24 h、48 h、72 h、96 h、120 h五個不同的時間，食鹽含量為4%，蔗糖含量為1%，復合菌劑接種量為4%，發(fā)酵溫度為30℃，測定發(fā)酵液中亞硝酸鹽含量。

1.3.3 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗設計

為了研究各影響因素對復合菌劑發(fā)酵辣椒工藝的影響，優(yōu)選出最佳辣椒發(fā)酵工藝參數(shù)條件，在單因素試驗的基礎上，選取食鹽含量（A）、蔗糖含量（B）、接種量（C）、發(fā)酵溫度（D）和發(fā)酵時間（E）5個因素，選用L16（45）正交設計，以亞硝酸鹽含量為考察指標，對復合菌劑發(fā)酵辣椒的工藝條件進行優(yōu)化。正交試驗因素與水平見表1。

表1 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation technology optimization

1.3.4 測定方法

發(fā)酵辣椒中的亞硝酸鹽的測定采用分光光度計法，參照食品安全國家標準GB/T 5009.33—2010《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中的鹽酸萘乙二胺比色法測定發(fā)酵辣椒中的亞硝酸鹽含量[25]。亞硝酸鹽標準曲線的制作：準確稱取0.100 0 g亞硝酸鈉，加水移入1 000 mL容量瓶，加水稀釋至刻度，混勻。吸取上述10 mL亞硝酸鈉標準溶液，置于100 mL容量瓶，加水稀釋至刻度。然后取0、0.10 mL、0.20 mL、0.30 mL、0.40 mL、0.50 mL亞硝酸鈉標準使用液，分別置于50 mL的帶塞比色管中，分別加入2 mL對氨基苯磺酸溶液，混勻，放置3～5 min，加入1 mL鹽酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混勻，靜置15 min，于波長538 nm處測定吸光度值。以亞硝酸鈉標準曲線回歸方程，計算發(fā)酵辣椒中的亞硝酸鹽含量。

2 結果與分析

2.1 亞硝酸鹽標準曲線的繪制

以亞硝酸鈉含量（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，繪制的亞硝酸鹽標準曲線，結果見圖1。由圖1可知，亞硝酸鹽標準曲線的回歸方程為y=0.775 3x+0.004 3，相關系數(shù)R2=0.999 2，表明二者線性關系良好。2.2自然發(fā)酵辣椒中亞硝酸鹽含量變化

圖1 亞硝酸鹽標準曲線Fig.1 Standard curve of nitrite

將辣椒按照上述1.3.1的發(fā)酵辣椒的工藝流程進行發(fā)酵。選擇食鹽含量為4%，蔗糖含量為1%，發(fā)酵溫度為30℃進行自然發(fā)酵。其亞硝酸鹽含量變化結果見圖2。由圖2可知，在0～48 h內(nèi)隨時間增加，亞硝酸鹽含量逐漸增大，在發(fā)酵48 h時達到亞硝酸鹽峰，峰值為7.68 mg/kg，然后隨著時間增加亞硝酸鹽含量逐漸減少，到成熟期（pH在3.4左右）即168 h時亞硝酸鹽含量約為4 mg/kg，隨后基本保持平衡狀態(tài)。其主要原因是自然發(fā)酵初期，由于氧氣存在，導致雜菌的快速生長代謝，將泡菜中的硝酸鹽轉化為亞硝酸鹽。因此，亞硝酸鹽含量在初期時會逐步增加。但隨著微生物代謝活動的持續(xù)，氧氣被消耗殆盡，此時有利于泡菜中乳酸菌的生長，同時抑制了其他微生物的生長，使乳酸菌成為優(yōu)勢微生物，降解亞硝酸鹽，導致亞硝酸鹽含量下降。發(fā)酵后期，隨著乳酸菌的生長代謝，發(fā)酵液中的乳酸堆積，抑制了發(fā)酵菌株的生長，使得亞硝酸鹽含量保持平衡狀態(tài)。

圖2 自然發(fā)酵辣椒亞硝酸鹽含量隨時間的變化Fig.2 Change of nitrite content with time of natural fermented chili

2.3 單因素試驗結果

2.3.1 食鹽含量對復合菌劑發(fā)酵辣椒中亞硝酸鹽含量的影響

考察不同的食鹽含量對發(fā)酵辣椒中的亞硝酸鹽含量的影響，結果見圖3。由圖3可知，在0～24 h隨著時間的增加，不同食鹽含量發(fā)酵辣椒中的亞硝酸鹽含量都在增加，且食鹽含量越高，亞硝酸鹽含量增加得越快，且都在24 h左右到達頂峰隨后減少，這是由于食鹽的添加，抑制部分雜菌生長代謝，減少了硝酸鹽還原酶的生成，阻斷了亞硝酸鹽的形成。同時添加了復合菌劑，使得菌株在短時間內(nèi)迅速成為發(fā)酵的優(yōu)勢菌株，促進了亞硝酸鹽的降解。使得與自然發(fā)酵相比，亞硝酸鹽含量的峰值提前到來。食鹽濃度越高，最后平衡時亞硝酸鹽含量越高。食鹽含量在1%、3%和5%時都能使發(fā)酵辣椒在72 h后亞硝酸鹽含量＜1.7 mg/kg，而食鹽含量為7%、9%時，其最后的產(chǎn)品中亞硝酸鹽含量過高，主要可能是由于食鹽含量過高，發(fā)酵辣椒中微生物的生命活動受到抑制，導致對亞硝酸鹽的降解量變小，也有可能是有害微生物將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，導致亞硝酸鹽增加[5-8]?？紤]到最終產(chǎn)品中亞硝酸鹽含量，選擇食鹽含量3%較為適宜。

圖3 食鹽含量對發(fā)酵辣椒亞硝酸鹽含量的影響Fig.3 Effect of salt concentration on nitrite content of fermented chili

2.3.2 蔗糖含量對復合菌劑發(fā)酵辣椒中亞硝酸鹽含量的影響

考察不同的蔗糖含量對發(fā)酵辣椒中的亞硝酸鹽含量的影響，結果見圖4。由圖4可知，不同蔗糖含量發(fā)酵辣椒中的亞硝酸鹽含量都在24 h左右到達頂峰。主要因為在發(fā)酵初期，發(fā)酵系統(tǒng)中酸性環(huán)境尚未形成，不能抑制雜菌的生長代謝，導致蔬菜中硝酸鹽被還原，引起亞硝酸鹽含量升高，但是添加的乳酸菌，在蔗糖的促進下迅速生長成為優(yōu)勢菌株，產(chǎn)生大量有機酸，加快了亞硝酸鹽的降解。與自然發(fā)酵相比，亞硝酸鹽含量的峰值提前到來。蔗糖含量0.5%～1.0%時，隨著蔗糖含量的逐漸升高，最終產(chǎn)品中亞硝酸鹽含量越低。可能是隨著蔗糖含量的增大，對發(fā)酵菌株的生長繁殖促進作用越強，使得菌株在短時間內(nèi)迅速成為發(fā)酵的優(yōu)勢菌株，從而促進了亞硝酸鹽的降解，蔗糖含量在1.5%～2.5%時，隨著蔗糖含量的逐漸升高，最終產(chǎn)品中亞硝酸鹽含量越高，可能是蔗糖含量的增大，抑制了發(fā)酵菌株的生長，從而減少了對亞硝酸鹽的降解，同時高蔗糖濃度，為其他有害微生物提供了養(yǎng)分，使其開始生長代謝，把發(fā)酵液中的硝酸鹽轉化為亞硝酸鹽，導致亞硝酸鹽有所增加?？紤]亞硝酸鹽含量選擇蔗糖含量1%較為適宜。

圖4 蔗糖含量對發(fā)酵辣椒亞硝酸鹽含量的影響Fig.4 Effect of sucrose concentration on nitrite content of fermented chili

2.3.3 復合菌劑接種量對復合菌劑發(fā)酵辣椒中亞硝酸鹽含量的影響

圖5 接種量對發(fā)酵辣椒亞硝酸鹽含量的影響Fig.5 Effect of inoculum on nitrite content of fermented chili

考察不同的復合菌劑接種量對發(fā)酵辣椒中的亞硝酸鹽含量的影響，結果見圖5。由圖5可知，不同復合菌劑接種量發(fā)酵辣椒中的亞硝酸鹽含量都在24 h左右到達頂峰。主要因為在發(fā)酵初期，大量雜菌的生長代謝，導致蔬菜中硝酸鹽被還原，引起亞硝酸鹽含量升高。隨著添加的復合菌劑迅速生長成為優(yōu)勢菌株，產(chǎn)生大量有機酸，加快了亞硝酸鹽的降解。使得與自然發(fā)酵相比，亞硝酸鹽含量24 h左右到達頂峰。隨著復合菌劑接種量逐漸增大，最后產(chǎn)品中亞硝酸鹽含量越低，復合菌劑接種量為9%，亞硝酸鹽含量最低，復合菌劑接種量為5%和7%時，亞硝酸鹽含量基本相同，略高于接種量為9%時亞硝酸含量。這主要因為添加了復合菌劑，在發(fā)酵初期復合菌株就成為發(fā)酵的優(yōu)勢菌，抑制了其他有害微生物的生長繁殖，通過自身的迅速產(chǎn)酸和酶作用降解亞硝酸鹽，使得最后產(chǎn)品中的亞硝酸鹽含量最低。雖然接種量為9%時，亞硝酸鹽含量最低，但是增加接種量，在實際生產(chǎn)中也會增加生產(chǎn)成本的投入?？紤]亞硝酸鹽最終含量并結合實際生產(chǎn)考慮，選擇復合菌劑接種量為5%較為適宜。

2.3.4 發(fā)酵溫度對復合菌劑發(fā)酵辣椒中亞硝酸鹽含量的影響

考察不同的發(fā)酵溫度對發(fā)酵辣椒中的亞硝酸鹽含量的影響，結果見圖6。由圖6可知，在30℃和33℃條件下，發(fā)酵辣椒中的亞硝酸鹽含量在24h左右到達峰值，在72h時亞硝酸鹽含量最低，在72 h以后稍微升高，隨后趨于平穩(wěn)。主要是因為在發(fā)酵初期復合菌劑在適宜溫度下生長代謝旺盛，抑制了其他微生物的生長，同時降解亞硝酸鹽能力增強，使得與自然發(fā)酵相比，峰值提前到來。但此溫度也是部分雜菌的適宜生長溫度，在發(fā)酵后期雜菌開始生長代謝導致亞硝酸鹽有所增加。在24℃、27℃、36℃條件下，發(fā)酵辣椒中的亞硝酸鹽含量在36h左右到達峰值，且最終的亞硝酸鹽含量也比較高，因為菌株C6的最適生長溫度為28～32℃；菌株B2的最適生長溫度為30～35℃；菌株G3的最適生長溫度為30～45℃[22]，過高或過低的溫度影響了復合菌劑的生長，使得與30℃和33℃相比，亞硝酸鹽含量峰值延遲。綜合亞硝酸鹽含量并考慮復合菌劑的適宜生長溫度，選擇發(fā)酵溫度為30℃較為適宜。

圖6 發(fā)酵溫度對發(fā)酵辣椒亞硝酸鹽含量的影響Fig.6 Effect of fermention temperature on nitrite content of fermented chili

2.3.5 發(fā)酵時間對復合菌劑發(fā)酵辣椒中亞硝酸鹽含量的影響

考察不同的發(fā)酵時間對發(fā)酵辣椒中的亞硝酸鹽含量的影響，結果見圖7。由圖7可知，在0～24 h時，隨著時間的增加亞硝酸鹽含量逐漸增加，在24 h左右到達峰值，主要因為在發(fā)酵前期，有氧的存在，雜菌快速生長，導致蔬菜中硝酸鹽被還原成為亞硝酸鹽，隨著發(fā)酵時間的增加氧氣被消耗殆盡，添加的復合菌劑在短時間內(nèi)迅速成為發(fā)酵的優(yōu)勢菌株，促進了亞硝酸鹽的降解。與自然發(fā)酵相比，提前了峰值到來時間。從24～72 h，隨著時間的增加發(fā)酵辣椒中亞硝酸鹽含量迅速減小，隨后有所增加，最后趨于平穩(wěn)，這可能是因為復合菌劑在72 h時完成了發(fā)酵，其后其他雜菌也開始生長導致亞硝酸鹽含量的增加；因此選擇發(fā)酵時間為72h較為適宜。

圖7 發(fā)酵時間對發(fā)酵辣椒亞硝酸鹽含量的影響Fig.7 Effect of fermention time on nitrite content of fermented chili

2.4 正交試驗優(yōu)化發(fā)酵工藝

在單因素試驗結果的基礎之上，采用L16（45）正交設計，以亞硝酸鹽含量為評價指標，對發(fā)酵辣椒的工藝條件進行優(yōu)化。優(yōu)化正交試驗結果與分析見表2，方差分析見表3。

由表2可知，影響復合菌劑發(fā)酵辣椒中亞硝酸鹽含量的主次因素依次是接種量＞發(fā)酵時間＞發(fā)酵溫度＞蔗糖含量＞食鹽含量，得到的優(yōu)化方案為A3B2C4D2E2，即食鹽含量為4%，蔗糖含量為1%，復合菌劑接種量為6%，發(fā)酵溫度為30℃，發(fā)酵時間為72h。在此條件下進行3次驗證試驗，亞硝酸鹽含量平均值為1.213 mg/kg。由表3可知，5個因素中菌劑接種量對亞硝酸鹽含量有顯著性影響（P＜0.05）。與自然發(fā)酵辣椒相比，成熟期由168h縮短為72 h，亞硝酸鹽含量由3.937mg/kg降為1.213mg/kg，大大減少了生產(chǎn)周期，提高了產(chǎn)品的食用安全性。

表3 正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

3 結論

選擇復合發(fā)酵菌劑對辣椒進行發(fā)酵的單因素試驗，在單因素試驗的基礎上，經(jīng)正交試驗優(yōu)化出復合菌劑發(fā)酵辣椒的最佳工藝條件是食鹽含量為4%，蔗糖含量為1%，復合菌劑接種量為6%，發(fā)酵溫度為30℃，發(fā)酵時間為72 h。在此條件下產(chǎn)品的亞硝酸鹽含量為1.213 mg/kg。同時與自然發(fā)酵辣椒相比亞硝酸鹽含量峰值出現(xiàn)的時間從48 h提前到了24 h，成熟期由168 h縮短為72 h，亞硝酸鹽含量由3.937mg/kg降為1.213mg/kg，大大減少了生產(chǎn)成本，提高了產(chǎn)品的食用安全性。

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Effect of complex microbial inoculants on nitrite contents during chilli fermentation

HUANG Shan1,2,WANG Xiujun1,2*,FAN Zhiping1,3,SHEN Changxuan1,2
(1.Guizhou Provincial Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biopharmacy,Guizhou University,Guiyang 550025,China; 2.School of Liquor and Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China; 3.College of Chemistry and Chemical Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China)

Using fresh chilli as raw materials,the complex microbial inoculants isolated from pickled cabbage were used for chilli fermentation.The effect of complex microbial inoculants fermentation on nitrite content in fermented chill was compared with natural fermentation.On the basis of single factor experiment,the optimal production conditions were determined by orthogonal experiment as follows:salt concentration 4%,sucrose concentration 1%,complex microbial inoculants 6%,fermentation temperature 30℃and time 72 h.Under these conditions,the content of nitrite in fermented chilli was 1.21 mg/kg.Compared with natural fermentation,the maturation period was shortened from 168 h to 72 h and the content of nitrite was reduced from 3.94 mg/kg to 1.21 mg/kg.These results suggested that the complex microbial inoculants could greatly shorten the fermentation time and improved the safety of the product.

fermented chilli;natural fermentation;complex microbial inoculants;nitrite

TS255.5

0254-5071（2017）07-0129-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.07.028

2017-03-17

貴州省農(nóng)業(yè)攻關項目（黔科合NY字[2012]3018號，黔科合NY字[2015]3025-1號）

黃珊（1992-），女，碩士研究生，研究方向為食品科學。

*通訊作者：王修?。?965-），男，教授，本科，研究方向為食品安全、食品保藏。