王秀芬，冷曉紅，李 靜，陳海燕，郭鴻雁

(1.寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院，寧夏 銀川 750021； 2.寧夏中藥材開發(fā)與利用工程技術(shù)研究中心，寧夏 銀川 750021)

秦艽不同加工品中有效成分含量與色度的相關(guān)性

王秀芬1，冷曉紅2，李 靜1，陳海燕1，郭鴻雁1

(1.寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院，寧夏 銀川 750021； 2.寧夏中藥材開發(fā)與利用工程技術(shù)研究中心，寧夏 銀川 750021)

采用直接陰干、自然曬干、發(fā)汗干燥、80 ℃鼓風(fēng)干燥等4種不同干燥方法對(duì)秦艽進(jìn)行加工處理，采用HPLC法對(duì)秦艽中裂環(huán)烯醚萜苷類成分進(jìn)行含量測(cè)定，比較不同加工方法對(duì)秦艽質(zhì)量的影響；采用L*、a*、b*顏色特征參數(shù)描述“發(fā)汗”前后秦艽顏色，并對(duì)秦艽色度變化與成分含量變化進(jìn)行考察。研究表明，不同加工方法的秦艽藥材中裂環(huán)烯醚萜苷類成分含量存在一定差異；“發(fā)汗”與“未發(fā)汗”秦艽色度與成分含量存在相關(guān)性。通過探討不同加工方法對(duì)秦艽藥材主要化學(xué)成分的影響，并對(duì)“發(fā)汗”前后秦艽的顏色變化進(jìn)行數(shù)值描述，探討秦艽色度變化與成分含量的相關(guān)性。

秦艽； 加工方法； 裂環(huán)烯醚萜苷類成分； 色度

秦艽為龍膽科植物秦艽的干燥根，包括秦艽(GentianamacrophyllaPall.)、粗莖秦艽(GentianacrasicaulisDuthie ex Burk.)、麻花秦艽(GentianatramineaMaxim.)及小秦艽(GentianadahuricaFisch.)，具有活血化瘀，祛風(fēng)除濕，利尿清熱功效，臨床上多用于治療風(fēng)濕病、小兒疳熱以及便血等[1]。秦艽的主要活性成分為裂環(huán)烯醚萜苷類化合物，其中龍膽苦苷和馬錢酸苷含量較高，其他獐牙菜苦苷、獐牙菜苷以及6’-O-β-D-葡萄糖龍膽苦苷均具有良好的藥理活性[2-6]。“發(fā)汗”是一種常見的中藥材產(chǎn)地初加工技術(shù)，其目的既有利于藥材的干燥，即藥材密閉堆積后發(fā)熱，其內(nèi)部水分外溢；又可在“發(fā)汗”過程中使藥材中的某些化學(xué)成分發(fā)生一些變化，藥材或變色，或增加香氣，減少刺激性[7-12]。2015年版《中國藥典》規(guī)定秦艽可發(fā)汗處理，發(fā)汗后表面呈紅黃色或灰黃色。但目前在秦艽的產(chǎn)地加工中，不少產(chǎn)地采用不經(jīng)發(fā)汗，直接干燥的方法。目前對(duì)秦艽的產(chǎn)地加工方法研究報(bào)道較少。本試驗(yàn)以寧夏地產(chǎn)秦艽為研究樣本，采用HPLC法對(duì)不同加工方法秦艽中裂環(huán)烯醚萜苷類成分進(jìn)行含量測(cè)定，比較不同加工方法對(duì)秦艽質(zhì)量的影響；采用色差儀對(duì)發(fā)汗與未發(fā)汗秦艽測(cè)量顏色特征參數(shù)，對(duì)藥材的顏色差異進(jìn)行數(shù)值化研究；并對(duì)秦艽色度變化與成分含量變化進(jìn)行考察，為秦艽的產(chǎn)地加工提供科學(xué)評(píng)價(jià)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)材料為龍膽科植物秦艽的干燥根，2015年10月采自寧夏六盤山隆德西北藥材公司秦艽種植基地。經(jīng)寧夏藥檢所鑒定為秦艽的干燥根。

1.2 儀器試劑

高效液相色譜儀Agilent1220、Agilent C18(250 mm×4.6 mm，5 μm，美國安捷倫公司)，自動(dòng)進(jìn)樣器，DAD紫外檢測(cè)器；電子析天平(十萬分之一，Mettler Toledo儀器(上海)有限公司)；GZX-9030MBE型恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)；CS-10精密色差儀(邦億精密量儀(上海)有限公司)；扁形稱量瓶等。

5種對(duì)照品分別為馬錢酸苷對(duì)照品(批號(hào)111865-201403)、龍膽苦苷對(duì)照品(批號(hào)110770-201515)、獐牙菜苦苷對(duì)照品(批號(hào)110785-201404)(中國食品藥品檢定研究院)、獐牙菜苷對(duì)照品(批號(hào)150401 HPLC≥98%)、6’-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷對(duì)照品(批號(hào)141122 HPLC≥98%)(成都菲德生物技術(shù)有限公司)；色譜純乙腈(天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心)；試驗(yàn)用水為重蒸水；其余試劑為分析純。

1.3 不同加工方式秦艽樣品的制備

將鮮秦艽藥材根部除去泥沙，平均分為4份，分別按下述方法進(jìn)行加工處理，備用。

直接陰干品。將秦艽新鮮藥材放于陰涼通風(fēng)處，攤開陰干。

自然曬干品。將秦艽新鮮藥材放于通風(fēng)處，攤開太陽弱光下直接曬干。

直接堆置發(fā)汗品。將秦艽新鮮藥材放于通風(fēng)處，攤開太陽弱光下曬2～3 d，曬軟，堆置，上部和四周用麻袋或塑料薄膜覆蓋，堆置“發(fā)汗”、至表面呈紅黃色或棕黃色時(shí)，攤開曬干。

80 ℃干燥品。將秦艽新鮮藥材平攤于烘盤內(nèi)，采用電熱鼓風(fēng)干燥箱80 ℃烘干。

1.4 裂環(huán)烯醚萜苷類成分的測(cè)定方法及驗(yàn)證

秦艽的主要活性成分為裂環(huán)烯醚萜苷類化合物，2015年版《中國藥典》將龍膽苦苷和馬錢苷酸這2個(gè)化合物作為藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)性成分?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果顯示，除龍膽苦苷和馬錢苷酸外，其他多種環(huán)烯醚萜苷成分均具有良好的藥理活性。獐牙菜苦苷、獐牙菜苷及6’-O-β-D-葡萄糖龍膽苦苷均對(duì)f MLP誘導(dǎo)產(chǎn)生的超氧化物的生成有抑制作用[13]。依此，本研究確定以馬錢酸苷、龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、6’-O-β-D-葡萄糖龍膽苦苷5種活性成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為秦艽質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)。

1.4.1 色譜條件

ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相A為0.05%磷酸，流動(dòng)相B為乙腈，洗脫梯度為0～13 min (91∶9～91∶9)，13～18 min (91∶9～89∶11)，18～23 min (89∶11～80∶20)，23～28 min (80∶20～74∶26)，28～40 min (74∶26～85∶15)；檢測(cè)波長240 nm；流速0.8 mL·min-1；進(jìn)樣量20 μL，柱溫30 ℃；記錄色譜圖。

1.4.2 對(duì)照品溶液的制備

取馬錢酸苷、龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、6’-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含馬錢酸苷0.309 4 mg、龍膽苦苷1.144 8 mg、獐牙菜苦苷0.226 8 mg、獐牙菜苷0.028 mg、6’-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷0.160 2 mg的混合對(duì)照品溶液，即得。

1.4.3 供試品溶液的制備

取本品粉末(過4號(hào)篩)約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率50 kHZ)30 min，放冷，再稱定重量，加甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.4.4 線性關(guān)系的考察

分別精密稱取馬錢苷酸、獐牙菜苦苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含馬錢苷酸2.21 mg，獐牙菜苦苷1.89 mg的混合對(duì)照品溶液，精密量取混合對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.8、1.2、1.5 mL至10 mL的容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，備用；精密稱取龍膽苦苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含龍膽苦苷3.62 mg，精密量取龍膽苦苷對(duì)照品溶液1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 mL至5 mL的容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，備用；精密稱取6’-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含6’-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷0.89 mg，精密量取6’-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.8、1.5、2.2 mL至10 mL的容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，備用；精密稱取獐牙菜苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含獐牙菜苷1.75 mg，精密量取獐牙菜苷對(duì)照品溶液0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mL至10 mL的容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，備用，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見表1。

表1 線性關(guān)系考察

1.4.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定對(duì)照品色譜峰面積，所得馬錢酸苷、龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、6’-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為1.79%、1.59%，1.82%、1.85%、1.92%，表明儀器精密度良好。

1.4.6 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一供試品粉末，按1.4.3方法平行制備供試品溶液6份，測(cè)定各成分含量，得到馬錢酸苷、龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、6’-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷的RSD分別為2.09%、1.59%、2.05%、2.01%和2.17%。

1.4.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，按樣品含量測(cè)定方法，分別在0、2、4、6、8 h進(jìn)樣測(cè)定5種成分的峰面積，馬錢酸苷、獐牙菜苷、獐牙菜苦苷、6’-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷、龍膽苦苷峰面積的RSD分別為2.16%、2.23%、2.08%、2.57%、1.38%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

1.4.8 加樣回收率

取已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)的秦艽樣品粉末6份，約0.5 g，精密稱定，分別按已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)的50%加入馬錢酸苷、獐牙菜苷、獐牙菜苦苷、6’-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷、龍膽苦苷對(duì)照品，按1.4.3方法制備樣品，依1.4.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，每次進(jìn)樣量為10 μL，測(cè)定5種化學(xué)成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，計(jì)算各成分平均回收率依次分別為98.2%、99.6%、99.4%、97.2%和100.2%，RSD分別為2.8%、2.1%、2.2%、3.1%和1.8%。

1.5 色澤測(cè)定方法

中藥材在顏色方面的性狀特征常常是評(píng)價(jià)中藥材質(zhì)量的重要依據(jù)[14]，目前對(duì)這些性狀特征的評(píng)價(jià)主要是依據(jù)經(jīng)驗(yàn)主觀描述。本試驗(yàn)采用色差儀對(duì)秦艽“發(fā)汗”所產(chǎn)生的性狀變化進(jìn)行數(shù)值描述，將有助于科學(xué)化評(píng)價(jià)中藥材質(zhì)量。

以色差儀對(duì)“發(fā)汗”秦艽與未“發(fā)汗”秦艽樣品的顏色進(jìn)行測(cè)定，分析記錄樣品的參數(shù)L*、a*和b*值，每個(gè)樣品測(cè)定2次，以平均值計(jì)。色差儀測(cè)定條件：照明光源D65，狹縫寬度1 nm，視場(chǎng)選擇10°角，波長掃描范圍380～780 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品的含量測(cè)定

取不同加工方式秦艽樣品粉末，平行2份，按1.4.3項(xiàng)下條件制備樣品溶液，依1.4.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，每次進(jìn)樣量為10 μL，進(jìn)行裂環(huán)烯醚萜苷類成分含量測(cè)定。

表2結(jié)果表明，在秦艽不同的加工方法中，以80 ℃干燥，主要藥效成分龍膽苦苷、獐牙菜苷、獐牙菜苦苷的含量較高。

表2 秦艽不同加工樣品裂環(huán)烯醚萜苷類成分含量

2.2 色度

2.2.1 色度測(cè)定

應(yīng)用色差儀按1.5項(xiàng)下色澤測(cè)定方法測(cè)定不同樣品色度參數(shù)值，結(jié)果見表3。采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

表3 秦艽各樣品色度參數(shù)值

對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行卡方檢驗(yàn)分析，χ2值為69.360，P值為0，表明發(fā)汗和未發(fā)汗秦艽在顏色上存在差異，且在數(shù)值上體現(xiàn)為L*、a*、b*值的顯著性差異。

2.2.2 判別分析

由組均值均等性檢驗(yàn)結(jié)果可知，L*、a*、b*值3個(gè)自變量P值均為0，表明在秦艽發(fā)汗和未發(fā)汗的顏色特征參數(shù)L*、a*、b*均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中，L*、a*、b*的λ值分別為0.020、0.077和0.014。根據(jù)λ值越接近0，組間判別越顯著這一原則，可知L*、b*的判別更有意義。

綜上，L*、b*參數(shù)值在發(fā)汗秦艽與未發(fā)汗秦艽樣品上存在差異，說明明度和黃藍(lán)色度是評(píng)價(jià)秦艽樣品顏色的主要指標(biāo)。

2.3 色度變化與成分含量變化的相關(guān)性

將鮮秦艽藥材根部除去泥沙，平均分為9份，其中1～3號(hào)樣品采用自然干燥，4～6號(hào)樣品曬干表皮采用“發(fā)汗”干燥，7～9號(hào)樣品采用80 ℃鼓風(fēng)干燥。

2.3.1 樣品含量和色度

取上述不同加工方式秦艽樣品粉末，進(jìn)行裂環(huán)烯醚萜苷類成分含量測(cè)定和色度測(cè)定，結(jié)果見表4。

表4 秦艽不同加工樣品裂環(huán)烯醚萜苷類成分含量及色度測(cè)定

秦艽藥材采用3種干燥方式，其中以80 ℃鼓風(fēng)干燥藥材L*值最大，a*、b*最小，色澤明亮，偏紅、偏黃程度較小，顏色最淺，呈淡黃色；“發(fā)汗”干燥藥材L*值最小，a*、b*最大，色澤發(fā)暗，偏紅、偏黃程度較大，色澤最深，呈棕黃色；自然干燥藥材色澤介于兩者之間。從表4可知，秦艽采用“發(fā)汗”干燥，獐牙菜苷和獐牙菜苦苷含量明顯降低，6’-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷含量升高。

2.3.2 相關(guān)性

采用SPSS 19.0軟件對(duì)不同加工方式的秦艽藥材色度值與裂環(huán)烯醚萜苷含量(以龍膽苦苷、獐牙菜苷和獐牙菜苦苷之和計(jì))之間分別進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果見表5。

表5 秦艽不同加工樣品裂環(huán)烯醚萜苷類含量與 色度值相關(guān)性分析

注：1)為0.8～1.0極強(qiáng)相關(guān)；2)為0.6～0.8強(qiáng)相關(guān)。

由表5可知，不同干燥方式秦艽藥材裂環(huán)烯醚萜苷類成分含量與藥材色度均呈極強(qiáng)或強(qiáng)相關(guān)，其中藥材色度a*、b*值均與含量呈負(fù)相關(guān)，L*值與含量呈正相關(guān)。

3 討論

發(fā)汗是藥材加工的重要環(huán)節(jié)，可促使其中水分發(fā)散，化學(xué)成分在相關(guān)活性酶作用下轉(zhuǎn)化，提高藥材品質(zhì)[15]。本試驗(yàn)顯示，秦艽采用陰干、自然干燥、發(fā)汗干燥、80 ℃鼓風(fēng)干燥4種干燥方式，其中以80 ℃鼓風(fēng)干燥下的主要藥效成分龍膽苦苷、獐牙菜苷和獐牙菜苦苷的含量較高，堆置發(fā)汗干燥6’-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷的含量明顯增加；80 ℃鼓風(fēng)干燥方式干燥藥材中，馬錢苷酸的含量低于堆置發(fā)汗干燥方式，但明顯高于陰干和自然干燥方式。因秦艽藥材須根較多，干燥過程中若不采用發(fā)汗干燥，須根易斷碎，嚴(yán)重影響藥材品質(zhì)，所以在產(chǎn)地加工中可考慮采用80 ℃鼓風(fēng)干燥和堆置發(fā)汗干燥方式相結(jié)合進(jìn)行藥材干燥，這樣既可縮短干燥時(shí)間，又可保證藥材品質(zhì)。兩種方法結(jié)合加工藥材療效是否更好，有待結(jié)合藥理與臨床研究進(jìn)一步確定。

通過色差分析儀測(cè)定發(fā)汗與未發(fā)汗秦艽的顏色變化，秦艽發(fā)汗后顏色明顯加深。通過對(duì)發(fā)汗與未發(fā)汗秦艽色度變化與成分含量變化的考察，隨著秦艽藥材顏色加深，L*值減小，a*、b*值增大，裂環(huán)烯醚萜苷類成分含量逐漸降低，可能是由于發(fā)汗過程中相關(guān)酶的活性被激活，從而造成藥材中環(huán)烯醚萜苷類成分被水解，生成半縮醛結(jié)構(gòu)的苷元，進(jìn)一步聚合而產(chǎn)生棕黑色沉淀，使藥材顏色加深。采用80 ℃鼓風(fēng)干燥直接將酶殺滅，從而抑制裂環(huán)烯醚萜苷類成分水解。因此，80 ℃鼓風(fēng)干燥藥材顏色最淺，L*值增大，a*、b*值減小，而裂環(huán)烯醚萜苷類成分含量卻最高。發(fā)汗對(duì)藥材藥效活性影響的研究還很少，難以從藥效上來評(píng)價(jià)發(fā)汗這一產(chǎn)地加工的合理性及科學(xué)性。

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(責(zé)任編輯：張瑞麟)

2017-01-04

寧夏科技惠民項(xiàng)目(2015KJHM25)

王秀芬，女，副主任藥師，從事中藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)研究工作，E-mail：nxnxwxf@126.com。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170623

S567

A

0528-9017(2017)06-0976-05

文獻(xiàn)著錄格式：王秀芬，冷曉紅，李靜，等. 秦艽不同加工品中有效成分含量與色度的相關(guān)性[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，58(6)：976-980.