樊曉盼，張伯男，張?zhí)?，馬儷珍，通信作者

（1. 天津農(nóng)學(xué)院 食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津300384；2. 天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術(shù)工程中心，天津 300384；3. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷 030801）

響應(yīng)面法優(yōu)化熱壓浸提牛骨蛋白提取工藝

樊曉盼1,2，張伯男1,2，張?zhí)?，馬儷珍1,2，通信作者

（1. 天津農(nóng)學(xué)院 食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津300384；2. 天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術(shù)工程中心，天津 300384；3. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷 030801）

以牛骨碎屑為試驗(yàn)對(duì)象，通過單因素和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，研究熱壓浸提條件（料液比、浸提時(shí)間和浸提溫度）對(duì)牛骨碎屑中蛋白提取率的影響，進(jìn)而得出利用熱壓浸提技術(shù)提取牛骨蛋白的最佳條件。結(jié)果表明：料液比為1:4、浸提時(shí)間為4 h、浸提溫度為133 ℃時(shí)，牛骨碎屑中的蛋白提取率可達(dá)到64.73%。

牛骨碎屑；蛋白；響應(yīng)面法

我國是世界畜產(chǎn)大國，截至2013年，豬牛羊禽肉年產(chǎn)量達(dá)到8 373萬t，其中畜禽骨占20%～30%[1-4]。畜禽骨中富含蛋白、脂肪以及礦物質(zhì)等多種人體所需的營(yíng)養(yǎng)素，且骨蛋白水解物中基本上包括了組成蛋白質(zhì)分子的所有氨基酸以及部分人體所需的必需氨基酸，且氨基酸構(gòu)成比例均衡，生物學(xué)效價(jià)高，屬于一種優(yōu)質(zhì)蛋白[5-7]。但到目前為止，在人們的日常消費(fèi)中，僅有排骨能夠得到充分利用，而大部分的畜禽骨則因技術(shù)水平限制，未能被加工利用或加工成附加值很低的產(chǎn)品，從而造成資源浪費(fèi)，骨頭腐敗污染環(huán)境[8-11]。

目前，企業(yè)生產(chǎn)主要采用熱壓浸提技術(shù)對(duì)畜禽骨中的蛋白質(zhì)進(jìn)行提取[12-16]。趙永敏等人采用高溫高壓提取方式對(duì)新鮮豬骨、雞骨和牛骨進(jìn)行骨素的提取，結(jié)果表明，豬骨素的最佳提取工藝為溫度135 ℃，時(shí)間100 min，料液比1:4，泄壓頻率 1次/40min[17]；雞骨素的最佳提取工藝為溫度135 ℃，時(shí)間60 min，在4 min之內(nèi)將壓力從0.32 MPa泄至0.10 MPa，然后再繼續(xù)升溫，每35 min泄壓一次[18]；牛骨素的最佳提取工藝為溫度140 ℃，時(shí)間140 min，料液比1:4，粒度大小為2 cm[19]。李桂星[20]采用熱壓抽提法從羊骨中提取骨素，確定羊骨素提取最佳工藝參數(shù)為：壓力 0.2 MPa，溫度132 ℃，料液比1:2.5，時(shí)間2 h，破碎度1.5 cm，最終蛋白質(zhì)提取率為 58.3 %。郇興建[21]采用高溫高壓對(duì)豬骨營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行提取，結(jié)果表明當(dāng)蒸煮溫度為130 ℃、時(shí)間3 h、料水比1:1.5時(shí)，蛋白質(zhì)提取率為68.2%，骨油提取率為83.3%。

本研究以牛骨碎屑為主要原料，采用高溫高壓浸提技術(shù)，通過研究料液比、浸提溫度和浸提時(shí)間對(duì)牛骨碎屑中蛋白提取率的影響，確定熱壓浸提技術(shù)提取牛骨碎屑蛋白的最佳工藝條件，從而為牛骨精深加工利用提供理論及數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料：新鮮牛骨。

試劑：濃鹽酸、氫氧化鈉、濃硫酸、溴甲酚綠、甲基紅、硼酸、硫酸銅、硫酸鉀，均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2004精密分析天平（上海精科儀器公司）；UDK142凱氏定氮儀（意大利VELP公司）；移液槍（Eppendorf公司）。

1.3 方法

1.3.1 單因素試驗(yàn)

稱取100 g牛骨碎屑，在壓力為0.2 MPa條件下，分別以料液比（1:1，1:2，1:3，1:4，1:5）、提取時(shí)間（0.5、1.5、2.5、3.5、4.5 h）和提取溫度（105、115、125、135 ℃）為影響因素，通過單因素試驗(yàn)研究其對(duì)牛骨碎屑中蛋白提取率的影響。

1.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以蛋白提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，利用Design Expert軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，最終確定熱壓浸提牛骨碎屑蛋白的最優(yōu)條件。因素水平及編碼見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平編碼值

1.4 蛋白提取率計(jì)算方法

按照 GB 5009.5—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》[22-23]中凱氏定氮法進(jìn)行測(cè)定。

提取液中蛋白質(zhì)含量占牛骨碎屑蛋白含量的百分比即為蛋白提取率。

式中，m1為浸提物質(zhì)量；c1為浸提液中蛋白質(zhì)含量的百分比；m0為原料質(zhì)量；c0為原料中蛋白質(zhì)含量的百分比。

1.5 數(shù)據(jù)處理

用Microsoft Excel 2003計(jì)算各個(gè)指標(biāo)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，Statistix 8.1進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，顯著性差異（P＜0.05）通過 Turkey test程序進(jìn)行，Sigmaplot 10.0作圖。響應(yīng)面試驗(yàn)采用 Design-Expert 7.0設(shè)計(jì)并進(jìn)行結(jié)果分析，通過建立回歸方程、繪制等高線和三維曲面圖，對(duì)任意兩種因素的交互效應(yīng)進(jìn)行分析評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果與討論

2.1 料液比對(duì)牛骨碎屑中蛋白提取率的影響

料液比是指牛骨碎屑與加水量的質(zhì)量比。由圖 1可知，隨著加水量的增加，蛋白提取率呈上升趨勢(shì)，當(dāng)料液比為1:4時(shí)，蛋白提取率達(dá)到最高，繼續(xù)提高水的添加比例，蛋白提取率不會(huì)顯著增加（P＜0.05），這說明骨頭碎屑中的蛋白已經(jīng)充分溶出，不會(huì)再隨著加水量的增加而繼續(xù)被溶出。為了節(jié)約資源，降低成本，高壓浸提時(shí)料液比選擇1:4。

圖1 料液比對(duì)牛骨碎屑中蛋白提取率的影響

2.2 浸提時(shí)間對(duì)牛骨碎屑中蛋白提取率的影響

由圖2可知，隨著浸提時(shí)間的增長(zhǎng)，蛋白提取率不斷提高。當(dāng)浸提時(shí)間在0.5～3.5 h范圍內(nèi)時(shí)，蛋白提取率呈明顯上升趨勢(shì)，浸提時(shí)間為3.5 h及以上時(shí)則會(huì)保持平穩(wěn)狀態(tài)。因此浸提時(shí)間選擇3.5 h。

圖2 浸提時(shí)間對(duì)牛骨碎屑中蛋白提取率的影響

2.3 浸提溫度對(duì)牛骨碎屑中蛋白提取率的影響

由圖3可知，浸提溫度對(duì)牛骨碎屑蛋白的提取率影響較大。浸提溫度越高，蛋白提取率顯著提高。但考慮企業(yè)生產(chǎn)成本和提取效率，選擇浸提溫度為135 ℃。

圖3 浸提溫度對(duì)牛骨碎屑中蛋白提取率的影響

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)確定最佳浸提工藝參數(shù)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，使用 Design-Expert 7.0軟件，依據(jù)Box-Behnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化分析試驗(yàn)，研究浸提溫度（A）、浸提時(shí)間（B）和料液比（C）3個(gè)因素對(duì)牛骨碎屑中蛋白提取率（Y）的影響，響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析，建立二次回歸方程：Y＝63.04＋3.58A＋0.32B－0.24C＋0.97AB＋0.80AC－1.56BC－2.21A2－2.91B2－7.06C2。

對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析可知，回歸模型P＝0.002 0＜0.01，達(dá)極顯著，這說明本試驗(yàn)所建立的模型顯著回歸，所建立的回歸方程可以用來明確反映牛骨碎屑中蛋白提取率與其他各因素之間的關(guān)系。以蛋白提取率（Y）為響應(yīng)值的模型中，模型一次項(xiàng)A，二次項(xiàng)B2、C2的P值均小于0.01，差異達(dá)到極顯著。模型失擬項(xiàng)P＝0.109 3＞0.05，差異不顯著，表明該模型與實(shí)際試驗(yàn)誤差較小，擬合度較高，能夠進(jìn)行模型分析。相關(guān)系數(shù)R2＝0.973 5，表明采用響應(yīng)面法設(shè)計(jì)所建立的回歸模型有效，有97.35%的響應(yīng)值可用來對(duì)該模型進(jìn)行解釋，模型適用于熱壓浸提牛骨碎屑中蛋白試驗(yàn)的理論預(yù)測(cè)（表3）。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)回歸模型方差分析

2.4.1 響應(yīng)面分析

圖4直觀反映了牛骨碎屑蛋白提取率與各個(gè)因素之間的相互關(guān)系。等高線圖的疏密程度用來反映不同因素對(duì)蛋白提取率的影響程度，等高線變化越密集，說明該因素對(duì)牛骨蛋白提取率影響越大。

圖4 任意兩因素交互作用對(duì)牛骨碎屑中蛋白提取率的響應(yīng)面圖

從圖4a可以看出，料液比固定在0水平，浸提溫度在125～135 ℃時(shí)，牛骨蛋白提取率與浸提時(shí)間呈正相關(guān)；浸提時(shí)間在2.5～4.5 h時(shí)，牛骨蛋白提取率與浸提溫度也呈正相關(guān)。當(dāng)浸提溫度為130 ℃，浸提時(shí)間為3.5 h時(shí)，蛋白提取率最高。

從圖4b可以看出，浸提時(shí)間固定在0水平，當(dāng)溫度在125～135 ℃時(shí)，牛骨蛋白提取率隨著料液比的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)；當(dāng)料液比在1:1～1:5時(shí)，牛骨蛋白提取率隨著浸提溫度的升高呈緩慢上升而后穩(wěn)定的趨勢(shì)。當(dāng)料液比為1:4，浸提溫度129 ℃時(shí)，蛋白提取率最高。

從圖4c可以看出，浸提溫度固定在0水平，浸提時(shí)間在2.5～4.5 h時(shí)，牛骨蛋白提取率隨著料液比的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)料液比在1:1～1:5時(shí)，牛骨蛋白提取率隨著浸提時(shí)間的增加呈上升趨勢(shì)。當(dāng)料液比為 1:4，浸提時(shí)間為 3.5 h時(shí)，蛋白提取率最高。

2.4.2 工藝優(yōu)化與驗(yàn)證試驗(yàn)

分析二次回歸方程，可得到牛骨蛋白提取率的最優(yōu)提取工藝條件為：料液比為1:3.92，浸提時(shí)間為3.99 h，浸提溫度為132.87 ℃，該條件下蛋白提取率的理論預(yù)測(cè)值為64.08%。對(duì)最佳提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)，將預(yù)測(cè)條件優(yōu)化為料液比為1:4，浸提時(shí)間為4 h，浸提溫度為133 ℃。結(jié)果得出在此優(yōu)化工藝條件下，蛋白提取率為64.73%，與模型理論預(yù)測(cè)值的吻合度達(dá)到99.0%，因此該響應(yīng)面回歸模型具有可行性，具有實(shí)際參考價(jià)值。

3 結(jié)論

本研究以牛骨碎屑為原料，采用熱壓浸提技術(shù)對(duì)牛骨碎屑中的蛋白進(jìn)行提取。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果選出對(duì)蛋白提取率有顯著影響的因素（料液比、溫度和時(shí)間），進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)，最終得到熱壓浸提牛骨碎屑中蛋白的最佳工藝參數(shù)為：料液比為1:4，浸提時(shí)間為4 h，浸提溫度為133 ℃，在此條件下，蛋白的提取率可達(dá)到64.73%。

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責(zé)任編輯：張愛婷

Optimization High-temperature and High-pressure Extraction Process of Bovine Bone Protein Using Response Surface Methodology

FAN Xiao-pan1,2, ZHANG Bo-nan1,2, ZHANG Tian3, MA Li-zhen1,2,CorrespondingAuthor
（1. College of Food Science and Bioengineering, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China; 2. Tianjin Engineering and Technology Research Center of Agricultural Products Processing, Tianjin 300384, China; 3. College of Food Science and Bioengineering, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi Province, China）

In this study, bone fragments were chosen as raw material. The influence of high-temperature and high-pressure technology on the extraction rate of bovine bone protein were evaluated. Single factors and response surface methodology was used to optimize extraction of bovine protein by using high-temperature and high-pressure technology. The main parameters including the material-fluid ration, extract time and extract temperature, and the extraction rate of protein were the evaluation index. The research results showed that the optimum conditions of extraction are as follows: material-fluid ration is 1:4, extract time is 4 h and extract temperature is 133 . Under the optimal extraction condition, the extraction rate of bovine bone protein ℃was 64.73%.

bone fragments; protein; response surface methodology

TS251.94

：A

2016-06-02

天津市農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化與推廣項(xiàng)目“可食性牛羊骨素加工關(guān)鍵技術(shù)集成及工程化示范”（201604060）

樊曉盼（1993-），女，山西運(yùn)城人，碩士在讀，研究方向：動(dòng)物源性食品安全與營(yíng)養(yǎng)學(xué)。E-mail：308925471@qq.com。

馬儷珍（1963-），女，山西運(yùn)城人，教授，博士，研究方向：肉品科學(xué)與技術(shù)。E-mail：malizhen-6329@163.com。

1008-5394（2017）02-0058-05