戰(zhàn)海，王廣軍，陳成勛

（1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 珠江水產(chǎn)研究所，廣州 510380；2. 天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院，天津 300384）

一株好氧反硝化細(xì)菌的分離鑒定及反硝化能力初測(cè)

戰(zhàn)海1,2，王廣軍1,通信作者，陳成勛2

（1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 珠江水產(chǎn)研究所，廣州 510380；2. 天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院，天津 300384）

采用BTB（溴甲基酚藍(lán)）平板涂布分離法，從鱖魚(yú)養(yǎng)殖池塘水體中分離出17株具有反硝化作用的細(xì)菌，通過(guò)初步篩選和反硝化能力的測(cè)定，挑選出一株具有較強(qiáng)反硝化能力的好氧反硝化細(xì)菌，命名為8F-3。菌株8F-3在24 h內(nèi)將總氮從100.00 mg/L降至6.51 mg/L，去除率達(dá)到93.49%；將氨氮從50.000 mg/L降至1.966 mg/L，去除率為96.07%；將硝酸鹽氮從50.00 mg/L降至3.51 mg/L，去除率為92.98%；將亞硝酸鹽氮從0.096 mg/L降至0.071 mg/L，去除率為25.79%。該試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株8F-3對(duì)氨氮和硝酸鹽氮具有較強(qiáng)的去除能力，對(duì)亞硝酸鹽氮也有一定去除作用，反硝化能力較強(qiáng)。經(jīng)生理生化測(cè)試和16 S rRNA分子鑒定，初步鑒定該菌屬于不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）。

好氧反硝化菌；反硝化能力；16S rRNA；不動(dòng)桿菌屬

近年來(lái)，我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，水產(chǎn)品總產(chǎn)量穩(wěn)居世界第一。但目前多采取高密度集約化養(yǎng)殖模式，由此引發(fā)的水體富營(yíng)養(yǎng)化等問(wèn)題日益嚴(yán)重。養(yǎng)殖過(guò)程中過(guò)量的飼料殘?jiān)团判刮锸且l(fā)該問(wèn)題的主要因素，因殘餌和排泄物分解后導(dǎo)致水體中氨氮、亞硝酸鹽等含量過(guò)高[1]，這不僅直接危害養(yǎng)殖動(dòng)物，還會(huì)誘發(fā)細(xì)菌、病毒病的暴發(fā)，給水產(chǎn)養(yǎng)殖造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。因此，尋找高效去除養(yǎng)殖水體中氨氮、亞硝酸鹽等的方法迫在眉睫。

生物脫氮是去除水體中氮污染的最有效方法之一[3]，具有經(jīng)濟(jì)高效、無(wú)二次污染等優(yōu)勢(shì)。生物脫氮一般包括好氧硝化和厭氧反硝化兩個(gè)過(guò)程。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，反硝化過(guò)程只能在厭氧條件下進(jìn)行，因?yàn)樵谟醒鯒l件下，分子氧相比硝酸鹽氮或亞硝酸鹽氮有更強(qiáng)的得電子能力，從而抑制反硝化過(guò)程[4]。20世紀(jì) 80年代，隨著副球菌屬（Paracoccus）的首次發(fā)現(xiàn)[5]，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)好氧反硝化細(xì)菌研究報(bào)道逐漸增多，主要包括假單胞菌屬（Pseudomonas）[6]、產(chǎn)堿菌屬（Alcaligenes）[7]、芽孢桿菌屬（Bacillus）[8]、紅球菌屬（Rhodococcus）[9]等。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，為保證養(yǎng)殖動(dòng)物的健康生長(zhǎng)，必須保證水體內(nèi)含有一定濃度的溶解氧，在這種情況下，厭氧反硝化細(xì)菌的脫氮效果較差。因此，好氧反硝化細(xì)菌的應(yīng)用受到越來(lái)越多的關(guān)注，已有較多種類(lèi)的細(xì)菌被報(bào)道具有好氧反硝化功能，其中部分菌種能夠在高密度養(yǎng)殖條件下，有效地去除水體氮素的過(guò)度積累。

從1987年開(kāi)始，有關(guān)單位在珠江三角洲地區(qū)進(jìn)行鱖魚(yú)養(yǎng)殖生產(chǎn)試驗(yàn)并取得成功，1990年進(jìn)行規(guī)模生產(chǎn)，目前該地區(qū)已經(jīng)成為主要養(yǎng)殖基地，鱖魚(yú)產(chǎn)量在全國(guó)居于領(lǐng)先地位。但關(guān)于鱖魚(yú)養(yǎng)殖池塘中是否存在大量的好氧反硝化細(xì)菌鮮有報(bào)告。為此，本試驗(yàn)從廣東省佛山市三水區(qū)某鱖魚(yú)養(yǎng)殖池塘采集水樣，在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行好氧反硝化細(xì)菌的分離純化、鑒定，并對(duì)其反硝化特性進(jìn)行研究，在豐富好氧反硝化細(xì)菌種質(zhì)資源的同時(shí)，為該菌在養(yǎng)殖水體的實(shí)際應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源及采集

菌株分離水樣采自廣東省三水市某鱖魚(yú)養(yǎng)殖池塘。采用五點(diǎn)采樣法，在鱖魚(yú)養(yǎng)殖池塘中取500 mL池塘表層水于無(wú)菌采樣瓶中。用低溫采樣箱保存帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 菌種分離篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)基

在DM基礎(chǔ)培養(yǎng)基[2]上稍加改動(dòng)，配制過(guò)程如下： KH2PO41.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.01 g/L，Na2HPO47.9 g/L，微量元素溶液2 mL，去離子水1 000 mL，調(diào)節(jié) pH 7.0～7.5，檸檬酸鈉（C6H5Na3O7）5.66 g/L，NaNO30.841 5 g/L。在DM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入NH4Cl 0.192 g/L和NaNO20.362 g/L，121.3 ℃滅菌20 min。

我嘞個(gè)去：在搞笑動(dòng)漫日和，《平田的世界》及《西游記——旅途的終點(diǎn)》中頻繁出現(xiàn)，為平田君和唐僧師徒三人的口頭禪。例如：

BTB（溴甲基酚藍(lán)）培養(yǎng)基：在DM培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加1 mL BTB（1%溶解于乙醇）和2.5 %瓊脂，用蒸餾水溶解并調(diào)節(jié)pH 至7.0～7.3，121.3 ℃滅菌20 min。

LB培養(yǎng)基，參考文獻(xiàn)[2]并略加改動(dòng)[3]：1%胰蛋白胨，0.5%酵母膏，0.5% NaCl，蒸餾水溶解，121.3℃滅菌20 min。

1.3 好氧反硝化細(xì)菌的初步篩選

取池塘水樣100 μL，在BTB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布分離，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培育72 h，用接種環(huán)挑取使BTB固體培養(yǎng)基呈現(xiàn)藍(lán)色的單菌落，反復(fù)劃線純化，分離得到17株具有反硝化能力的菌株，再通過(guò)菌落顏色比較，初步篩選出反硝化能力較強(qiáng)的5株菌株[2]。

1.4 反硝化能力的初步測(cè)定

對(duì)由1.3分離得到的5株反硝化能力較強(qiáng)的菌株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)：將細(xì)菌接種于裝有20 mL LB培養(yǎng)液的50 mL離心管中，在28 ℃，180 r/min恒溫?fù)u床擴(kuò)大培養(yǎng)8 h，備用。

將上述擴(kuò)培后的 5株細(xì)菌分別接種于裝有150 mL DM培養(yǎng)液的250 mL錐形瓶中，在28 ℃，180 r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，分別在試驗(yàn)初始、12、24 h 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行氨氮（NH4）、硝酸鹽氮（NO3-N）、亞硝酸鹽氮（NO2-N）和總氮（TN）測(cè)定，計(jì)算各種菌對(duì)NH4、NO3-N、NO2-N和TN的去除率。每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)平行。由于添加各菌種會(huì)帶入LB培養(yǎng)液，因此另設(shè)對(duì)照組添加與菌液等量的LB培養(yǎng)基至裝有150 mL DM培養(yǎng)液的250 mL錐形瓶中，以證明LB培養(yǎng)基對(duì)脫氮作用沒(méi)有影響。其中總氮（TN）采用堿性過(guò)硫酸鉀紫外線分光光度法檢測(cè)；硝酸氮（NO3-N）用紫外分光光度法檢測(cè)；亞硝酸氮（NO2-N）測(cè)定用 N-（1-萘基）-乙二胺光度法；氨氮采用納氏試劑分光光度法測(cè)定。

總氮去除率＝（1-終末無(wú)機(jī)氮/初始總無(wú)機(jī)氮）×100% （1）

氨氮去除率＝（1-終末氨氮/初始氨氮）×100% （2）

硝酸鹽氮去除率＝（1-終末硝酸鹽氮/初始硝酸鹽氮）×100% （3）

亞硝酸鹽氮去除率＝（1-終末亞硝酸鹽氮/初始亞硝酸鹽氮）×100% （4）

1.6 菌種鑒定

1.6.1 16S rRNA基因序列的測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

使用 E.Z.N.A.? Bacterial DNA Kit（美國(guó)OMWGA）對(duì)本研究獲得的反硝化能力較強(qiáng)的菌株的基因組DNA進(jìn)行提取，擴(kuò)增16S rRNA，采用一對(duì)通用引物，正向引物27F：5'-GAGAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3'和反向引物1492R： 5'-CTACGG CTACCTTGTTACGA-3'（上海英駿生物技術(shù)有限公司合成）。其PCR擴(kuò)增體系（50 μL）為：基因組 DNA 1 μL，10×PCR buffer 5 μL，dNTPs 1.5 μL，MgCl21.5 μL，引物 27F 0.5 μL，引物 1492R 0.5 μL，Taq酶 0.2 μL，無(wú)菌水 39.8 μL。其 PCR 擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性 5 min：94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，最后72 ℃延伸10 min。30個(gè)循環(huán)，PCR產(chǎn)物測(cè)序交由生物工程（上海）股份有限公司完成，要求雙向測(cè)通。所得測(cè)序拼接結(jié)果提交GenBank進(jìn)行Blast比對(duì)分析，獲得同源性最高的種屬的16S rRNA基因序列，采用BioEdit和Mega 5.0軟件對(duì)目標(biāo)菌株和同源菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.6.2 API試劑條測(cè)定

API系統(tǒng)的鑒定方法：利用API 20E（梅里埃診斷產(chǎn)品（上海）有限公司）試條，并按試條的操作指南進(jìn)行操作。試條中每一個(gè)小管所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物通過(guò)自發(fā)反應(yīng)或者加入附加指示劑后而變色，得到API試驗(yàn)結(jié)果后，在apiweb軟件（梅里埃診斷產(chǎn)品（上海）有限公司）中進(jìn)行檢索得到鑒定結(jié)果，根據(jù)形態(tài)及鑒定結(jié)果初步確定菌種的歸屬。

2 結(jié)果與分析

2.1 具有反硝化作用的菌株分離、篩選結(jié)果

在反硝化作用過(guò)程中，由于BTB培養(yǎng)基會(huì)因硝酸鹽的還原反應(yīng)導(dǎo)致pH值升高，使培養(yǎng)基呈現(xiàn)藍(lán)色，因此可以根據(jù)培養(yǎng)基的顏色變化程度初步判斷菌株的好氧反硝化能力[2]。本試驗(yàn)中，通過(guò)對(duì)細(xì)菌的富集分離純化及顯色反應(yīng)，得到17株具有反硝化能力的菌株，后經(jīng)過(guò)反復(fù)劃線純化，挑選出藍(lán)色反應(yīng)最明顯的5株細(xì)菌，分別命名為8F-3、5B-3、6B-3、11C-3、9H-3，進(jìn)行反硝化能力的測(cè)試。

2.2 菌種反硝化能力的初步測(cè)定

圖1為初篩中得到的5株細(xì)菌對(duì)DM培養(yǎng)基中總氮的去除率比較。從圖1中可以看出，菌株8F-3的脫氮率最高。經(jīng)過(guò)12 h的反硝化作用，菌株8F-3可將DM培養(yǎng)基中初始濃度為100.00 mg/L的總氮降低至57.73 mg/L，去除率為42.27%，經(jīng)過(guò) 24 h，總氮濃度降低至 6.51 mg/L，去除率為93.49%。而經(jīng)過(guò)24 h，菌株5B-3、6B-3、11C-3和 9H-3的脫氮率僅為 60.90%、58.38%、8.25%和0.06%。

圖1 在DM培養(yǎng)基中5株細(xì)菌對(duì)總氮去除率的比較

圖2為5株細(xì)菌對(duì)氨氮去除率的比較。從圖2中可以看出，菌株8F-3對(duì)氨氮的去除率最高。經(jīng)過(guò)12 h的反硝化作用，菌株8F-3將DM培養(yǎng)基中初始濃度為 50.000 mg/L的氨氮降低至 27.930 mg/L，去除率為44.15%，經(jīng)過(guò)24 h，氨氮濃度降低至 1.966 mg/L，去除率為 96.07%。菌株 5B-3對(duì)氨氮的去除率略低于菌株8F-3，經(jīng)過(guò)24 h，去除率為 92.45%，而菌株 5B-3、6B-3、11C-3和9H-3對(duì)硝酸鹽氮的去除率僅為 74.10%、11.89%和2.80%。

圖2 在DM培養(yǎng)基中5株細(xì)菌對(duì)氨氮去除率的比較

圖3為5株細(xì)菌對(duì)硝酸鹽氮的去除率比較。從圖3中可以看出，菌株8F-3對(duì)硝酸鹽氮的去除率最高。經(jīng)過(guò)12 h的反硝化作用，菌株8F-3將DM培養(yǎng)基中初始濃度為50.00 mg/L的硝酸鹽氮降低至28.95 mg/L，去除率為42.10%，經(jīng)過(guò)24 h，硝酸鹽氮濃度降低至 3.51 mg/L，去除率為92.98%。而經(jīng)過(guò)24 h，菌株5B-3、6B-3、11C-3和 9H-3對(duì)硝酸鹽氮的去除率僅為 16.36%、67.02%、5.94%和1.03%。

圖3 在DM培養(yǎng)基中5株細(xì)菌對(duì)硝酸鹽氮去除率的比較

圖4為5株細(xì)菌對(duì)亞硝酸鹽氮的去除率比較。從圖4可以看出，經(jīng)過(guò)12 h的反硝化作用，8F-3、5B-3、6B-3、11C-3和 9H-3對(duì)亞硝酸鹽氮的去除率分別為26.10%、47.75%、10.31%、25.83%和0%，經(jīng)過(guò)24 h，5株細(xì)菌對(duì)亞硝酸鹽氮的去除率分別為25.79%、60.19%、12.36%、72.93%和0%。在對(duì)亞硝酸鹽氮的去除作用中，菌株8F-3的效果并不是最好，推測(cè)是由于該菌對(duì)硝酸鹽氮的降解作用較強(qiáng)而對(duì)亞硝酸鹽氮的降解作用偏弱，因此發(fā)生反硝化作用后生成亞硝酸鹽氮并有一定累積，所以去除率較低。

圖4 在DM培養(yǎng)基中5株細(xì)菌對(duì)亞硝酸鹽氮去除率的比較

2.3 菌種8F-3的鑒定

2.3.1 菌種 16S rRNA的序列測(cè)定和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

根據(jù) 8F-3菌 16S rRNA序列 Blast結(jié)果（Bootstrap 1 000次），選擇幾種不動(dòng)桿菌屬16S rRNA序列與8F-3菌序列構(gòu)建N-J進(jìn)化樹(shù)，顯示8F-3與不動(dòng)桿菌屬的 YC-X2菌株相似性最高，并聚為一枝（圖5）。

圖5 8F-3與幾種不動(dòng)桿菌屬16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)

2.3.2 API法鑒定菌種

分別將培養(yǎng)24 h與48 h后的API 50 CH試條和API 20E試條所形成的好氧反硝化菌8F-3的生化圖譜與標(biāo)準(zhǔn)生化圖譜進(jìn)行比對(duì)，并記錄其檢測(cè)結(jié)果，如表1所示，使用apiweb軟件對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判定。結(jié)果表明，8F-3為不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter），其中 id%=87.4，T指數(shù)=0.76，鑒定評(píng)注為：極好的鑒定，到“屬”。

表1 好氧反硝化菌8F-3的API 生化反應(yīng)結(jié)果

3 討論

好氧反硝化細(xì)菌廣泛存在于自然界中，目前已有多種方法可以有效分離篩選出好氧反硝化細(xì)菌[10-11]。近年來(lái)，隨著國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)好氧反硝化菌研究的不斷深入，許多具有較強(qiáng)除氮能力的好氧反硝化菌被篩選出來(lái)，其中假單胞菌屬（Pseudomonaceae）是常見(jiàn)種類(lèi)。Dominique等[12]通過(guò)16S rRNA測(cè)序，研究了法國(guó)東北地區(qū)農(nóng)田土壤中反硝化細(xì)菌的多樣性，發(fā)現(xiàn)其主要類(lèi)群之一就是假單胞菌屬。Kim等[5]從土壤中篩選分離出一株命名為 AD-21的惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida），發(fā)現(xiàn)該菌在溶氧為5～6 mg/L時(shí)仍能發(fā)揮較好反硝化作用。高喜燕等[13]篩選分離了 1株好氧反硝化菌，經(jīng)鑒定該菌為假單胞菌屬，在處理海洋養(yǎng)殖循環(huán)水中發(fā)揮重要作用，因其對(duì)初始濃度為140 mg/L的硝酸鹽氮48 h內(nèi)去除率達(dá)92%。此外，對(duì)產(chǎn)堿菌屬（Alcaligenes）[14-15]、芽孢桿菌屬（Bacillus）[16-17]等屬的好氧反硝化菌也有多處報(bào)道。

本試驗(yàn)從廣東省佛山市三水區(qū)鱖魚(yú)池塘表層水中分離出17株具有反硝化能力的菌株，也說(shuō)明了好氧反硝化細(xì)菌廣泛存在于養(yǎng)殖水體中。經(jīng)過(guò)對(duì)反硝化能力的初步測(cè)定，得到了一株具有較好脫氮效率的菌株8F-3。從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，菌株 8F-3在 DM培養(yǎng)基中，對(duì)總氮的去除率達(dá)到93.49%，對(duì)氨氮、硝酸鹽氮的去除率較高，分別為96.07%和92.98%，而對(duì)亞硝酸鹽氮的去除率較低，僅為25.79%。推測(cè)原因可能是由于該菌在反硝化過(guò)程中分解硝酸鹽氮生產(chǎn)亞硝酸鹽氮，而菌株對(duì)亞硝酸鹽的分解能力偏弱，使亞硝酸鹽產(chǎn)生一定的累計(jì)，所以試驗(yàn)結(jié)束時(shí)含量較高。這一結(jié)果與彭志蘭等[1]的研究結(jié)果相似。同時(shí)也說(shuō)明該菌能較好地利用硝酸鹽和氨氮。但總體上看，菌株8F-3的反硝化能力較強(qiáng)。經(jīng)16S rRNA測(cè)序和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建，鑒定該菌為不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter sp.），并通過(guò)API系統(tǒng)鑒定再次驗(yàn)證了這一結(jié)論。

目前，關(guān)于不動(dòng)桿菌屬的好氧反硝化特性研究較少，楊小龍等[18]從富營(yíng)養(yǎng)化的池塘淤泥水和工廠污泥樣品篩選得到一株命名為C-4的菌株，經(jīng)鑒定屬于不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter sp.），研究發(fā)現(xiàn)，該菌具有良好的反硝化特性和高效去除氨氮與亞硝酸鹽氮的能力。本試驗(yàn)篩選鑒定得到菌株8F-3，對(duì)氨氮和硝酸鹽氮的去除作用較強(qiáng)，為后續(xù)進(jìn)一步研究該菌脫氮的最優(yōu)條件、探討該菌的反硝化特性提供理論支持，并為該菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的實(shí)際應(yīng)用打下理論基礎(chǔ)。

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責(zé)任編輯：張愛(ài)婷

Identification and Denitrification Ability of an Aerobic Denitrifier

ZHAN Hai1,2, WANG Guang-jun1,CorrespondingAuthor, CHEN Cheng-xun2
（1. Pearl River Fishery Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510380, China; 2. College of Fisheries, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

17 denitrification strains were isolated from mandarin fish pond water of Sanshui city using BTB （bromothymol blue） spread-plate technique, through the preliminary screening for denitrification strains and determination ability, one aerobic denitrifying bacteria which has strong determination, was named 8F-3. The results showed that the total content of nitrogen was reduced from 100.00 mg/L to 6.51 mg/L by 8F-3 strain in 24 hours and the rate of denitrification was 93.49%; Ammonia nitrogen was reduced from 50.000 mg/L to 1.966 mg/L, the removal rate was 96.07%, Nitrate nitrogen was reduced from 50.00 mg/L to 3.51 mg/L, the removal rate was 92.98%; Nitrite nitrogen was reduced from 0.096 mg/L to 0.071 mg/L, the removal rate was 25.79%. According to the blast results of 8F-3 strain 16S rRNA sequence （Bootstrap 1 000 times）and physiological test for 8F-3 using API method, the bacteria was finally identified as Acinetobacter sp.

aerobic denitrifier; denitrification ability; 16S rRNA; Acinetobacter

S917.1

：A

2016－04－25

廣東省海洋漁業(yè)科技推廣專項(xiàng)“內(nèi)陸池塘復(fù)合凈化技術(shù)示范與推廣”（B20140C01）；“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目“池塘優(yōu)勢(shì)生物群落調(diào)控管理技術(shù)研究”（2012BAD25B01）；國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)“草魚(yú)養(yǎng)殖模式”（CARS-46-17）

戰(zhàn)海（1989－），男，山東煙臺(tái)人，碩士在讀，主要從事水域環(huán)境調(diào)控研究。E-mail：1033707611@qq.com。

王廣軍（1973－），男，山東濟(jì)寧人，研究員，碩士，主要從事水域環(huán)境調(diào)控研究。E-mail：wgj5810@163.com。

1008-5394（2017）02-0044-05