周 蘭， 張利義， 樸永振， 樸宇， 劉冰雁

(1.延邊朝鮮族自治州農(nóng)業(yè)科學院，吉林 龍井 133400；2.中國農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所，遼寧 興城 125100)

蘋果MYB12基因的克隆及生物信息學分析

周 蘭1， 張利義2， 樸永振1， 樸宇1， 劉冰雁1

(1.延邊朝鮮族自治州農(nóng)業(yè)科學院，吉林 龍井 133400；2.中國農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所，遼寧 興城 125100)

以野生型蘋果“麗江山荊子”果皮為材料，利用對已公布的“金冠”蘋果基因組的生物信息學分析，設(shè)計1對特異性引物，克隆了MdMYB12轉(zhuǎn)錄因子，其基因片段全長為1 042 bp，在對其進行生物信息學分析后發(fā)現(xiàn)，包含873 bp開放閱讀框(ORF)，編碼290個氨基酸。對擬南芥127個MYB基因家族與所克隆的MdMYB12基因構(gòu)建系統(tǒng)進化樹發(fā)現(xiàn)，相對于擬南芥中其他MYB基因家族其他基因MdMYB12基因與AtMYB12、AtMYB11及AtMYB111緣關(guān)系較近處于同一進化分支上。

蘋果；MdMYB12轉(zhuǎn)錄因子；克??；生物信息學分析

轉(zhuǎn)錄因子是由一段基因編碼翻譯的蛋白，也稱反式作用因子，通常能與真核基因啟動子區(qū)域中的順式作用元件發(fā)生特異性的相互作用，所以轉(zhuǎn)錄因子能夠通過與其它相關(guān)蛋白的相互作用，激活或抑制結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄表達[1]，轉(zhuǎn)錄因子通常由 DNA 結(jié)合功能域、信號分子結(jié)合域、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)以及核定位信號區(qū)等功能域組成[2-3]。轉(zhuǎn)錄因子與 DNA，以及不同轉(zhuǎn)錄因子之間都存在著相互作用，直接或間接的對動植物體生理生化代謝產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。近10年來關(guān)于轉(zhuǎn)錄因子的報道和研究越來越多，應(yīng)用技術(shù)也得到迅猛發(fā)展，現(xiàn)在至少有幾十種DNA蛋白復合體和DNA 結(jié)合蛋白被報道[4]，現(xiàn)有的轉(zhuǎn)錄因子家族分為：NFAT、WRKY、bHLH、Myb 蛋白和Sp 家族蛋白等幾大類[5]。MYB類轉(zhuǎn)錄因子是這些家族中數(shù)量最多，功能最多樣化的基因家族，它們在植物次生代謝過程中起著重要的調(diào)控作用。

MYB蛋白是DNA結(jié)合蛋白中最重要的一類，因其基因序列結(jié)構(gòu)上有一段保守的 DNA 結(jié)合區(qū)而被命名為Family of transcription factors with Trp cluster motif(MYB轉(zhuǎn)錄因子)。MYB相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子所進行的轉(zhuǎn)錄調(diào)控對植物的次生代謝以及分子生物學等研究具有重要意義，多年來隨著對MYB 轉(zhuǎn)錄因子的深入研究，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)MYB轉(zhuǎn)錄因子可以從基因水平上參與調(diào)控植物次生代謝及花色素的積累過程，是植物體中參與苯丙烷類代謝途徑中的一個重要分支。MYB 轉(zhuǎn)錄因子在植物界中有龐大的家族體系，其中關(guān)于植物生理代謝，包括花色素等植物次級代謝產(chǎn)物合成影響的研究最為深入[6-7]，特別是在擬南芥中， Christian[8]在類黃酮代謝途徑中標記了MYB11、MYB12、MYB111調(diào)控黃酮醇合成支路，而MYB3、MYB4、MYB5、MYB7、MYB32、MYB75、MYB90、MYB113、MYB114和MYB123調(diào)控花青素合成支路。在MYB基因家族的研究中，對花青素合成支路調(diào)控位點的研究廣泛，而對類黃酮其它物質(zhì)的合成調(diào)控還有待進一步研究。

蘋果類黃酮合成中的轉(zhuǎn)錄分析和編碼酶基因大部分只涉及到花青素積累[9-11]，目前己經(jīng)克隆的著色相關(guān)MYB類轉(zhuǎn)錄因子有MdMYB1、MdMYB10和MdMYBA[12-14]，這些轉(zhuǎn)錄因子在光誘導的蘋果果實花青素積累和蘋果果皮著色中起著重要的調(diào)控作用。

金冠蘋果(Malus domestica Borkh.cv.Golden Delicious)基因組圖譜的公布(http://genomics.research.iasma.it)[15]為基因功能相關(guān)研究提供了廣闊的平臺，促進了蘋果功能基因的發(fā)掘和遺傳轉(zhuǎn)化應(yīng)用[16]。關(guān)于MYB12對類黃酮合成代謝的調(diào)控作用已經(jīng)在擬南芥中進行了研究[17]，但是在以蘋果為代表的木本植物中研究甚少，本研究將在對蘋果基因組數(shù)據(jù)庫中登錄的序列進行分析的同時，利用擬南芥ATMYB12基因序列，在蘋果基因組數(shù)據(jù)庫(http：//genomics.research .iasma.it/)中找到序列MDP0000210851，利用MDP0000210851序列設(shè)計引物擴增蘋果中MYB12序列。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的克隆材料為“麗江山荊子”，定植于國家蘋果、梨種質(zhì)資源圃(興城)，于 2015年8月取果皮，保存于-80 ℃冰箱中待用。

1.2 試劑及儀器

1) 菌株及載體 E.coli DH5α 感受態(tài)細胞和克隆用載體 pMD-19T Vector均購于大連寶生物科技有限公司。

2) 試劑 “Plantol 高效植物總 RNA 提取試劑盒”產(chǎn)于深圳萊伯克生物科技有限公司，F(xiàn)irst Strand cDNA合成試劑盒購自TaKaRa公司，AxyPrep DNA回收純化試劑盒購于愛思進生物技術(shù)(杭州)有限公司，IPTG 、X-gal、pMD-19T Vector、DNA Marker、Prime ScriptTMRT reagent Kit 試劑盒、Recombinant DNaseⅠ、Ex Taq 酶等均購于 TaKaRa 公司，其他分析純級別試劑均購于北京全新拓達科技有限公司，引物在北京三博生物技術(shù)有限責任公司合成；LB液體培養(yǎng)基組成配比為：胰蛋白胨100 mg/mL，酵母提取物50 mg/mL，NaCl 50 mg/mL，混合溶解后，用10 M的NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0，需高壓滅菌；LB固體培養(yǎng)基是在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入150 mg/mL的瓊脂粉，需高壓滅菌。

3) 儀器 Milli-Q型超純水儀，DYY-6C型電泳儀，pTC-200型PCR儀，Eppendorf Centrifuge 5810R型臺式低溫高速離心機，HIRAYAMA Hv-50型全自動高壓滅菌鍋，Eppendorf Centrifuge5414D型臺式常溫高速離心機， BlO IMAGING system Gene GENIUS凝膠成像系統(tǒng)，Eppendorf核酸蛋白檢測儀。

1.3 RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

按照Plantol 高效植物總 RNA 提取試劑盒中說明書提取“麗江山荊子”果皮總 RNA。將RNA 溶于RNA溶解液中，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，用紫外-可見光分光光度計通過測定其在 A260和A280處的吸光值，來確定RNA純度及濃度。所檢測的 RNA的A260/A280值應(yīng)為1.8～2.3，A260/A230值一般為1.8～2.2，就可用于接下來的試驗。

RNA純化后[18]，以提取的“麗江山荊子”果皮總 RNA 為模板，使用TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行 cDNA 的合成，所有操作步驟均在冰上進行。

2) cDNA 的合成反應(yīng)程序 42 ℃ 60 min；85 ℃ 30 s，4 ℃停止，所得cDNA產(chǎn)物放于-20 ℃保存。

1.4 MdMYB12基因的克隆

1) 特異引物合成 根據(jù)蘋果基因組數(shù)據(jù)庫中登錄的序列MDP0000210851，設(shè)計基因特異引物，經(jīng)比對分析在該基因起始密碼子(ATG)上游及終止密碼子(TAA)下游 150 bp 內(nèi)設(shè)計 1 對特異引物用于克隆目標基因：

MdMYB12-F：5'-GTGGGTACTCTGAGAGAGAGAGAGA -3'

MdMYB12-R：5'-GCTTAGAAACTTGTATTTAATTAG -3'

以擴增“麗江山荊子”MdMYB12基因編碼序列cDNA全長。

2) PCR反應(yīng)體系及程序 ① PCR 反應(yīng)體系：體系中加入ddH2O 15.26L、dNTP Mix (2.5 mM) 2L、Mg2+(2 mM) 2L、MdMYB12-F(10 mM) 1L、MdMYB12-R(10 mM) 1L、Ex Taq (5U/μL) 0.24L、10× Ex Taq Buffer 2.5L、cDNA 1L (40 ng/L)，總反應(yīng)體積為25L。② PCR擴增程序為95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸4 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，之后對目的片段進行切膠回收。

3) 目的片段的回收及純化 按照AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒說明書操作。①連接與轉(zhuǎn)化：連接反應(yīng)是往PCR管中加入Ligation SolutionⅠ5L、PMD-19T Vector 1L、PCR回收產(chǎn)物4L，反應(yīng)總體積為10L，16 ℃恒溫槽中過夜連接(10～16 h)。轉(zhuǎn)化是先把大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細胞(購于Takala)置于冰上室溫下緩慢解凍，解凍后再加入10L連接產(chǎn)物，輕搖混勻，置于冰上30 min后，42 ℃熱擊90 s，迅速插入冰中，靜置2 min，加入800L不含抗性的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃100～150 r/min搖床培養(yǎng)，時間持續(xù)不少于1 h，從搖床取出菌液后，10 000 r/min離心不超過30 s，使菌液集中于管底，棄600L上清培養(yǎng)液，用剩余培養(yǎng)液(200L)重懸菌液，轉(zhuǎn)移至含有1.2 mL Amp，20L IPTG，40L X-gal的100 mL LB固體平板培養(yǎng)基中，均勻涂布，37 ℃暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～24 h后，會出現(xiàn)菌落，其中白色為含有插入片段菌落，藍色為不含插入片段菌落，挑出白斑菌落，在含有Amp抗性的LB固體培養(yǎng)基中劃線培養(yǎng)12～14 h。②菌落PCR陽性克隆鑒定與檢測：從劃線培養(yǎng)的平板中挑取單克隆，加入到15 mL含Amp抗性的LB液體培養(yǎng)基中，搖床設(shè)置為37 ℃，在100～150 r/min持續(xù)搖晃12～14 h。用搖起的菌液做PCR檢測模板，進行菌液PCR。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，把電泳檢測正確，即含有目的條帶的幾個陽性克隆菌液送往北京三博遠志生物技術(shù)有限公司測序。

1.5 序列分析

用ORF Finder(http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)軟件獲得開放閱讀框；再用DNAMAN軟件對克隆測序序列進行分析，利用在線軟件http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam分別預測目標蛋白的分子量、分子式、等電點、疏水性；分析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能域采用NCBI及SMART工具；預測蛋白質(zhì)的功能位點使用ExPASY的Prosite在線軟件；構(gòu)建氨基酸序列系統(tǒng)進化樹運用MEGA(version 5.0)軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

提取“麗江山荊子”果皮總 RNA并進行DNase 消化處理后的電泳檢測。由圖1可知，28 S和18 S 2條帶清晰可見，并無DNA 污染，用紫外分光光度計測得 A260/A280比值均在 1.8～1.9，并符合兩者亮度比例為2∶1的特點，證明提取的 RNA 質(zhì)量較好，無蛋白等雜質(zhì)污染，可用于后續(xù)試驗。對總RNA進行cDNA反轉(zhuǎn)錄，得到“麗江山荊子”果皮cDNA用于接下來的基因克隆。

1.DL 2 000 2.麗江山荊子

2.2 蘋果MYB12基因的克隆

根據(jù)蘋果基因組MDP0000210851序列，設(shè)計了克隆蘋果MYB12基因特異引物，在對“麗江山荊子”果皮cDNA進行PCR擴增后得到1 042 bp的電泳條帶(圖2)。該條帶大小與預測結(jié)果大小一致，將目標條帶進行切膠回收后，再與PMD-19T Vector連接，然后通過E.coli DH 5α感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化，經(jīng)過藍白斑篩選后，選白斑進行單克隆搖菌，并進行菌液PCR檢測，挑選陽性克隆送往北京三博遠志生物技術(shù)有限公司測序。

2.3 蘋果MDMYB12基因的序列分析

蘋果MYB12基因編碼cDNA擴增產(chǎn)物經(jīng)克隆測序后，經(jīng)DNAMAN軟件分析除載體序列后得到一段長度為1 024 bp的核苷酸序列，再利用ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)在線軟件進行預測，其包含1個長度為 873 bp的完整的開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)，推測編碼 290個氨基酸(圖3)，與基因組預測的氨基酸序列相似性為98%，屬于R2R3類型MYB。MdMYB12與蘋果基因組中參考序列MdP0000210851的序列對比如圖4，5所示。

M.DL 2 000 1.PCR產(chǎn)物

圖3 蘋果MYB12基因cDNA序列及氨基酸序列結(jié)構(gòu)域分析

圖4 MdMYB12與蘋果基因組中MdP0000210851的氨基酸序列對比

圖5 MdMYB12與蘋果基因組中MdP0000210851的序列對比

用http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam在線軟件預測MdMYB12蛋白分子量和等電點，結(jié)果表明，MdMYB12理論分子量為31.895 KD，理論等電點為5.23，負電荷氨基酸殘基(Asp+Glu)一共有42個，正電荷氨基酸殘基(Arg+Lys)共為36個，分子式為C1378H2193N395O451S12，不穩(wěn)定指數(shù)計算結(jié)果為43.04，屬于不穩(wěn)定蛋白，總平均疏水指數(shù)為-0.638，負值則說明該蛋白為親水性蛋白(圖6)。

圖6 蘋果MYB12序列疏水性結(jié)果圖

結(jié)合SignalP 4.0 Server分析顯示無信號肽序列；由TargetP分析顯示，該蛋白定位于細胞核中。分別結(jié)合NCBI及Smart在線軟件對編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域和功能域分析后(圖7)，推測氨基酸序列28～127位點，186～285位點為MdMYB12的保守結(jié)構(gòu)域，28～285為MdMYB12的功能區(qū)。

圖7 蘋果MYB12蛋白功能結(jié)構(gòu)域分析圖

以 MEGA5.0 軟件通過鄰接法(Neighbour-Joining)對擬南芥127個MYB基因家族與所克隆的MdMYB12基因構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，發(fā)育樹的構(gòu)建使用氨基酸序列，這些序列均來源于http://Arabidopsis.org和http://www.ncvi.nlm.nih.gov網(wǎng)站，以Poisson correction 距離法為建樹模型，同時進行1 000次置信度檢驗。由圖8可知，相對于擬南芥中其他MYB基因家族其他基因MdMYB12基因與AtMYB12、AtMYB11以及AtMYB111緣關(guān)系較近，處于同一進化分支上。

圖8 蘋果MYB12序列與擬南芥MYB家族氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹分析

3 討論與結(jié)論

如今人們已在許多物種中克隆、鑒定了調(diào)控類黃酮次生代謝的MYB等轉(zhuǎn)錄因子，這些轉(zhuǎn)錄因子大多是控制花色、種皮顏色等容易觀察的表型性狀，這些轉(zhuǎn)錄因子能夠通過與結(jié)構(gòu)基因啟動子相結(jié)合，之后共同激活類黃酮生物合成途徑中多個基因的表達，從而開始啟動類黃酮的生物合成途徑。在目前已被確定參與調(diào)控黃酮類次生代謝的轉(zhuǎn)錄因子中，研究較為深入的為MYB和MYC (bHLH)2大類轉(zhuǎn)錄因子家族[19]。

含有MYB結(jié)構(gòu)域是MYB 轉(zhuǎn)錄因子家族成員的最大特征，每個 MYB 結(jié)構(gòu)域都由51～52個氨基酸構(gòu)成，其中含有3個保守的規(guī)則間隔的色氨酸殘基[20]。近年來， 多數(shù)針對MYB轉(zhuǎn)錄因子的研究是通過調(diào)節(jié)其基因的表達，來激活類黃酮生物合成途徑中多個結(jié)構(gòu)基因的協(xié)同表達，或?qū)YB從特定植物材料中分離，然后在植物中進行轉(zhuǎn)化過表達，從而使轉(zhuǎn)基因植物中調(diào)控類黃酮合成途徑中的結(jié)構(gòu)基因表達量提高或降低，進而達到改變類黃酮物質(zhì)含量或改變花色的目的[21]。針對蘋果中MYB的研究也主要集中在MdMYB1、MdMYB6和MdMYB10等影響果皮顏色形成的功能研究上[22]，而對于蘋果MdMYB11、MdMYB12和MdMYB111等調(diào)控黃酮醇等類黃酮物質(zhì)合成代謝的MYB轉(zhuǎn)錄因子的研究只在擬南芥等模式植物中有報道[17]，AtMYB12在擬南芥中的轉(zhuǎn)錄主要調(diào)控了黃酮醇的合成代謝，而對花青素的合成無影響。本研究只針對MdMYB12轉(zhuǎn)錄因子序列進行了克隆分析，對于其功能分析還需要進一步轉(zhuǎn)基因進行驗證。

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Cloning and bioinformatics analysis ofMYB12 gene in apple

ZHOU Lan1, PIAO Yongzhen1, PIAO Yu1, ZHANG Liyi2， LIU Bingyan1， LIU Bingyan1

(1.YanbianKoreanAutonomousPrefectureAcademyofAgriculturalSciences,LongjingJilin133400,China; 2.ResearchInstituteofPomology,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,XingchengLiaoning125100,China)

According to the reference sequence published from apple ''Golden Delicious'' genome, one pair of primers was designed, and theMdMYB12 transcription factor from the ''Malus rockii Schneid'' fruit peel was cloned. The length of the target DNA fragment was 1 042 bp, including 837 bp open reading frame encoding 290 amino acids. The phylogenic tree constructed using amino acid sequences of the protein encoded byMdMYB12 gene and 127ArabidopsisMYB gene family revealed thatMdMYB12 gene andArabidopsisMYB genesAtMYB12,AtMYB11 andAtMYB111 were at the same evolutionary branch.

apple；MdMYB12 transcription factor; cloning; bioinformatics analysis

2017-03-10 基金項目：國家自然科學基金項目(31560548)；國家863高技術(shù)研究發(fā)展計劃(2011AA100204)

：周蘭(1982—)，女，吉林延吉人，助理研究員，博士，研究方向為果樹育種。

1004-7999(2017)02-0015-08

10.13478/j.cnki.jasyu.2017.02.003

S661.1

A