劉 芳，王宇紅，邵 樂，夏相宜，佘 顏，蔡光先

(湖南中醫(yī)藥大學1.藥學院、2. 湖南省中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國家重點實驗室培育基地、中藥粉體關鍵技術及裝備國家地方聯(lián)合工程實驗室、3.醫(yī)學院，湖南 長沙 410208)

◇復方藥物藥理學◇

補陽還五湯精簡方對大腦中動脈阻塞模型大鼠海馬組織Cdk5的調控

劉 芳1，王宇紅2，邵 樂2，夏相宜2，佘 顏3，蔡光先2

(湖南中醫(yī)藥大學1.藥學院、2. 湖南省中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國家重點實驗室培育基地、中藥粉體關鍵技術及裝備國家地方聯(lián)合工程實驗室、3.醫(yī)學院，湖南 長沙 410208)

補陽還五湯；補陽還五湯精簡方；大腦中動脈阻塞模型；細胞周期素依賴性蛋白激酶5；腦缺血；海馬組織

補陽還五湯精簡方遵循補陽還五湯之方義[1]，基于益氣祛瘀生新法，秉承“瘀血不去，新血不生”和“不破不立，瘀祛新生”的觀念，以黃芪30 g、川芎9 g、地龍3 g的比例入藥，并采用現(xiàn)代中藥制備工藝提取。課題組前期通過動物實驗確立了補陽還五湯精簡方發(fā)揮抗腦缺血功效的有效劑量[2]，并闡明了其抗腦缺血損傷的部分分子機制[3-4]。然而，腦缺血對海馬組織神經(jīng)元損傷的機制非常復雜，僅通過對幾個蛋白的研究不足以體現(xiàn)中藥多靶點的協(xié)同作用。周期素依賴性蛋白激酶5(cyclin-dependent kinase 5, Cdk5)作為一種主要在神經(jīng)元內表達的脯氨酸限定的絲/蘇氨酸蛋白激酶，在調控神經(jīng)元分化、皮質的形成、神經(jīng)元的遷移和神經(jīng)軸突的生長過程中起著至關重要的作用，具有潛在的調控神經(jīng)元功能[5]。早在1999年，Patrick等[6]研究報道了Cdk5的調節(jié)亞基p35在鈣激活性蛋白酶水解作用下裂解成p25，繼而導致Cdk5長期連續(xù)不可調控性激活，從而加速神經(jīng)元損傷。鑒于Cdk5的異?；罨瘜ι窠?jīng)元的損傷性，本研究動態(tài)研究補陽還五湯精簡方對大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型大鼠海馬組織Cdk5表達的影響，并比較原方及精簡方對Cdk5的調控程度，旨在從分子層面為補陽還五湯精簡方的有效性和合理性提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物與試劑 補陽還五湯干浸膏(黃芪120 g、當歸6 g、赤芍4.5 g、川芎93 g、紅花3 g、桃仁3 g、地龍3 g)和補陽還五湯精簡方干浸膏(黃芪30 g、川芎9 g、地龍6 g)均由湖南中醫(yī)研究院中藥所張水寒教授提供，干浸膏的制備程序參照前期研究[3]。兔抗大鼠Cdk5多克隆抗體(批號：Ab28441)購自Abcam公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(批號：20121011)購自武漢博士德生物技術有限公司；超純RNA提取試劑盒(批號：CW0597)、UltraSYBR Mixture(With high ROX)(批號：CW2329A)、RNaseⅠ(批號：CW2090A)購自北京康為世紀生物科技有限公司；First Strand cDNA Synthesis Kit(批號：K1622)、蛋白預染Marker(批號：SM1811)購自Fermentas公司；RIPA組織細胞快速裂解液(批號：BYL4082)購自上?；鶢栴D生物；兔抗大鼠GAPDH多克隆抗體(批號：5174)購自上海拜力生物科技有限公司。

1.2 實驗動物 SPF級SD大鼠，♂，體質量250～280 g，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物合格證號：SCXK(京)2012-0001。

1.3 儀器 BX51光學顯微鏡、IPP6.0圖像分析系統(tǒng)由日本Olympus公司提供；Finesse 325石蠟切片機由英國Shando公司提供；手握式電動勻漿機由德國FLUKO公司提供；7300 Real-time PCR檢測儀由美國ABI公司提供；電泳儀(mini protean 3 cell)由美國BIO-RAD公司提供。

2 方法

2.1 MCAO動物模型的制備及評價 依據(jù)文獻[7]，采用大腦中動脈線栓法復制局灶性腦缺血大鼠模型。SD大鼠麻醉后，通過手術將魚線插入頸內動脈，插入深度由分叉部計為(17.5±0.5) mm。假手術組僅切開皮膚、分離左側頸總動脈、頸內動脈、頸外動脈后即縫合。術后SPF級飼養(yǎng)，自由飲水、進食。動物于清醒后2 h參照Longa等[8]的5分制法進行神經(jīng)功能評分，分值在1～3分者納入實驗范圍。

2.2 分組及給藥 將SD大鼠分成假手術組和MCAO手術組，再將造模成功后的大鼠隨機分為模型組、補陽還五湯干預組和補陽還五湯精簡方干預組，每組50只，按5個時間點分別于給藥后1、3、7、14、28 d處死，每個時間點10只。藥物干預組于術后2 h給藥，補陽還五湯組按成人等效劑量3.15 g·kg-1·d-1、補陽還五湯精簡方組按前期實驗[2]以2.41 g·kg-1·d-1藥液灌胃，給藥體積均為4.0 mL·kg-1。模型組和假手術組均給予等體積生理鹽水。

2.3 免疫組化法檢測大鼠海馬組織CA1、CA2、CA3及齒狀回區(qū)Cdk5的陽性表達 各組大鼠分別于給藥后各時間點隨機挑出5只，心臟灌注法固定大腦后，取海馬石蠟包埋切片于防脫玻片上。將烘干后的切片逐步脫蠟和水化后進行抗原修復，并用羊血清于37℃溫箱中封閉30 min。取出切片加一抗，空白對照組加PBS，置于濕盒內，于4℃冰箱中孵育過夜，再加入二抗37 ℃溫箱孵育30 min。顯色復染后脫水，封片，晾干，于顯微鏡下觀察。分別拍攝各組大鼠海馬組織CA1區(qū)、CA2區(qū)、CA3區(qū)和齒狀回區(qū)，×400倍視野下觀察Cdk5表達情況，并采用Image pro-plus 6.0軟件對陽性表達細胞(棕色)進行平均光密度統(tǒng)計。

2.4 Western blot檢測海馬組織中Cdk5蛋白的表達 將各組大鼠海馬組織裂解后，取上清進行蛋白質定量，取蛋白樣品25 μg變性后進行SDS-PAGE電泳分離，濕轉至PVDF膜上，封閉后與兔抗大鼠Cdk5多克隆抗體(1 ∶1 000)、兔抗大鼠GAPDH抗體(1 ∶1 500)4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，隨后根據(jù)用量，與HRP標記的二抗(1 ∶1 000)37℃孵育1 h。將膜進行掃描，圖像分析軟件測定目的條帶的積分光密度值(IOD)，以GAPDH為內參照，以目的條帶IOD值與GAPDH條帶IOD值的比值作為該蛋白的相對表達量。

2.5 RT-PCR法檢測海馬組織中Cdk5 mRNA的表達 各組大鼠麻醉后斷頭取腦，迅速分離出海馬，勻漿后采用RNA提取試劑盒提取組織RNA，逆轉錄合成cDNA，然后按反應程序37℃，60 min；85℃，5 min；4℃，5 min用特定Cdk5引物(236 bp，GC 59%，F(xiàn)：5′-ATCCCAGTCCGCTGCTACTC-3′；R：5′-GTCATGGCAGGCCACTGTTC-3′)和GAPDH引物(181 bp，GC 51%，F(xiàn)：5′-GTCGGTGTGAACGGATTTG-3′；R：5′-TCCCATTCTCAGCCTTGAC-3′)進行各目的基因的反轉錄；將制備好的cDNA進行PCR擴增，反應程序為：95℃，10 min(95℃，15 s；60℃，45 s)×40；95℃, 15 s；60℃,1 min；95℃,15 s；60℃, 15 s。RT-PCR數(shù)據(jù)采用ABI Prism 7300 SDS Software分析，結果采用2-ΔΔCt[9]計算目的基因的相對表達量。

3 結果

3.1 補陽還五湯精簡方對MCAO模型大鼠海馬組織不同分區(qū)Cdk5表達的影響 給藥7 d后，各組大鼠海馬組織中Cdk5的表達情況見Fig 1。假手術組中Cdk5的表達較少，其中CA3區(qū)較其他海馬亞區(qū)稍多，圖中可見少量棕色顆粒；模型組大鼠腦缺血后海馬組織星形膠質細胞增多，Cdk5蛋白表達的陽性細胞增加，在海馬組織的4個區(qū)域均有較多表達(Fig 2結果表明與假手術組比較P<0.01)，密集分布，主要集中在胞質表達，胞核僅少量表達，呈棕紅色染，提示腦缺血能激活Cdk5，上調其表達水平；補陽還五湯及其精簡方干預組中，Cdk5 在CA1和CA3區(qū)胞質的表達雖較假手術組增多，但較模型組卻明顯減少。從腦缺血的時間進程上來看(Fig 2)，Cdk5在MCAO模型大鼠海馬組織中CA1、CA2、CA3和齒狀回4個區(qū)的表達在局灶性缺血后3～7 d達到高峰，隨后則出現(xiàn)一定程度的下降趨勢；采用補陽還五湯及其精簡方干預3 d后，Cdk5的表達較同時間模型組比明顯下調(P<0.05)，且隨著給藥天數(shù)的增多，與假手術組的差異逐漸縮小，其中，Cdk5在CA2區(qū)和齒狀回區(qū)的表達在給藥28 d后與假手術組持平；而CA3區(qū)在給藥14 d后，Cdk5即降至假手術組水平，提示補陽還五湯及其精簡方能有效調控局灶性腦缺血模型大鼠海馬組織中Cdk5的表達，且隨著干預時間的延長，其調控效果越明顯。

3.2 補陽還五湯精簡方對MCAO模型大鼠海馬組織Cdk5 mRNA表達的影響 將Cdk5 mRNA在大鼠海馬組織中的表達半定量后分析作圖，結果見Fig 3。Cdk5 mRNA在MCAO模型組大鼠海馬組織中的表達較假手術組比明顯增加，隨后則出現(xiàn)下降趨勢，在造模7 d后達到最高水平，兩組mRNA表達量比較差異具有顯著性(P<0.01)；同時間點藥物干預組與模型組比差異亦有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且藥物干預至28 d后，Cdk5 mRNA的表達量基本降至假手術組水平。結果提示大腦局灶腦缺血損傷將導致Cdk5的異常表達，補陽還五湯精簡方能一定程度降低Cdk5 mRNA在MCAO模型組大鼠海馬組織中的表達水平。

3.3 補陽還五湯精簡方對MCAO模型大鼠海馬組織Cdk5蛋白表達的影響 Western blot結果見Fig 4、5。Cdk5蛋白在模型組中的所有時間點均呈大量表達，電泳條帶寬且色深，與同時間點的假手術組比差異具有顯著性(P<0.01)，其中7～14 d，Cdk5的表達量達到最大值，到28 d，則呈現(xiàn)下降趨勢；補陽還五湯及其精簡方干預后，Cdk5的表達量較模型組明顯下降(P<0.05)，在給藥28 d后，Cdk5的表達水平與假手術組持平，提示補陽還五湯精簡方能一定程度降低MCAO模型大鼠海馬組織中Cdk5蛋白的表達，防止其異?；罨M一步驗證了補陽還五湯精簡方可能通過Cdk5信號通路對腦缺血損傷發(fā)揮功效。

Fig 1 Expression Cdk5 in various areas of rat hippocampus after intragastrical administration 7 days(×400)

A～D: Model, sham, Buyang Huanwu decoction and thin recipe of Buyang Huanwu decoction in CA1; E～H: Model, sham, Buyang Huanwu decoction and thin recipe of Buyang Huanwu decoction in CA2; I～L: Model, sham, Buyang Huanwu decoction and thin recipe of Buyang Huanwu decoction in CA3; M～P: Model, sham, Buyang Huanwu decoction and thin recipe of Buyang Huanwu decoction in dentate gyrus area

Fig 2 Expression of Cdk5 in various areas of rat hippocampus at different time points(±s，n=5)

A: CA1 area; B: CA2 area; C: CA3 area; D: Dentate gyrus area.##P<0.01vssham at same time;*P<0.05vsmodel at same time

Fig 3 Expression of Cdk5 mRNA in rat hippocampus at different time points(±s，n=5)

##P<0.01vssham at same time;*P<0.05vsmodel at same time

Fig 4 Expression of Cdk5 protein in rat hippocampus at different time points

1～4：Sham, model, Buyang Huanwu decoction, thin recipe of Buyang Huanwu decoction(day 1)；5～8：Sham, model, Buyang Huanwu decoction, thin recipe of Buyang Huanwu decoction(day 3)；9～12：Sham, model, Buyang Huanwu decoction, thin recipe of Buyang Huanwu decoction(day 7)；13～16：Sham, model, Buyang Huanwu decoction, thin recipe of Buyang Huanwu decoction(day 14)；17～20：Sham, model, Buyang Huanwu decoction, thin recipe of Buyang Huanwu decoction(day 28)

4 討論

腦缺血后，谷氨酸介導的興奮性毒性使鈣離子流過度積累，從而激活與Cdk5過表達密切相關的鈣蛋白酶，并最終導致海馬神經(jīng)元死亡和認知障礙，提示Cdk5可能是腦缺血后海馬神經(jīng)細胞功能性的修復的關鍵作用位點。最新研究表明[10-11]，采用Cdk5抑制劑能降低局灶性缺血新生大鼠中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)的表達、成年缺血性中風大鼠模型中的細胞凋亡率，證實了Cdk5可以在細胞凋亡信號轉導途徑的上游進行調控。此外，研究[12-13]還表明，隨著腦缺血的加劇，神經(jīng)元死亡的延后導致內源性Cdk抑制劑的逐漸缺失，隨之周期素依賴性激酶D1(cyclin D1)上調，Cdk家族蛋白被激活，最終導致細胞骨架分解，進一步證實了Cdk5功能性缺陷是中風后神經(jīng)元死亡的關鍵因素。本研究從腦缺血時間進程上動態(tài)研究大鼠海馬組織Cdk5的表達情況，結果表明：隨著腦缺血的進程，Cdk5蛋白及mRNA在MCAO模型大鼠海馬組織中的表達呈現(xiàn)出先增加再緩慢降低的趨勢，其表達量大概在缺血后7～14 d達到高峰，提示神經(jīng)元可能存在一定的自我修復能力，但還不足以逆轉神經(jīng)元損傷；模型組Cdk5的表達量與同時間點的假手術組比差異具有顯著性(P<0.01)，且Cdk5在海馬組織表達的定位主要集中在齒狀回，CA1、CA2及CA3區(qū)亦有高表達，提示腦缺血可能激活Cdk5信號通路，與文獻報道一致[14]。結合前期對周期蛋白Cdk4/cyclin D1的研究，提示腦缺后細胞周期蛋白的紊亂可能與神經(jīng)細胞凋亡的上游調控蛋白Cdk5具有一定的相關性，這將是我們后續(xù)深入研究的方向。 秉承對傳統(tǒng)中醫(yī)藥的繼承和創(chuàng)新精神，結合方劑學“整體取性原理”和“君藥不可缺少”的理論，補陽還五湯精簡方選取原方中的黃芪入藥，不僅大補元氣，且能行氣，利營衛(wèi)之氣，通營衛(wèi)之阻滯以活血；輔以川芎行氣活血，氣行則血行，血行則瘀去脈通也，使氣血和順；地龍長于行散走竄，通經(jīng)活絡，為佐藥。三藥合用即為補陽還五湯類方，意即通過“祛瘀”、“化舊”或“去腐”等方法來祛除體內沉積的痰血及其他陳舊性的病理產(chǎn)物。此外，為更好發(fā)揮中藥復方的整體功效，減少傳統(tǒng)湯劑在煎煮過程中一些有效成分的丟失，補陽還五湯精簡方采用現(xiàn)代中藥制備工藝，將超臨界二氧化碳萃取法和醇提、水煎工藝相結合，保證中藥有效成分最大限度的溶出，且課題組前期通過拆方實驗對補陽還五湯類方的配伍和劑量進行了優(yōu)選[15]，最終確定以黃芪、川芎和地龍按10 ∶3 ∶1的比例組方，一定程度驗證補陽還五湯類方的科學合理性。本研究結果表明，腦缺血后不同時間點，補陽還五湯精簡方均能一定程度降低Cdk5的異常表達，采用補陽還五湯及其精簡方干預3 d后，Cdk5的表達較同時間模型組比明顯下調(P<0.05)，且隨著干預時間的延長，Cdk5的表達逐漸接近假手術組，干預28 d時，補陽還五湯精簡方干預組與假手術組比差異無統(tǒng)計學意義，其效果與補陽還五湯原方組相當，從分子層面進一步驗證了補陽還五湯精簡方科學配伍的合理性和有效性。鑒于補陽還五湯精簡方對調控Cdk5蛋白表達水平的有效性，有必要對其作用機制和活性成分進行更深層次研究，以期在此基礎上將其開發(fā)成Cdk抑制劑。

Fig 5 Expression of Cdk5 protein in rat hippocampus at different time points(±s，n=5)

##P<0.01vssham at same time;*P<0.05vsmodel at same time

(致謝：本文所有實驗均完成于湖南省中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國家重點實驗室培育基地，實驗過程中得到該實驗室全體老師的指導及同學的協(xié)助，在此表示感謝！)

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Regulation of thin recipe of Buyang Huanwu decoction on Cdk5 expression of rats after cerebral ischemia

LIU Fang1, WANG Yu-hong2, SHAO Le2, XIA Xiang-yi2, SHE Yan3, CAI Guang-xian2
(1.PharmacySchool, 2.NationalKeyLabCo-builtbyDeptsofHerbalPowderandNewDrugsofHunanProvince,TraditionalChineseMedicinePowderTechnologyandEquipmentofNationalandLocalJointEngineeringLab, 3.MedicalSchool,HunanUniversityofChineseMedicine,Changsha410208,China)

Aim To evaluate the regulation of thin recipe of Buyang Huanwu decoction on cyclin-dependent kinase 5(Cdk5) expressions in hippocampus tissue of rats after cerebral ischemia.Methods Male SD rats were divided into sham-operation group, MCAO group, Buyang Huanwu decoction group(ig. 3.15 g·kg-1) and its thin recipe composition group(ig. 2.41 g·kg-1). Each group was then divided into five subgroups based on the time after administration for 1, 3, 7, 14, 28 d respectively. Cdk5 protein and mRNA levels in each group were examined by using immunohistochemistry, Western blot and real-time PCR respectively.Results The up-regulation of Cdk5 was observed in model rat hippocampus after cerebral ischemia 1 day, and kept increasing with the aggravation of ischemia injury, the peaked expression was observed after 7～14 d, while the downtrend was observed after 28 days compared with the corresponding sham-operation groups(P<0.01), suggesting that the Cdk5 signal pathway would be activated by cerebral ischemic injury. The expression of Cdk5 in thin recipe of Buyang Huanwu decoction group was significantly lower than that in model group at each time point(P<0.05)，and there was also more obvious down-regulation with the extend of intervene time. The regulation effects of thin recipe of Buyang Huanwu decoction was up to the best after 28 days of administration, which indicated the thin recipe was positive to the abnormal expression of Cdk5, and there was no difference between Buyang Huanwu decoction and its thin recipe treated groups(P>0.05).Conclusion The thin recipe of Buyang Huanwu decoction could exert the protective effect by regulating Cdk5 after cerebral ischemia.

Buyang Huanwu decoction; thin recipe of Buyang Huanwu decoction; middle cerebral artery occlusion(MCAO); cyclin-dependent kinase 5(Cdk5); cerebral ischemia; hippocampus

2017-04-16,

2017-05-15

國家重點基礎研究發(fā)展計劃資助項目(No 2012CB723503)；湖南省中醫(yī)藥科研計劃項目(No 2014135); 湖南省十二五中藥學重點學科資助

劉 芳(1980-)，女，博士，講師，研究方向：中醫(yī)藥防治腦缺血，E-mail：fliu0825@126.com； 蔡光先(1951-)，男，碩士，教授，博士生導師，研究方向：中醫(yī)藥防治消化、心腦疾病，通訊作者，E-mail：366620183@qq.com

時間：2017-7-7 11:05 網(wǎng)絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170707.1104.052.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.08.026

A

1001-1978(2017)08-1176-06

R-332；R289.5；R322.81；R345.57；R743.310.22；R977.3摘要：目的 評價補陽還五湯精簡方對大腦中動脈阻塞(MCAO)模型大鼠海馬組織周期素依賴性蛋白激酶5(cyclin-dependent kinase 5,Cdk5)的調控。方法 將♂ SD大鼠隨機分為假手術組、MCAO模型組、補陽還五湯干預組(灌胃3.15 g·kg-1)及補陽還五湯精簡方干預組(灌胃2.41 g·kg-1)，每組按給藥后1、3、7、14、28 d再各分5小組。采用免疫組化法、Western blot法和RT-PCR法考察不同時間點各組大鼠海馬組織中Cdk5的表達。結果 MCAO模型大鼠海馬組織中，腦缺血后1 d即出現(xiàn)Cdk5上調趨勢，并隨著腦缺血的加劇，Cdk5的表達繼續(xù)上調，其中mRNA及蛋白水平在7～14 d達最大，28 d則出現(xiàn)下降趨勢，與各時間點假手術組比較P<0.01，提示腦缺血損傷將激活Cdk5信號轉導途徑；補陽還五湯精簡方干預后的3、7、14、28 d均能明顯降低Cdk5的表達，與各時間點模型組比較P<0.05，且隨著干預時間的延長，下調趨勢越明顯，干預28 d后，Cdk5的表達接近假手術組，提示補陽還五湯精簡方可下調Cdk5的異常表達，與補陽還五湯原方比，兩方對Cdk5的調控差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論 補陽還五湯精簡方可能通過調控Cdk5的表達水平對腦缺血海馬組織發(fā)揮保護作用。